Impact van gouden nanodeeltjes op het testosteronmetabolisme in menselijke levermicrosomen

Resultaten en discussie

Fysicochemische karakterisering van naakte en menselijke plasmaproteïne Corona AuNP

De impact van humaan plasma-eiwit corona (PC) op NP-grootte, oppervlaktelading en morfologie, evenals een spectrale eigenschap, is gekarakteriseerd met behulp van DLS-, TEM- en UV-Vis-spectroscopie (Fig. 1). TEM-afbeeldingen toonden aan dat alle naakte (geen pc) en pc AuNP behalve 40 en 80 nm PC BPEI-AuNP monodispers waren met de stabiele grootteverdeling en unieke UV-Vis-spectrumbereiken (520-557 nm) (Fig. 1a, b) . Verschillende pc's rond AuNP in PBS werden ook gevonden door TEM. Aggregatie van het 40 en 80 nm PC-gecoate vertakte polyethyleenimine (BPEI)-AuNP in PBS bij 0 min bij 25 ° C correleerde meerdere pieken in grootteverdeling en roodverschuivingen van de absorptiespectra ten opzichte van naakt BPEI-AuNP (Fig. 1b). De hydrodynamische diameter (D_H ) waarden van de 40 en 80 nm PC BPEI-AuNP opgelost in PBS bij 0 min bij 25 ° C en in microsomale incubatiebuffer bij 0 en 45 min bij 37 ° C werden niet bepaald door DLS, samen met meerdere pieken in grootteverdeling. De D_H waarden van de 40 nm naakte BPEI- en LA-AuNP en PC PEG-AuNP en de 80 nm naakte BPEI-AuNP in microsomale incubatiebuffer namen aanzienlijk toe tot 45 minuten bij 37 °C, terwijl de waarde ervan afnam voor de 80 nm PC LA -AuNP (tabel 1). De polydispersiteitsindex (PDI) van de 40 nm naakte en PC PEG-AuNP en 80 nm PC PEG-AuNP nam toe na 45 minuten bij 37 ° C. Bovendien namen zeta (z) potentiële waarden van de 40 en 80 nm naakte BPEI-AuNP en 40 nm naakte PEG-AuNP in de loop van de tijd aanzienlijk af. Eerdere studie meldde dat AuNP (7 en 70 nm) geassocieerd met menselijke levermicrosomale eiwitten het karakteristieke absorptiemaximum in het UV-zichtbare bereik veranderde [21]. Deze resultaten werden ondersteund door de recente onderzoeken in ons laboratorium dat PC en humaan serumalbumine-corona de NP-grootte, roodverschuiving van maximale absorptie en morfologie veranderden, ongeacht een oplossend medium en een incubatietijd [6, 7, 10, 26]. Op basis van veranderingen in PC-gemedieerde NP-fysico-chemische eigenschappen en enzymatische functie van CYP-activiteiten [6, 7], werd het potentiële effect van de 40 en 80 nm AuNP op CYP-gemedieerde humane lever microsomale TST-metabolisme onderzocht in aanwezigheid van een meer biologisch relevante pc.

Transmissie-elektronenmicrofoto's van (a ) de 40 en 80 nm naakte AuNP in gedeïoniseerd water en b de 40 en 80 nm PC AuNP in PBS bij 0 uur bij 25 ° C, UV-absorptiespectrum (bovenste inzet), en de dynamische lichtverstrooiing distributie (onderste inzet). Pijlen geven pc-vorming aan. BPEI vertakt polyethyleenimine, LA liponzuur, PEG polyethyleenglycol, ND niet bepaald, PC humaan plasma-eiwit corona, naakt geen pc

AuNP-gemedieerd testosteronmetabolisme in gepoolde menselijke levermicrosomen

In totaal werden 11 metabolieten van TST gescreend en zes metabolieten werden gevonden in gepoolde humane levermicrosomen (pHLM) bij 10 μM TST. De gerichte LC-MS/MS-analyse van TST en de zes geselecteerde metabolieten wordt getoond in Fig. 2. De lijst van de geselecteerde metabolieten omvatte vijf gehydroxyleerde TST-metabolieten (2β-OH TST, 6β-OH TST, 15β-OH TST, 16α -OH TST, 16β-OH TST) en een gedealkyleerde metaboliet (androstenedione, AD). Dit correleert met de eerdere studies met menselijke hepatocyten en HLM dat TST voornamelijk werd gehydroxyleerd in 6β-OH TST en in mindere mate 2β-OH TST, 15β-OH TST, 16α-OH TST en 16β-OH TST, evenals een gedealkyleerde metaboliet, AD [17, 19, 27].

Het geëxtraheerde ionchromatogram (XIC) voor testosteron (TST), ¹³ C3-gelabeld TST, androsteendion, 2β-hydroxytestosteron (2β-OH TST), 16α-hydroxytestosteron (16α-OH TST), 16β-hydroxytestosteron (16β-OH TST), 6β-hydroxytestosteron (6β-OH TST) en 15β -hydroxytestosteron (15β-OH TST) geproduceerd in gepoolde HLM in de eindconcentratie van 10 μM testosteron in aanwezigheid van NADPH gedurende 45 minuten bij 37 °C. HLM menselijke levermicrosomen, NADPH een verlaagd nicotinamide-adenine-dinucleotide-fosfaat

Het resultaat van co-incubatie van TST met de 40 en 80 nm naakte AuNP in pHLM werd getoond in Fig. 3 en 4. Alle naakte AuNP van 40 en 80 nm veranderden de productie van 2'-OH TST, 6'-OH TST en 15'-OH TST in pHLM met variërende mate van remming (Fig. 3a-f). Half maximale remmende concentratie (IC₅₀ ) waarden van de 40 nm BPEI-AuNP voor de productie van 6β-OH TST waren 416 µg ml ⁻¹ ; voor 80 nm BPEI-AuNP 438 μg mL ⁻¹ ; en voor 80 nm PEG-AuNP 387 μg mL ⁻¹ (Fig. 3c, d). Voor 15β-OH TST-productie, IC₅₀ waarden van de BPEI-AuNP van 40 nm waren 1113 μg mL ⁻¹ ; voor 80 nm BPEI-AuNP 415 μg mL ⁻¹ ; en voor 80 nm PEG-AuNP 480 µg ml ⁻¹ (Fig. 3e, f). Deze resultaten werden ondersteund door in vitro studies met menselijke kankercellijnen en leverweefsels dat een metallisch NP, AgNP en poreus silicium NP de productie van 6β-OH TST in menselijk epitheliaal colorectaal adenocarcinoom Caco2-cellen, hepatocellulair carcinoom HepG2-cellen en menselijke levermicrosomen belemmerde [22, 28]. De naakte AuNP van 40 en 80 nm remde de productie van 16α-OH TST en 16β-OH TST niet, behalve de 40 nm BPEI-AuNP die de productie van 16β-OH TST onderdrukte bij de hoogste concentratie (517 μg ml ^{− 1} ) (Fig. 4a-d). De 40 en 80 nm BPEI-AuNP verhoogde de productie van androstenedion (AD) bij de hoogste concentratie met de corresponderende stofwisselingssnelheden van 4,3 en 2,1 pmol mg eiwit ⁻¹ min ⁻¹ , respectievelijk vergeleken met die in de controlegroep (0,7 pmol mg eiwit ⁻¹ min ⁻¹ ) (Fig. 4e, f). Maar de 80 nm LA-AuNP remde de AD-productie met IC₅₀ waarde van 233 μg mL ⁻¹ . Deze resultaten gaven aan dat de naakte AuNP de productie van de geselecteerde TST-metaboliet in de oppervlaktecoating en grootteafhankelijke manieren bemiddelde. Bovendien waren alle 40 en 80 nm PC AuNP niet remmend op de productie van zes geselecteerde metabolieten van TST in pHLM tot 143 μg mL ⁻¹ , ongeacht oppervlaktecoatings (Fig. 5 en 6). Vooral pc verlichtte de 40 nm naakte BPEI-AuNP-gemedieerde remming van 6β-OH TST en 15β-OH TST-productie bij hogere concentraties (32 μg mL ⁻¹ tot 143 μg mL ⁻¹ ) (Fig. 3c, e en 5c, e). Deze resultaten toonden aan dat de naakte BPEI-, LA- en PEG-AuNP van 40 en 80 nm de TST-hydroxylering (2β-OH TST, 6β-OH TST en 15β-OH TST) op een dosisafhankelijke manier verlaagden (Fig. 7 ). Bovendien verhoogde de naakte BPEI-AuNP van 40 en 80 nm de AD-productie, maar de eerste verminderde 16β-OH TST. In vitro-onderzoek meldde dat de productie van 6β-OH TST, voornamelijk gemedieerd door CYP3A4, werd geremd door enkelwandige koolstofnanobuisjes (SWCNT) op een dosisafhankelijke manier, maar de corona van runderserumalbumine verlichtte dit [17, 29]. Ons laboratorium rapporteerde onlangs dat de 40 en 80 nm naakte en PC BPEI-AuNP diende als een remmer voor CYP1A2, 2C9 en 3A4 op cellulair en transcriptioneel niveau [6, 7]. In vivo-onderzoek meldde dat PEG-AuNP (4 en 13 nm) voornamelijk werd geaccumuleerd, voornamelijk in de lever bij mannelijke BALB/c-muizen en veranderde transcriptionele niveaus van hepatische Cyp1a1- en 2b-genen [23]. Mannelijke ICR-muizen met i.v. injectie van PEG-NH₂ -AuNP vertoonde NP-verhoogd plasma TST-niveau zonder de spermamorfologie en vruchtbaarheid [30]. Ander metallisch NP, titaandioxide (TiO₂ ) werd geaccumuleerd in de testis van mannelijke CD1-muizen en verminderde cyp1b1- en 2e1-expressie [31]. Epidemiologisch onderzoek meldde dat volwassen mannen in de onvruchtbaarheidskliniek in Massachusetts lage plasma-TST-spiegels vertoonden, samengebracht met een hoog niveau van 3,5,6-trichloor-2-pyridinol (TCP) afgeleid van hoge blootstelling aan chloorpyrifos (cvs), een bekende hormoonontregelaar en een remmer voor CYP-gemedieerd TST-metabolisme [32]. Eerdere studie meldde dat de bekende hormoonontregelende insecticiden, CVS, CVS-oxon, fonofos, foraat, diethyltoluamide (DEET) en permethrine de productie van de gehydroxyleerde en/of gedealkyleerde TST-metabolieten, dwz 2β-OH, aanzienlijk remden en/of activeerden. TST, 6β-OH TST, 15β-OH TST en AD en 4-hydroxy AD in de menselijke lever [17]. Met dit gezegd, is het redelijk om te veronderstellen dat AuNP een potentiële hormoonontregelaar kan zijn door een remmende en/of activerende potenties tegen CYP-gemedieerd metabolisme van TST te mediëren.

Remmend effect van naakte (geen PC) AuNP op de productie van 2β-OH TST (a , b ), 6β-OH TST (c , d ) en 15β-OH TST (e , v ) in pHLM. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± S.D. (n =3). IC ₅₀ , half maximale remmende concentratie; pHLM , gepoolde menselijke levermicrosomen; ND , niet bepaald door een Hill-vergelijking met variabele helling aan te passen aan de waargenomen gegevens met behulp van GraphPad Prism®; PC , humaan plasma-eiwit; BPEI , vertakt polyethyleenimine; LA , liponzuur; PEG, polyethyleenglycol; Conc, concentratie; 2β-OH TST, 2β -hydroxytestosteron; 6β-OH TST, 6β -hydroxytestosteron; 15β-OH TST, 15β -hydroxytestosteron

Een remmend en stimulerend effect van naakte (geen PC) AuNP op de productie van 16β-OH TST (a , b ), 16β-OH TST (c , d ) en AD (e , v ) in pHLM. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± S.D. (n =3). IC ₅₀ , half maximale remmende concentratie; EG ₅₀ , half maximale activatieconcentratie; pHLM , gepoolde menselijke levermicrosomen; ND , niet bepaald door een Hill-vergelijking met variabele helling aan te passen aan de waargenomen gegevens met behulp van GraphPad Prism®; PC , humaan plasma-eiwit; BPEI , vertakt polyethyleenimine; LA , liponzuur; PEG , polyethyleenglycol; Conc, concentratie; 16α-OH TST, 16α -hydroxytestosteron; 16β-OH TST, 16β -hydroxytestosteron; ADVERTENTIE , androsteendion.

Effecten van PC AuNP op de productie van 2β-OH TST (a , b ), 6β-OH TST (c , d ) en 15β-OH TST (e , v ) in pHLM. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± S.D. (n =3). IC ₅₀ , half maximale remmende concentratie; pHLM , gepoolde menselijke levermicrosomen; ND , niet bepaald door een Hill-vergelijking met variabele helling aan te passen aan de waargenomen gegevens met behulp van GraphPad Prism®; PC , corona van menselijk plasma-eiwit; BPEI , vertakt polyethyleenimine; LA , liponzuur; PEG , polyethyleenglycol; Conc, concentratie; 2β-OH TST, 2β -hydroxytestosteron; 6β-OH TST, 6β -hydroxytestosteron; 15β-OH TST, 15β-hydroxytestosteron.

Effecten van PC AuNP op de productie van 16α-OH TST (a , b ), 16β-OH TST (c , d ) en AD (e , v ) in pHLM. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± S.D. (n =3). IC ₅₀ , half maximale remmende concentratie; pHLM , gepoolde menselijke levermicrosomen; ND , niet bepaald door een Hill-vergelijking met variabele helling aan te passen aan de waargenomen gegevens met behulp van GraphPad Prism®; PC , corona van menselijk plasma-eiwit; BPEI , vertakt polyethyleenimine; LA , liponzuur; PEG , polyethyleenglycol; Conc, concentratie; 16α-OH TST, 16α -hydroxytestosteron; 16β-OH TST, 16β -hydroxytestosteron; ADVERTENTIE , androsteendion.

Voorgesteld schema van het metabolisme van testosteron in gepoolde menselijke levermicrosomen en AuNP-gemedieerde de productie van metabolieten. AuNP gouden nanodeeltjes, BPEI vertakt polyethyleenimine, LA liponzuur, PEG polyethyleenglycol, PC menselijke plasma-eiwit corona. Rode pijl, remmend effect; blauwe pijl, stimulerend effect

TST-metabolisme in menselijke levermicrosomen van een enkele donor en de modulatie ervan door AuNP

De productie van zes geselecteerde metabolieten werd gekarakteriseerd met HLM van één enkele donor geïsoleerd uit donoren met een variërende mate van CYP-activiteit bij de op pHLM gebaseerde niet-remmende concentratie van de 40 en 80 nm naakte en PC AuNP (10 µg ml ⁻¹ ). Er werd een individuele variatie in TST-metabolisme waargenomen tussen drie verschillende HLM met enkele donor (aanvullend bestand 1:figuur S1). De relatie tussen de katalytische activiteit van elk CYP-enzym en de productie van van TST afgeleide metabolieten werd gekarakteriseerd binnen drie verschillende HLM van een enkele donor die een lage, een gemiddelde en een hoge CYP-katalytische activiteit bevatten (aanvullend bestand 1:tabel S1). De productie van 6β-OH TST correleerde positief met de activiteit van CYP2C19 (r =0,99 en p =0,01) en CYP3A4 (r =0,99 en p =0,03) binnen individuen (aanvullend bestand 1:figuur S2). AD-productie correleerde negatief met CYP4A11 (r =− 0,98 en p =0,04) (Extra bestand 1:Afbeelding S3). Deze resultaten waren consistent met een eerdere studie die meldde dat CYP3A4 en CYP2D6 een sleutelrol speelden bij de productie van een belangrijke TST-metaboliet, respectievelijk 6β-OH TST en AD [17]. Deze studie suggereerde ook dat een individuele variatie in CYP-afhankelijk metabolisme van TST afhangt van de genotypen van CYP-enzymen en hun fenotypische activiteiten. Een eerdere studie meldde dat CYP-polymorfismen en -fenotypen de belangrijkste kenmerken zijn in de CYP-functie en resulteren in een categorische farmacogenetische fenotypes als slechte, intermediaire, uitgebreide en ultrasnelle metaboliseerders die bijdragen aan een individuele gevoeligheid voor bijwerkingen van geneesmiddelen en/of werkzaamheid van geneesmiddelen en dosissuggesties dat slechte metaboliseerder van CYP-enzym, dwz CYP3A4, gevoelig kan zijn voor TST-metabolisme door blootstelling aan CYP-remmer AuNP [33].

Zoals getoond in Fig. 8 en 9, co-cubatie van TST met AuNP in een niet-remmende concentratie veroorzaakte een toename en/of afname van het CYP-gemedieerde metabolisme van TST bij enkelvoudige donor-HLM als functie van de grootte en de verandering van het oppervlak. ANOVA gaf aan dat significante veranderingen per AuNP-grootte (p <0,0001), oppervlaktecoatings (p <0,0001), en PC-formatie (p <0,0001) werden waargenomen voor de productie van zes geselecteerde metabolieten van TST in HLM met één donor (HDA1, HDB2 en HDC3).

Effecten van 40 nm naakt en PC AuNP op de productie van 2β-OH TST (A1-A3), 6β-OH TST (B1-B3), 15β-OH TST (C1-C3), 16α-OH TST (D1-D3 ), 16β-OH TST (E1-E3) en AD (F1-F3); in three different single donor HLM (HDA1, HDB2, and HDC3). Means followed by the same letter were not significantly different for each nanoparticle (Tukey’s honest significant difference =5%). Naked no PC, PC human plasma protein corona, HLM human liver microsomes, BPEI vertakt polyethyleenimine, LA liponzuur, PEG polyethylene glycol, 2β -OH TST 2β-hydroxytestosterone, 6β -OH TST 6β-hydroxytestosterone, 15β -OH TST 15β-hydroxytestosterone, 16α -OH TST 16α-hydroxytestosterone, 16β -OH TST 16β-hydroxytestosterone, AD androstenedione

Effects of 80 nm naked and PC AuNP on the production of 2β-OH TST (A1–A3), 6β-OH TST (B1–B3), 15β-OH TST (C1–C3), 16α-OH TST (D1–D3), 16β-OH TST (E1–E3), and AD (F1–F3); in three different single donor HLM (HDA1, HDB2, and HDC3). Means followed by the same letter were not significantly different for each nanoparticle (Tukey’s honest significant difference =5%). Naked no PC, PC human plasma protein corona, HLM human liver microsomes, BPEI vertakt polyethyleenimine, LA liponzuur, PEG polyethylene glycol, 2β -OH TST 2β-hydroxytestosterone, 6β -OH TST 6β-hydroxytestosterone, 15β -OH TST 15β-hydroxytestosterone, 16α -OH TST 16α-hydroxytestosterone, 16β -OH TST 16β-hydroxytestosterone, AD androstenedione

All 40 nm naked and PC AuNP decreased both 2β-OH TST and 6β-OH TST production in HDA1 and HDC3 except for PC PEG-AuNP in the former and naked LC-AuNP in the latter, whereas in HDB2, only PC AuNP potentiated inhibition of their productions, irrespective of surface coatings (Fig. 8(A1–B3)). The 40 nm naked LA-AuNP was an inhibitor for 15β-OH TST production in HDA1; for HDB2 PC PEG-AuNP; and for HDC3 naked BPEI- and PEG-AuNP and PC LA- and PC PEG-AuNP (Fig. 8(C1–C3)). All 40 nm naked AuNP were an activator for 16α-OH TST production in HDA1 but PC attenuated it except for PC BPEI-AuNP which potentiated its inhibition (Fig. 8(D1)). All 40 nm naked and PC AuNP did not influence the production of 16β-OH production within individuals (Fig. 8(E1–E3)). AD production was modulated by the 40 nm naked and PC AuNP with varying degrees of inhibition except for PC PEG-AuNP which served an activator in HDC3 (Fig. 8(F1–F3)).

The 80 nm naked and PC AuNP-mediated inhibition for 2β-OH TST production was observed within individuals except for 80 nm naked and PC PEG-AuNP which served as the activators in HDB2 and HDC3, respectively (Fig. 9(A1–A3)). These results were not consistent with all naked and PC 40 nm AuNP-mediated inhibition for 2β-OH TST, irrespective of surface coatings (Fig. 8(A1–A3)). For 6β-OH TST, the 80 nm naked AuNP were the activators except for LA-AuNP but PC potentiated its inhibition in HDB2 (Fig. 9(B2)), which was similar to the 40 nm naked and PC AuNP-mediated inhibition and/or activation, respectively (Fig. 8(B2)). For 15β-OH TST, 80 nm naked BPEI- and PEG-AuNP and PC PEG-AuNP were the activators in HDB2 and in HDC3, respectively (Fig. 9(C2 and C3)). The 80 nm naked AuNP increased 16α-OH TST production in HDA1, irrespective of surface coatings but PC attenuated it except for PC LA-AuNP which was an inhibitor (Fig. 9(D1)). This is similar to the 40 nm naked and PC AuNP-mediated activation and attenuation for 16α-OH TST production in HDA1 (Fig. 8(D1)). All 80 nm naked and PC were not inhibitory to 16β-OH TST production within all individuals, irrespective of surface coatings (Fig. 9(E1–E3)). These results were consistent with the 40 nm naked and PC-mediated its production within individuals (Fig. 8(E1–E3)). For AD production, the 80 nm naked BPEI- and PEG-AuNP were the inhibitors but PC attenuated and vice versa with naked and PC LA-AuNP in HDA1 (Fig. 9(F1)). The 80 nm naked and PC AuNP decreased its production in HDC3 except for PC PEG-AuNP, which was an activator (Fig. 9(F3)). This study strongly suggests that AuNP interaction with CYP enzymes in HLM cause a decrease and/or increase in TST conversion to hydroxylated and dealkylated metabolites within individuals and the presence of PC played the inhibitive or protective role. In vivo study reported that the male CD-1 mice orally administrated with ketoconazole, a noncompetitive CYP3A4 inhibitor showed that a decrease in serum TST level, gonadal TST secretion, and hepatic TST hydroxylation activity that included 6β-OH TST, 15α-OH TST, 15β-OH TST, and 16β-OH TST [34]. In vitro studies with human hepatocyte, C3A cell line, HepG2 cell line, HLM, and recombinant CYP enzymes suggested that AuNP modulated the activity of various CYP enzymes that included CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, and 3A4 [6, 7, 20, 21]. PC and human serum albumin corona mitigated an inhibitory effect of BPEI- and LA-AuNP on CYP1A2, 2C9, and 3A4 enzyme activity in human hepatocytes and C3A cell line [6, 7]. That being said, it may be rational to propose that AuNP interference with CYP enzymes relates individual susceptibility to unexpected toxicological effects that may result in an altered circulating TST level tied to endocrine disrupting substance and/or drug-drug interaction sharing the same CYP enzymes [35].