Piperlongumine-eluerende gastro-intestinale stent met behulp van reactieve zuurstofspecies-gevoelige nanovezelmatten voor remming van cholangiocarcinoomcellen

Materialen en methoden

Materialen

PL is gekocht bij LKT Labs. Co., (Minnesota, VS). Poly(L-lactide) (PLA, PLA-0005, M.W. = 5000 g/mol uit de gegevens van de fabrikant) werd gekocht bij Wako Pure Chem. Co. Ltd. (Osaka, Japan). Methoxypoly(ethyleenlycol)-succinimidylglutaraat (MePEG-NHS, M.W.a =-5000 ug/mol) werd gekocht bij Sunbio Co. Ltd. (Seoul, Korea). Met siliciummembraan bedekte stent voor galwegen werd verkregen van M.I. techniek. (Pyeongtaek, Korea). Poly(ε-caprolacton) (PCL, aantalgemiddelde MW = 80.000 g/mol), N-hydroxysuccinimide (NHS), N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidehydrochloride (EDAC), tetrahydrofuran (THF), chloroform , dimethylsulfoxide (DMSO), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) en selenocystaminedihydrochloride werden gekocht bij Sigma-Aldrich Chemical Co., (St. Louis, MO , VS). Het dialysemembraan of dialyse-apparaat (M.W. cutoff size (MWCO) 1000 g/mol en 8000  g/mol) werd gekocht bij Spectrum/Por Lab., Inc. (CA, VS). Alle organische oplosmiddelen en andere chemicaliën werden gebruikt als extra zuivere kwaliteit. Celkweekbenodigdheden zoals RPMI1640-media en foetaal runderserum (FBS) werden gekocht bij Life Tech. Inc. (Grand Island, NY, VS). Alle gebruikte reagens en organische oplosmiddelen waren van HPLC-kwaliteit.

Synthese van LEse-blokcopolymeer

MePEG-selenocystamine-conjugaten

MePEG-NHS (500 mg) werd opgelost in 20 mL DMSO. Meer dan vijf equivalenten selenocystamine werden afzonderlijk opgelost in 15 mL gedeïoniseerd water en gemengd met 5  mL DMSO. Daarna werd de selenocystamine-oplossing langzaam in de MePEG-NHS-oplossing gedruppeld en vervolgens gedurende 24 uur magnetisch geroerd. Hierna werden reactanten in een dialysebuis (MWCO 1000 g/mol) gebracht en vervolgens gedurende 2  dagen tegen veel water gedialyseerd. De gedialyseerde oplossing werd gedurende 2 dagen gevriesdroogd. Gevriesdroogde vaste stof werd gebruikt om blokcopolymeer te synthetiseren.

Blokcopolymeersynthese

PLA (500 mg) werd opgelost in 20  mL DMSO met een equivalente hoeveelheid EDAC en NHS. Deze oplossing werd gedurende 12 u magnetisch geroerd. Aan deze oplossing werd mPEG-selenocystamine vaste stof (530 mg) toegevoegd en 2  dagen verder geroerd. Hierna werden reactanten in een dialysebuis gebracht (MWCO:8000 g/mol) en vervolgens gedurende 2  dagen tegen veel water gedialyseerd. De gedialyseerde oplossing werd gedurende 2 dagen gevriesdroogd. Gevriesdroogde producten werden geprecipiteerd in methanol om niet-gereageerde mPEG-selenocystamine nogmaals te verwijderen. De uiteindelijke opbrengst was hoger dan 94%. Opbrengst = [(gewicht van gevriesdroogde vaste stof)/(gewicht van PLA + gewicht van mPEG-selenocystamine)] × 100.

Karakterisatie van polymeren

Om de polymeersynthese te volgen, ¹ H-nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie werd gebruikt. Polymeren werden opgelost in DMSO-d-vorm en gemeten met ¹ H-NMR-spectroscopie (500 MHz supergeleidende FT-NMR-spectrometer, UnityInova 500, Varian Inc. Agilent Tech., CA, VS).

Het molecuulgewicht van polymeren werd gemeten met gelpermeatiechromatografie (GPC, Waters GPC-systeem, MA 01757, VS):Waters 1515 HPLC-oplosmiddelpomp, een Waters 2414 brekingsindexdetector en drie Waters Styragel-kolommen met hoge resolutie (HR4, HR2, HR1 ). Polymeren werden opgelost in THF van extra zuivere kwaliteit met 0,1 N LiBr als eluens (stroomsnelheid 1,0 mL/min). Polystyrenen werden gebruikt om een ​​kalibratiecurve te maken.

PL-geladen nanovezelmatten en gecoat op de GI-stent

PL-geladen nanovezelmatten

Vorinostat (100 mg) werd opgelost in 10  mL acetonoplossing. Aan deze oplossing werden vervolgens LEse (100 - 400 mg) en PCL (600 - 900 mg) toegevoegd en gedurende 2 uur magnetisch geroerd. Deze oplossing werd gebruikt om nanovezelmatten te fabriceren en om op de met siliconenmembraan bedekte stent te coaten met behulp van een elektrospinmachine (EBS ES-Biocoater; Nano NC, Seoul, Zuid-Korea). Electrospinning-machine bestaat uit een hoogspanningsvoeding, een spuitpomp, een X-Y-robotsysteem en een drum-roll-collector. De polymeer/geneesmiddeloplossing in een injectiespuit (NanoNC, 24G) werd op de met siliconenmembraan bedekte metalen stent (diameter 1 cm, lengte 10 cm, rolsnelheid 500 rpm, sproeisnelheid 100 μL/minuut, spanning 15 kV) gesproeid. op de rollende collector geplaatst. Met PL geladen nanovezelmembraan werd op de stent gecoat. Om het resterende oplosmiddel te verwijderen, werd met PL beladen met nanovezel beklede stent gedurende 24 uur in een vacuümdroogoven gedroogd. Met PL geladen nanovezel-gecoate stents werden bewaard bij 4°C tot de volgende studie.

PL-geladen nanovezelmatten werden zorgvuldig gescheiden van de stent voor medicijnafgifte en dierstudie. Leeg nanovezelmembraan werd bereid in afwezigheid van PL met een vergelijkbare procedure.

De inhoud van het geneesmiddel werd als volgt gemeten:5 mg PL-geïntegreerde nanovezelmatten werden gedurende 2 uur opgelost in DMSO. UV-spectrofotometer (UV-1601, Shimadzu Co. Ltd. Osaka, Japan) werd gebruikt om de geneesmiddelconcentratie te meten bij 325 nm. Lege nanovezelmatten werden ook opgelost in DMSO en gebruikt voor een blanco test.

Onderzoek naar geneesmiddelafgifte werd in vitro uitgevoerd met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 0,01 M, pH 7,4). Nanovezelmatten werden in schijven gesneden en 10 mg schijven werd ondergedompeld in 40 mL PBS (0,01 M, pH 7.4) in een conische buis van 50 mL. Dit werd in een schudincubator geplaatst bij 100 tpm (37 ° C). Hele media werden genomen om de concentratie van vrijgekomen PL uit nanovezelmatten met specifieke tijdsintervallen te meten. De PL-concentratie in de media werd gemeten met een UV-spectrofotometer (325 nm). Lege nanovezelmatten werden ook gebruikt om als blanco test te gebruiken. In het afgifteonderzoek werd waterstofperoxide toegevoegd aan de afgiftemedia om het ROS-effect op de afgiftesnelheid van het geneesmiddel te onderzoeken.

Morfologie

Morfologie van nanovezelmatten werd waargenomen met een veldemissie scanning elektronenmicroscoop (S-4800; Hitachi, Tokyo, Japan) bij 25 kV.

Celcultuur

Menselijke CCA-cellijnen zoals SNU478, SNU245 en SNU 1196 CCA-cellijnen werden verkregen van de Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). HuCC-T1 humane CCA-cellijn werd verkregen van de Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japan). Alle cellen werden gekweekt in RPMI1640 aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd FBS en 1% penicilline/streptomycine bij 37°C in een 5% CO₂ broedmachine.

Antikankeractiviteitsonderzoek

Verschillende CCA-cellen (1 × 10 ⁴ ) gezaaid in platen met 96 putjes werden gebruikt om de antikankeractiviteit van PL zelf, in PL opgenomen nanovezelmatten of PL vrijgemaakt uit nanovezelmatten te evalueren. Cellen werden overnacht in een 5% CO₂ broedstoof bij 37°C. Voor PL-behandeling werd PL opgelost in DMSO (10  mg PL / ml DMSO) verdund met RPMI1640-media. De eindconcentratie van DMSO was lager dan 0,5%. Voor de behandeling van PL die vrijkomt uit nanovezelmatten, werden in PL opgenomen nanovezelmatten ondergedompeld in 40 mL PBS in een conische buis van 50 mL. Op dag 5 en dag 15 werd de PL-concentratie gemeten met een UV-spectrofotometer zoals hierboven beschreven en gebruikt om cellen te behandelen. Lege nanovezel werd ter vergelijking ook aangepast aan het afgifte-experiment. Cellen werden gedurende 2  dagen blootgesteld aan PL zelf of PL vrijgegeven uit nanovezelmatten. De levensvatbaarheid van CCA-cellen werd geëvalueerd met MTT-proliferatietest. Dertig microliter MTT-oplossing (5 mg / ml PBS, pH 7,4) werd aan de putjes toegevoegd en vervolgens werden de cellen 4 uur geïncubeerd in een 5% CO₂ broedstoof bij 37°C. Het medium werd weggegooid en 100  μl DMSO toegevoegd. De levensvatbaarheid van de cellen werd geanalyseerd met een microplaatlezer bij 570 nm (Infinite M200 Pro microplaatlezer, Tecan, Mannedorf, Zwitserland). De levensvatbaarheid van de cellen werd uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie van acht putjes.

ROS-meting

ROS-generatie in CCA-cellen werd getest met de DCFH-DA-methode. CCA-cellen (1 × 10 ⁴ cellen) gezaaid in een plaat met 96 putjes werden behandeld met verschillende concentraties van PL zelf of PL vrijgemaakt uit nanovezelmatten in fenolroodvrije RPMI-media met DCFH-DA (eindconcentratie 20 M). Zes uur of 12 uur later werden de cellen tweemaal gewassen met PBS en vervangen door 100  μL vers fenolroodvrij RPMI-medium. ROS-inhoud in cellen werd geanalyseerd door veranderingen in fluorescentie-intensiteit met behulp van de Infinite M200 pro-microplaatlezer (excitatiegolflengte 485 nm, emissiegolflengte 535 nm).

Western Blotting

Western blotting van CCA-cellen werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [31]. Cellen werden gedurende 24 h blootgesteld aan PL zelf of PL vrijgegeven uit nanovezelmatten. Daarna werden cellen geoogst door trypsinisatie, gewassen met koude PBS en verzameld door centrifugeren. Pellets werden gelyseerd in lysisbuffer met 50 mM Tris, 150  mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% deoxycholzuur, 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS) met fenylmethylsulfonylfluoride en een proteaseremmercocktail (Roche Diagnostics, Basel, Zwitserland ). Deze oplossing werd 30 min gecentrifugeerd bij 4 °C (14.000×g ); de cellysaten (supernatant) werden vervolgens gebruikt om de eiwitconcentratie te meten met behulp van de BCA Protein Assay-kit (Pierce, Rockford, IL, VS). Eiwit (50  μg) werd geladen in SDS-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE), overgebracht naar een polyvinyldifluoride (PVDF) membraan, geblokkeerd met 5% magere melk in TBS-T, onderzocht met een geschikt primair antilichaam en vervolgens behandeld met een secundair HRP-geconjugeerd antilichaam gedurende 1 h. De immunoblots werden gedetecteerd door chemiluminescentie en vervolgens gekwantificeerd met digitale analyses met behulp van het ImageJ-softwareprogramma.

In vivo onderzoek met behulp van tumor xenograft-model

HuCC-T1-dragende muizen (BALB / c naaktmuis, 5 weken oud, mannelijk, 18-23 g in gewicht; Orient, Seongnam, Zuid-Korea) werden gebruikt om in vivo antitumoractiviteit van in PL opgenomen nanovezelstent te evalueren. 1 × 10 ⁶ HuCC-T1-cellen in 100  μL PBS werden subcutaan (sc) toegediend aan de ruggen van naakte muizen. Schijven met in PL opgenomen nanovezel en lege nanovezel werden geïmplanteerd onder de solide tumor toen de solide tumor een diameter van ongeveer 4 ~ 5  mm kreeg. De dosis PL was 10 mg PL/kg. Ter vergelijking werd PL opgelost in Cremophor EL®/ethanol mengseloplossing (0,5% v /v Cremophor EL® en 0,5% v /v ethanol in PBS (pH 7,4, 0,01 M)). Controlegroepen werden subcutaan geïnjecteerd met PBS naast het tumorweefsel. Voor in PL opgenomen nanovezel en lege nanovezelgroep werden nanovezelschijven als volgt bereid; nanovezelwafels met hetzelfde gewicht werden in ronde schijven gesneden en vervolgens werd de achterkant van de huid van de muis zorgvuldig uitgesneden (0,5 cm lang). Hierna werden nanovezelwafels zorgvuldig geïmplanteerd onder het vaste tumorweefsel. Om een ​​gelijke conditie te krijgen, hebben muizen met controlebehandeling en PL-injectie ook de huid naast de tumor weggesneden (0,5 cm lang). Elke groep bestond uit vijf muizen. Het tumorvolume werd gemeten met tussenpozen van 5  dagen en de eerste dag van de implantatie van nanovezels werd ingesteld als dag 0. Het tumorvolume werd berekend met de volgende vergelijking:V = (een × [b ] ² )/2. een :grootste diameter; b :kleinste diameter.

Alle dierstudies werden zorgvuldig uitgevoerd onder de richtlijnen van het Pusan ​​National University Institutional Animal Care and Use Committee (PNUIACUC). Het dierprotocol dat in deze studie wordt gebruikt, is strikt beoordeeld door de PNUIACUC op hun ethische procedures en wetenschappelijke zorg, en het is goedgekeurd (goedkeuringsnummer:PNU-2017-1608).

Immunohistochemie

Tumorweefsels werden 30 dagen later geïsoleerd. Vervolgens werden tumorweefsels gefixeerd in 4% formaldehyde, ingebed in paraffine en gesneden voor hematoxyline- en eosine (H &E) kleuring. Immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd met apoptose-gerelateerde eiwitten zoals caspase-3- en caspase-9-antilichamen. Antilichamen werden gebruikt in een verdunning van 1:100 of 1:200 en vervolgens werd kleuring uitgevoerd met behulp van een Envision-kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, VS) volgens het protocol van de fabrikant.

Statistische analyse

Statistische analyses van de gegevens van behandelde en onbehandelde cellen werden uitgevoerd met behulp van de Student's t test. Een p waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Karakterisatie van polymeren

Om PL-eluerende GI-stent te fabriceren, werd LEse-blokcopolymeer gesynthetiseerd zoals weergegeven in Fig. 1. MePEG-NHS werd gereageerd met selenocystamine en vervolgens werd de terminale aminegroep geconjugeerd met de carboxyl-eindgroep van PLA. Niet-gereageerd selenocystamine uit MePEG-selenocystamine-conjugaten werd verwijderd door middel van een dialyseprocedure. Verder werden niet-gereageerde MePEG-selenocystamine-conjugaten van gesynthetiseerd blokcopolymeer ook verwijderd door dialyseprocedure en precipitatie in methanol. Specifieke pieken van selenocystamine werden bevestigd bij respectievelijk 1,7 ppm en 2,9 ppm, terwijl de specifieke piek van MePEG ook werd bevestigd bij 3,5~3,7 ppm. Toen PLA werd geconjugeerd, werd de methylgroep van PLA bevestigd bij 1,4 ppm. PCL-homopolymeer en LEse-blokcopolymeermengsel werden gemengd om nanovezelmatten te vervaardigen. M.W. en samenstelling van LEse-blokcopolymeer en PCL-homopolymeer werden gemeten met ¹ H-NMR-spectroscopie en GPC. De resultaten van de M.W.-schatting zijn weergegeven in Tabel 1. Zoals weergegeven in Tabel 1, werd het M.W. van LEse-blokcopolymeer geschat op basis van het M.W. van PEG met behulp van ¹ H-NMR-spectroscopie als 9760 g/mol. GPC-meting toonde aan dat LEse-blokcopolymeer respectievelijk 8210 g/mol Mn, 9530  g/mol Mw en 1,16 heeft.

Syntheseschema van LEse-blokcopolymeer

Karakterisatie van met piperlongumine opgenomen GI-stent met nanovezelcoating

Zoals weergegeven in figuur 2 en tabel 2, werden verschillende verhoudingen van PCL en LEse-blokcopolymeer gebruikt om nanovezel te fabriceren en om op GI-stent te coaten. PCL-homopolymeer resulteerde in fijne en dunne nanovezelmatten met een geminimaliseerde geaggregeerde vorm. Toen LEse-blokcopolymeer werd toegevoegd, werd een deel van de geaggregeerde vorm, zoals korrels en deeltjes, waargenomen zoals weergegeven in figuur 2. Bij een hogere LEse-verhouding (75/25 en 60/40) vertoonden nanovezelmatten een dikkere en onregelmatige vorm van vezelig structuur. Wanneer de polymeren bestonden uit een verhouding van meer dan 50% LEse in hun inhoud, waren de polymeren significant geaggregeerd en vertoonden de matten ernstige onregelmatigheden (gegevens niet getoond). Nanovezelstructuur werd nauwelijks verkregen uit LEse-blokcopolymeer alleen. Daarom kan een nanovezelstructuur worden bereikt door te mengen met PCL-homopolymeer. De geneesmiddelinhoud in geprepareerde PL-opgenomen nanovezelmatten was bijna gelijk aan de theoretische waarde zoals weergegeven in Tabel 2. Deze resultaten gaven aan dat PL-opgenomen nanovezelmatten met succes werden vervaardigd uit PCL-homopolymeer- en LEse-blokcopolymeermengsels en vervolgens gecoat op GI-stent.

een PL-geïntegreerde met nanovezels bedekte GI-stent. b FE-SEM-foto van in PL verwerkte nanovezel

Fig. 3 toont de kinetiek van medicijnafgifte van nanovezelmatten. Zoals getoond in Fig. 3a, werd PL gedurende 25 dagen continu vrijgemaakt uit nanovezelmatten. Burst-afgifte van PL uit nanovezelmatten werd waargenomen tot 4  dagen, en daarna werd PL continu vrijgegeven uit nanovezelmatten tot dag 25. Hogere gehaltes aan LEse-blokcopolymeer in nanovezelmatten resulteerden in een snellere afgifte van PL uit nanovezelmatten. Aangezien LEse-blokcopolymeer minder hydrofoob is dan PCL-homopolymeer, moeten PCL/LEse-nanovezelmatten met een hoger gehalte aan LEse-blokcopolymeer meer opzwellen dan die van PCL-homopolymeer. Vervolgens resulteerden nanovezelmatten met een hoger gehalte aan LEse-blokcopolymeer in een snellere geneesmiddelafgifte. Bovendien kan de PL-afgiftesnelheid worden versneld in aanwezigheid van ROS, aangezien diselenidebinding in LEse-blokcopolymeer kan worden gedesintegreerd door ROS zoals H₂ O₂ en vervolgens induceren deze factoren redox-responsieve desintegratie van nanovezelmatten (figuur 3c ~ e). Nanovezelmatten van PCL-homopolymeer reageerden niet significant op de toevoeging van H₂ O₂ , d.w.z. PCL wordt niet grotendeels beïnvloed door H₂ O₂ toevoeging; aan de andere kant, toen LEse-blokcopolymeer werd gemengd, werd de PL-afgifte uit nanovezelmatten aanzienlijk versneld als H₂ O₂ was toegevoegd . In het bijzonder induceerde een hogere LEse-blokcopolymeerverhouding in de nanovezelmatten een snellere kinetiek van geneesmiddelafgifte, zoals weergegeven in Fig. 3c, d en e. Deze resultaten gaven aan dat PL-geïntegreerde nanovezelmatten een redox-responsief geneesmiddelafgiftepotentieel hebben in de biologische omgeving. PL-geïntegreerde nanovezelmatten bereid met PCL/LEse-blokcopolymeer (60/40) werden gebruikt na in vitro celcultuur en in vivo dierstudie.

een PL-afgifte uit nanovezels met verschillende samenstellingen. De gewichtsverhouding PCL/Lese was respectievelijk 100/0, 90/10, 75/25 en 60/40. b Het effect van waterstofperoxide op de PL-afgifte van nanovezelmatten (PCL/Lese-gewichtsverhouding was 100/0). c Het effect van waterstofperoxide op de PL-afgifte van nanovezelmatten (PCL/Lese-gewichtsverhouding was 90/10). d Het effect van waterstofperoxide op de PL-afgifte van nanovezelmatten (PCL/Lese-gewichtsverhouding was 75/25). e Het effect van waterstofperoxide op de PL-afgifte van nanovezelmatten (PCL/Lese-gewichtsverhouding was 60/40)

In vitro antikankeractiviteit

Antikankereigenschappen van met PL opgenomen nanovezelmat-gecoate stents werden beoordeeld met verschillende CCA-cellen. Ter vergelijking:PL dat vrijkwam uit nanovezelmatten, werd op dag 5 en dag 15 tijdens het afgifte-experiment geëxtraheerd en vergeleken met intact PL. Zoals getoond in Fig. 4, veranderde de antikankeractiviteit op vrijgegeven PL vanaf dag 5 en dag 15 niet significant in vergelijking met PL zelf bij alle HuCC-T1-cellen (Fig. 4a), SNU1196-cellen (Fig. 4b), SNU478-cellen ( Fig. 4c) en SNU245-cellen (Fig. 4d). Ze hebben een bijna vergelijkbaar remmingspotentieel in cellevensvatbaarheid, hoewel PL zelf resulteerde in een hogere antikankeractiviteit bij een concentratie van meer dan 10  μg/ml. Tabel 3 toont de IC₅₀ waarde van PL zelf en vrijgekomen PL uit nanovezelmatten. Evenals PL zelf, behield het vrijgekomen PL vanaf dag 5 en dag 15 de antikankeractiviteit tot 15 dagen van het medicijnafgifte-experiment en vertoonde een redelijke IC₅₀ waarde bij alle CCA-cellijnen, hoewel die waarden vanaf dag 5 en dag 15 bij PL geleidelijk werden verhoogd in vergelijking met PL zelf. Vrijgegeven PL vanaf dag 4 en dag 15 in aanwezigheid van H₂ O₂ handhaafde ook antikankeractiviteit evenals PL zelf. Deze resultaten gaven aan dat de antikankeractiviteit van PL gehandhaafd bleef tijdens het fabricageproces van nanovezels en de afgifteperiode van geneesmiddelen in de biologische omgeving. Bovendien produceerde vrijgekomen PL uit nanovezelmatten ROS-generatiecapaciteit tot 15 dagen na de afgifteperiode van het geneesmiddel, vergelijkbaar met PL zelf (Fig. 5). Zoals getoond in Fig. 5a en b, produceerde PL zelf significant meer ROS met een hogere snelheid dan 5  μg / ml. Vrijgegeven PL vanaf dag 5 en dag 15 produceerde ook ROS, hoewel de ROS-productie vanaf dag 15 enigszins was verlaagd door vrijgekomen PL, wat aangeeft dat in PL opgenomen nanovezelmatten de intrinsieke antikankereigenschap van PL behielden tijdens de afgifteperiode van het geneesmiddel.

Het effect van PL en vrijgekomen PL uit nanovezelmatten op de levensvatbaarheid van verschillende CCA-cellen. een HuCC-T1, b SNU1196, c SNU478 en d SNU245 cholangiocarcinoomcellen. 2 × 10 ⁴ cellen in platen met 96 putjes werden gedurende 2 dagen aan PL blootgesteld of PL uit nanovezels vrijgemaakt. Voor de behandeling van vrijgekomen PL werden in PL opgenomen nanovezelschijven ondergedompeld in PBS en vervolgens werd een vrijgave-experiment uitgevoerd gedurende 5 en 15 dagen met of zonder 10  mM H₂ O₂ . Het medium werd uitgewisseld tot 3 dagen als vergelijkbaar met onderzoek naar geneesmiddelafgifte. Daarna werd het medium geoogst tussen 5 en 15 dagen na afgifte-experiment. Deze oplossing werd gebruikt om de vergelijking van antikankeractiviteit van PL zelf en vrijgegeven PL te onderzoeken

Het effect van PL en vrijgekomen PL van nanovezelmatten op de ROS-generatie van HuCC-T1-cellen (a ) en SNU245-cellen (b ). PL zelf en vrijgegeven PL werden behandeld zoals beschreven in Fig. 3

Figuur 6 toonde de expressie van apoptose-eiwit in HuCC-T1 CCA-cellen. Vrijgegeven PL (5 dagen) heeft een vergelijkbare activiteit in de inductie van apoptose van HuCC-T1-cellen vergeleken met PL zelf, dwz de expressie van BAX, caspase-3, 7 en 9, en gesplitste PARP-splitsing werd geleidelijk verhoogd door behandeling van vrijgegeven PL (5  dagen) evenals PL zelf. Deze resultaten gaven ook aan dat vrijgekomen PL een redelijke antikankeractiviteit heeft tegen CCA-cellen en ook tegen PL zelf.

Western-blot-analyse van apoptose van HuCC-T1-cellen. Cellen werden gedurende 1 dag met PL zelf behandeld of PL uit nanovezels vrijgegeven en vervolgens Western-blot-analyse uitgevoerd

In vivo antikankeractiviteit tegen HuCC-T1 tumor xenograftmodel

HuCC-T1-dragende naakte muizen werden bereid om in vivo antikankeractiviteit van met PL opgenomen nanovezel-gecoate stent te beoordelen, zoals getoond in Fig. 7 and 8. As shown in Fig. 7, the volume of HuCC-T1 tumor was gradually increased over 1 month. Growth of tumor volume in the treatment of empty nanofiber was almost similar with control treatment. PL injection properly inhibited tumor growth, compared to control treatment or empty nanofiber treatment. Especially, tumor growth was significantly inhibited by the treatment of PL-incorporated nanofiber, i.e., tumor mass in the treatment of PL-incorporated nanofiber was one third of control treatment. These results indicate that PL-incorporated nanofiber mats have superior potential in inhibition of tumor growth of CCA cells. Furthermore, the expression of caspase-3 and 9 was also increased in tumor tissues as shown in Fig. 8, indicating that released PL from nanofiber mats properly inhibited the growth of the tumor and induced apoptosis of tumor cells. Also, PL-incorporated nanofiber-coated stent has potential to inhibit CCA cells in vitro and in vivo.

The effect of PL solution, empty nanofiber mats or PL-incorporated nanofiber mats on the growth of HuCC-T1 tumor (a ) and the body weight changes (b ). HuCC-T1 (1 × 10 ⁶ cells) cells were implanted to the back of mice. PL dose was adjusted to 10 mg/kg. One hundred microliters of PBS or PL solution was s.c. injected beside the tumor tissue for control treatment and PL solution treatment, respectively. For empty nanofiber and vorinostat nanofiber implantation, wafers of the same weight were cut and then implanted under the tumor tissue. *p < 0,001; **p  < 0.01

Immunohistochemical staining (× 400) of HuCC-T1 tumor tissues. Each tumor tissues were stained with BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP-1

Discussion

Abnormal accumulation of ROS in tumor epithelial cells induces carcinogenesis and affects surrounding cells or tissues which constitute tumor microenvironment [39]. Then, abnormal tumor microenvironment is the key player in proliferation, migration, angiogenesis, and metastasis of cancer cells [39,40,41]. An elevated level of ROS in tumor microenvironment induces oxidative stress and causes DNA damage [39]. Also, ROS is also correlated with cholangiocellular proliferation and oncogenic transformation [42]. Paradoxically, increased accumulation of intracellular ROS over toxic level induces apoptosis of cancer cells and tumor suppression [39,40,41,42]. For example, Thanee et al. reported that sulfasalazine as a cystine-glutamate transporter-target drug increased intracellular ROS level and then induced cell death [43]. They also argued that therapeutic efficacy of anticancer drug can be improved by blocking the mechanism of the cell’s ROS defensive system. Also, many research groups investigated ROS-producing small molecules such as melatonin, luteolin, chloroqine, and PL to suppress CCA growth rate by increasing intracellular ROS [44,45,46,47]. Thongsom et al. reported that PL stimulates ROS accumulation in CCA cells and induces cell death by activation of caspase-3 and PARP [47]. We also observed that PL increases the accumulation of intracellular ROS in various CCA cells as shown in Fig. 5. Increased ROS level induced apoptosis signals such as BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP (Fig. 6). The ROS-producing capability of piperlongumine was slightly decreased on day 5 and 15 as shown in Fig. 5. These results might be due to that piperlongumine is unstable in physiological solution, and then ROS-producing capability might have been slightly decreased. Additionally, physicochemical properties of piperlongumine may be affected during the fabrication process of the nanofiber. However, our results showed that ROS-producing capacity of piperlongumine was still maintained during the 15 days of drug release experiment.

Local treatment can be applied for patients with an advanced stage or unresectable stage of CCA [48]. Among various treatment options, DES is a promising candidate for unresectable CCA patients. However, conventional DES for GI tract has no tumor-targetable drug release function, and cytotoxic agent can be eluted in all areas of polymer membrane on the stent. Chemical, physical, or biological stimuli have been applied to induce altered drug delivery in the local region [49,50,51,52]. For example, Wang et al. used a magnitude of applied tensile strain to control drug release rate on the esophageal stent, i.e., increased drug release in a specific region was observed by propagating patterned crack of multilayered coating on the stent [49]. Thin film or nanoporous devices having stimuli-responsiveness such as pH and ionic strength were also investigated for application in DES [50, 51]. Chen and Huang reported that chitosan/poly(vinyl alcohol) hybrid nanofiber membrane was crosslinked with ally disulfide to endow reductant-responsiveness, and then hybrid nanofiber membrane showed favorable biological/material features [52]. We synthesized LEse deblock copolymer and fabricate redox-responsive nanofiber mats for local application in CCA tumors. PCL/LEse-blended nanofiber mats showed increased drug release behavior with responsiveness against H₂ O₂ , indicating that drug release kinetics can be controlled by ROS level in cancer cells or tumor tissues. Furthermore, ROS-dependent drug release from nanofiber mats can be accelerated in tumor since PL is a ROS-producing agent. PL in the tumor may synergistically increase ROS level and then accelerate drug release from nanofiber mats. After all, ROS-dependent release of PL from nanofiber-coated stent synergistically inhibits CCA cells in vitro and in vivo.

Conclusion

We fabricated ROS-sensitive nanofiber mats-coated GI stent using PCL/LEse block copolymer blend. PL was incorporated in nanofiber mats by electrospinning technique. PL release from nanofiber mats was accelerated by addition of H₂ O₂ , indicating that PL-incorporated nanofiber membranes have ROS-responsiveness. PL released from nanofiber mats at 5 days and 15 days showed appropriate anticancer activity even though its anticancer activity was slightly decreased compared to PL itself. As well as PL itself, PL released from nanofiber mats induced ROS generation and apoptosis of CCA cells. Furthermore, PL-incorporated nanofiber mats properly inhibited the growth of HuCC-T1 tumor in mice. We suggest PL-incorporated nanofiber mats prepared by PCL/LEse block copolymer blend as a promising candidate for local treatment of CCA cells.