Microfluïdisch apparaat rechtstreeks gefabriceerd op gezeefdrukte elektroden voor ultragevoelige elektrochemische detectie van PSA

Abstract

Hoe een goedkoop microfluïdisch apparaat op schaal te fabriceren voor de detectie van biomarkers is een grote vereiste. Hierin wordt voor het eerst gerapporteerd dat een nieuw microfluïdisch apparaat op basis van het binden van polydimethylsiloxaan microfluïdische kanalen op het substraat van een gezeefdrukte elektrode met coating van glasoplossing werd gefabriceerd voor elektrochemische detectie van prostaatspecifiek antigeen (PSA). In vergelijking met traditionele microfabricageprocessen is deze methode eenvoudig, snel, goedkoop en ook geschikt voor massaproductie. Het geprepareerde gezeefdrukte, op elektrodes gebaseerde microfluïdische apparaat (CASPE-MFD) werd gebruikt voor de detectie van de PSA in menselijk serum. De voorbereide CASPE-MFD had een detectielimiet van 0,84 pg/mL (25,8 fM) en een goede lineariteit met een PSA-concentratie variërend van 0,001 tot 10 ng/mL, wat een veelbelovend platform liet zien voor de ontwikkeling van geminiaturiseerde, goedkope elektrochemische microfluïdisch apparaat voor gebruik in de menselijke gezondheid, milieumonitoring en andere toepassingen.

Achtergrond

Microfluïdisch systeem is het proces van manipulatie van vloeistoffen met een klein volume (10⁻⁹ tot 10⁻¹⁸ L) binnen kanalen met een afmeting van tientallen tot honderden micrometers [1]. Deze technologie heeft een groot potentieel getoond in de biogeneeskunde, milieumonitoring en voedselveiligheidsanalyse. Met name microfluïdische apparaten (MFD's) vertonen doorgaans de volgende voordelen, waaronder kleine footprints, verminderd verbruik van reagentia, detectie van meerdere monsters tegelijk, verhoogde betrouwbaarheid, gevoeligheid en integratie op grote en grote schaal [2,3,4].

Elektrochemische sensoren zijn op grote schaal geïntegreerd en gekoppeld aan bemonstering, vloeistofbehandeling, scheiding en andere technische detectiescenario's [5]. De toepassing van elektrochemische sensoren voor detectie van biomoleculen is veelbelovend, aangezien elektrochemische sensoren tal van voordelen hebben, zoals hoge gevoeligheid en selectiviteit, betrouwbare reproduceerbaarheid, eenvoudig gebruik voor continue analyse ter plaatse, minimale monstervoorbereiding, relatief lage kosten en korte responstijd. Elektrochemisch systeem kan eenvoudig worden geïntegreerd in een microfluïdisch systeem [6, 7], en dit biedt voordelen ten opzichte van een conventioneel analytisch platform [8,9,10], zoals gemak bij monstervoorbereiding, uitstekende gevoeligheid en veelzijdigheid, en het verwijderen van omvangrijke optische componenten [11, 12].

In deze studie werd een eenvoudige, goedkope en veelzijdige strategie gebruikt voor de fabricage van elektrochemische detectie-MFD's met behulp van in de handel verkrijgbare gezeefdrukte elektroden voor diagnose op het punt van zorg. Het ontwikkelde apparaat werd gedefinieerd als CASPE-MFD's (commercieel verkrijgbare gezeefdrukte, op elektrodes gebaseerde microfluïdische apparaten). De microfluïdische kanalen van polydimethylsiloxaan (PDMS) werden eerst van een patroon voorzien met behulp van standaard fotolithografie en de CASPE-MFD's werden gefabriceerd door PDMS-microfluïdische kanalen rechtstreeks te hechten op een in de handel verkrijgbare gezeefdrukte elektrode (figuur 1). De gezeefdrukte elektrode werd direct gebruikt en gecoat met een dunne laag glas met behulp van sol-gel-benadering [13]. Vervolgens werden PDMS-microfluïdische kanalen op de elektrode gehecht na plasmabehandeling van hun oppervlakken. De CASPE-MFD's zijn in staat om de concentratie van verschillende analyten in biologische vloeistoffen zoals fosfaatbufferoplossing (PBS) en serummonsters te kwantificeren. De CASPE-MFD's werden gebruikt om de detectie en kwantificering van prostaatspecifieke antigeen (PSA) biomarker in PBS-bufferoplossingen en menselijke serummonsters aan te tonen met behulp van chronoamperometrie (CA) en vierkante golfvoltammetrie (SWV). De detectie van PSA in dit apparaat vertoonde een hoge gevoeligheid en de detectielimiet (LOD) voor PSA is 0,84 pg/ml (25,8 fM). De LOD is meer dan 100 keer gevoeliger dan de klinische detectielimiet van 0,1 ng/ml voor commerciële tests [14] en beter dan andere apparaten [3, 15, 16]. De CASPE-MFD is draagbaar, eenvoudig te gebruiken en heeft het potentieel om andere componenten te integreren, zoals systemen voor monstervoorbereiding en scheiding.

een Fabricageproces voor de PDMS microfluïdische kanalen gevormd door SU-8 fotolithografie. b Fabricageproces voor het in de handel verkrijgbare, op elektrodes gebaseerde microfluïdische apparaat met zeefdruk. De CASPE-MFD omvat PDMS microfluïdische kanalen, twee bedrukte gouden elektroden als werk- en tegenelektroden, en een bedrukte zilveren elektrode als pseudo-referentie-elektrode. c Een in de handel verkrijgbaar, op elektrodes gebaseerd microfluïdisch apparaat met zeefdruk

Materialen en methoden

Chemische reagentia en materialen

Prostaatspecifiek antigeen (PSA) en multiklonaal anti-PSA-antilichaam mierikswortelperoxidase (HRP) werden gekocht bij Petsec Energy Ltd. Gebiotinyleerd anti-PSA-antilichaam, magnetische streptavidinekorrels, runderserumalbumine en hydrochinon waren van Fisher Scientific. Tween-20, waterstofperoxide (H₂ O₂; 30%), en ferroceencarbonzuur waren van Sigma-Aldrich. SU-8 2075 was van MicroChem Corp. Het prepolymeer van polydimethylsiloxaan (PDMS) en het uithardingsmiddel werden gekocht bij Dow Corning. Alle immunoreagentia werden opgelost in 1 x pH 7,4 PBS-bufferoplossingen van KD Medical Solutions. Alle chemische reagentia zijn bereid met ultrapuur water uit een Millipore Milli-Q waterzuiveringssysteem.

Instrumentatie

De fluorescentiemicroscoop werd uitgevoerd op een Olympus U-CMAD3 (Olympus, Japan). De μCSPE-apparaten zijn vervaardigd door een plasmareiniger PDC-32G (Harrick Plasma, VS). Alle elektrochemische metingen werden uitgevoerd door CHI 760B (CHI, China) met een conventioneel systeem met drie elektroden, dat bestaat uit twee bedrukte gouden elektroden als respectievelijk werk- en tegenelektrode, en een bedrukte zilverelektrode als pseudo-referentie-elektrode (Fig. 1 ).

Microfluïdische chipfabricage

De PDMS-microfluïdische kanalen werden van een patroon voorzien met behulp van standaard fotolithografie. In het kort, een siliciumwafel, gespoeld met een gemengde oplossing (H₂ SO₄ /H₂ O₂ = 7/3) gevolgd door ultrazuiver water schoon, werd gecoat met SU-8 2075 fotoresist. De wafel werd vervolgens 7 min bij 65 ° C gebakken, gevolgd door 40 ° C bij 95 ° C om oplosmiddelen te verwijderen en gedurende 15 seconden aan UV-licht blootgesteld door een fotomasker. Het hele systeem werd 5 min bij 65°C gebakken, gevolgd door 15 min bij 95°C om de polymerisatie te stabiliseren. De niet-gepolymeriseerde fotoresist werd verwijderd door de siliciumwafel in SU-8-ontwikkelaar te weken en te wassen met isopropanol en gedeïoniseerd water. De mengsels van PDMS-prepolymeeroplossing en verharder (10,1) werden over de vooraf beschreven siliciumwafel gegoten, gedurende 2 uur bij 65 ° C uitgehard en afgepeld [17].

De in de handel verkrijgbare bedrukte elektrode werd gecoat met een laag glas met behulp van een sol-gel-benadering. In het kort werden tetra-ethoxysilaan (TEOS), MTES, ethanol en water volledig gemengd in een verhouding van 1:1:1:1 en gedurende 5 min gesoniceerd. De mengsels werden een nacht in een oven bij 65°C geplaatst. De elektrode werd gedurende 5 min bij 80 ° C op een hete plaat geplaatst vóór glascoating en vervolgens met de voorlopermengsels besmeurd met een borstel om te voorkomen dat de mengsels het elektrode-oppervlak binnendringen. De elektrode werd na het uitsmeren bij kamertemperatuur gedroogd. De PDMS-chip en de met glas bedekte elektrode werden vervolgens verwerkt met O₂ plasma gedurende 30 s en aan elkaar gehecht.

Chronoamperozmetrische experimenten

Chronoamperometrische experimenten werden uitgevoerd in 1 x pH 7,4 PBS met 4,5 mM hydrochinon en 0,1 mM waterstofperoxide-oplossingen bij een − 2,0 mV stappotentiaal (vs. een zilveren pseudo-referentie-elektrode) en genereerden de kalibratiecurve voor de concentratie van PSA van 0 tot 10 ng mL⁻¹ . In het kort hebben we 50 μL van 0,2 mg mL⁻¹ . geïnjecteerd met magnetische kralen geconjugeerd anti-PSA-antilichaam tegen μCSPE-apparaten met een snelheid van 50 μL min⁻¹ en grondig gewassen met 100 μL pH 7.4 PBS met een snelheid van 50 μL min⁻¹ . Bovendien, 50 μL van een blokkeerbuffer (0,05% (v /v ) Tween-20 en 2% (w /v ) runderserumalbumine (BSA) in PBS) werd geïnjecteerd met een snelheid van 10 μL min⁻¹ en gedurende 30 min geïncubeerd onder 37 °C omstandigheden, grondig gewassen met 100 μL pH 7.4 PBS met een snelheid van 50 μL min⁻¹ . Vervolgens werd 50 μL van verschillende concentraties PSA geïnjecteerd met een snelheid van 10 μL min⁻¹ met incubatie gedurende 30 min bij 37 °C en grondig gewassen met 100 μL pH 7.4 PBS met een snelheid van 50 μL min⁻¹ . Verder werd 50 μL HRP-geconjugeerd anti-PSA-antilichaam (1:1000 verdunning) geïnjecteerd met een snelheid van 10 μL min⁻¹ , gedurende 30 min bij 37 °C geïncubeerd en grondig gewassen met 100 μL pH 7.4 PBS met een snelheid van 50 μL min⁻¹ . Ten slotte injecteerden we 50 L van 1 × pH 7.4 PBS met 4,5 mM hydrochinon en 0,1 mM waterstofperoxide-oplossingen met een snelheid van 50 μL min⁻¹ . Nadat de piekstroom stabiel is, hebben we het gemiddelde van de drie stroommetingen genomen en de bijbehorende standaarddeviatie berekend. Eindelijk werd een chronoamperometrie geïmplementeerd met een constante potentiaal van 4 mV, in acht herhalingen voor elke groep. Om ervoor te zorgen dat de CASPE-MFD altijd in de beste conditie is tijdens het elektrochemische experiment, werd de elektrode van CASPE-MFD eerst geactiveerd door te scannen binnen het potentiaalbereik van 0,5 tot 1,5 V gedurende 10 cycli in vers bereide 0,5 MH₂ SO₄ oplossingen met behulp van cyclische voltammetrie. Het typische voltammogram dat kenmerkend is voor het schone polykristallijne goud werd gepresenteerd. Vervolgens werd de CASPE-MFD gewassen met ultrapuur water en PBS-oplossingen.

Resultaten en discussie

Voorbereiding van CASPE-MFD's

Homogene verdeling werd gebruikt om het nut van de CASPE-MFD te onderzoeken. Een oplossing van fluorescerende microbeads werd geïnjecteerd in de kanalen van een CASPE-MFD met een stroomsnelheid van 5 μL/min, en het is duidelijk dat elke hoek van de CASPE-MFD was gevuld met de oplossing van fluorescerende microbeads en dat er geen luchtbel werd gevormd in het apparaat (afb. 2). De stroomsnelheid werd verhoogd tot 100 L/min om de robuustheid van de CASPE-MFD te bewijzen, waaruit bleek dat het apparaat geschikt is voor analytdetectie.

een Gezeefdrukte foto-elektrode die wordt gebruikt om fluorescentiebeelden te maken. b Fluorescentiebeeld van CASPE-MFD. We gebruiken een foto-elektrode als een fluorescentiemodelafbeelding om aan te tonen dat het werkgebied vol is met kleurstoffen en geen luchtbellen heeft in de CASPE-MFD. c Gedeeltelijk vergrote tekening van het fluorescentiebeeld

Het fabricageproces werd ook onderzocht met cyclische voltammogrammen, zoals weergegeven in figuur 3. Ferroceencarbonzuur werd gebruikt als de modelredox-actieve verbinding, en figuur 3a toont de relatie van de redoxpiekstromen met verschillende potentiële scansnelheden. De redoxpiek van de CV-curven vertoont een typische omkeerbare elektrochemische reactie waarbij de reactiesnelheid wordt bepaald door de diffusie van de elektroactieve stof naar het elektrodeoppervlak. De potentiaalscheiding tussen kathodische piekpotentiaal (E _pc ) en piek anodisch potentieel (E _pa ) is 62 mV, wat dicht bij de theoretische waarde van 59 mV voor het ferroceen-redoxpaar ligt. Bovendien verandert de positie van piekpotentialen niet als functie van de potentiële scansnelheden en de anodische piekstroom (i _pa ) is ongeveer gelijk aan de kathodische piekstroom (i _pc ) in het bereik van 10 tot 350 mV/s. Het omkeerbare gedrag komt overeen met het signaal in bulkoplossing (Aanvullend bestand 1:Fig. S1A), wat aangeeft dat er geen nevenreacties plaatsvinden en dat, zoals verwacht, de kinetiek van elektronenoverdracht voldoende snel is om de oppervlakteconcentraties van redox te handhaven -actieve soorten bij de waarden vereist door de Nernst-vergelijking. Afbeelding 3b laat zien dat zowel anodische piekstroom (i _pa ) en kathodische piekstroom (i _pc ) waren evenredig met de vierkantswortel van de scansnelheden, wat een typisch diffusie-gecontroleerd proces impliceert [18]. Bovendien ligt de stroom gemeten in CASPE-MFD's redelijk dicht bij de waarde van de stroom in bulkoplossing (aanvullend bestand 1:Fig. S1B), wat aangaf dat een analyse in het apparaat zijn gevoeligheid niet opoffert.

een Cyclische voltammogrammen van 0,5 mM ferroceencarbonzuur in 0,1 M KCl waterige oplossing (pH 7,0) in CASPE-MFD bij verschillende scansnelheden (oplopend langs de y -as):10, 25, 50, 80, 100, 150, 200, 250, 300 en 350 mV/s. b Kalibratiegrafieken van de anodische (i _pa ) en kathodische piekstroom (i _pc ) versus de vierkante scansnelheid. De twee lijnen vertegenwoordigen respectievelijk een lineaire curve met regressievergelijking:Y (ik _pa ) = 0.9932X − 0.2563 (R ² = 0.9996, n = 8); J (ik _pc ) = − 0.9384X − 0.1774 (R ² = 0.9996, n = 8)

Prestaties van de CASPE-MFD's op PSA-detectie

Recente rapporten hebben aangetoond dat de concentratie van prostaatspecifiek antigeen (PSA) in het bereik van 4-10 ng/ml in het algemeen een hoge waarschijnlijkheid van de aanwezigheid van prostaatcarcinoom aangeeft [19]. Daarom werd PSA gekozen als een doelwit om de prestaties van de voorbereide CASPE-MFD te evalueren (Fig. 4). Figuur 4a laat zien dat de voorbereide CASPE-MFD direct kan worden aangesloten op een draagbaar elektrochemisch werkstation. Zoals weergegeven in figuur 4c, werd het met magnetische kralen geconjugeerde anti-PSA-antilichaam geïmmobiliseerd op het oppervlak van de gouden elektrode (werkelektrode) met behulp van een magneet. PSA-antigeen werd vervolgens geïnjecteerd in de microfluïdische kanalen van de bereide CASPE-MFD en geconjugeerd met het anti-PSA-antilichaam dat op de werkelektrode geïmmobiliseerd was. Vervolgens werd HRP-gemodificeerd anti-PSA-antilichaam geconjugeerd met PSA-antigeen. Chronoamperometrie werd gebruikt om de elektrochemische signalen te detecteren die hydrochinon en waterstofperoxide produceerden.

een Het hele detectieapparaat. De spuitpomp werd gebruikt om de oplossing in de CASPE-MFD te injecteren en het elektrochemische werkstation werd gebruikt om de elektrochemische signalen te detecteren. b De CASPE-MFD die wordt gebruikt om PSA te detecteren. Immunomagnetisch korrel-geconjugeerd anti-PSA-antilichaam werd geïnjecteerd met oplossingen via de inlaat, en een magneet werd gebruikt om de magnetische korrels te vangen. c Schema van de CASPE-MFD bij de detectie van PSA-antigeen. Immunomagnetische kraal-geconjugeerd anti-PSA-antilichaam werd geïmmobiliseerd op de werkelektrode met behulp van een magneet. PSA-antigeen werd geïnjecteerd in de CASPE-MFD en geconjugeerd met het anti-PSA-antilichaam. HRP-gemodificeerd anti-PSA-antilichaam werd vervolgens geconjugeerd met PSA-antigeen. Chronoamperometrie werd gebruikt om de elektrochemische signalen te detecteren die hydrochinon en waterstofperoxide produceerden

Chronoamperometrie geeft een betere signaal-ruisverhouding in vergelijking met andere amperometrische technieken [20,21,22,23,24], en het gebruik van een dunne plak vloeistof die mechanisch op de elektroden is geklemd, is beter bestand tegen trillingen dan analyse in een groter volume oplossing. Voor faraday-diffusiebeperkte stromen wordt de stroom-tijdrespons beschreven door de Cottrell-vergelijking.

$$ i=\frac{nFA{D}^{\frac{1}{2}}C}{{\left(\pi t\right)}^{\frac{1}{2}}} $$

waar n is het aantal elektronen, F is de constante van Faraday (96.485 C/mol), A is het elektrodeoppervlak (cm² ), D is de diffusiecoëfficiënt (cm² /s), en C is de concentratie (mol/cm³ ).

De bereide CASPE-MFD werd gebruikt om PSA te detecteren in een reeks analytoplossingen, concentraties van 0 tot 10 ng mL⁻¹ . De chronoamperometrische reacties van de detectie van PSA in CASPE-MFD's werden getoond in figuur 5a. De piekstromen namen toe met toenemende PSA-concentratie in pH 7,4 PBS met 4,5 mM hydrochinon en 0,1 mM waterstofperoxide. Zoals weergegeven in Fig. 5b (blauwe lijn), waren de piekstromen evenredig met de logaritmische waarde van PSA-concentraties over het bereik van 0,001 tot 10 ng/ml en de lineaire regressievergelijking is I (μA) = 14.87 + 3.927 × log C _PSA (ng/ml) (R ² = 0.9985, n = 8). De lage detectielimiet (0,84 pg/mL) en goede lineaire relatie suggereerden dat de voorbereide CASPE-MFD zou kunnen worden gebruikt om PSA in praktisch gebruik te detecteren. Bovendien hebben we ook verschillende PSA-concentraties in CASPE-MFD's gedetecteerd met behulp van blokgolfvoltammetrie (SWV) in figuur 5c. De SWV-reacties waren ook consistent met chronoamperometrische resultaten.

een Chronoamperometrische curven voor verschillende concentraties PSA-antigeen (oplopend langs de y -as):0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 en 10 ng/mL in pH 7,4 PBS-buffer met 4,5 mM hydrochinon en 0,1 mM H₂ O₂ oplossing in CASPE-MFD bij − 2.0 mV versus zilveren pseudo-referentie-elektrode. b De lineaire relatie tussen piekstroom en PSA-antigeenconcentratie in de CASPE-MFD's in pH 7,4 PBS-buffer (blauwe lijn) en in menselijk serum (rode lijn). De lineaire regressievergelijking van de blauwe lijn is Y = 14.87 + 3.927 × X (R ² = 0.9985, n = 8), en de lineaire regressievergelijking van de rode lijn is Y = 14.15 + 3.622 × X (R ² = 0.9986, n = 8). c Vierkantgolfvoltammogrammen voor verschillende concentraties PSA-antigeen in pH 7.4 PBS-buffer met 4,5 mM hydrochinon en 0,1 mM H₂ O₂ oplossing in CASPE-MFD (oplopend langs de y -as):respectievelijk 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 en 10 ng/mL. d De overeenkomstige lineaire relatie van verschillende concentraties PSA-antigeen. De lineaire regressievergelijking is Y = 34.53 + 9.246 × X (R ² = 0.9884, n = 8)

Selectieve detectie van PSA met de CASPE-MFD's

Om de mogelijke toepassing in ons apparaat voor echte monsters te verifiëren, hebben we verschillende concentraties PSA in menselijke serummonsters geanalyseerd met behulp van chronoamperometrie. De verkregen resultaten in Aanvullend bestand 1:Fig. S2 toonde aan dat de piekstromen van de PSA ook toenam met de toenemende PSA-concentratie in humaan serum dat 4,5 mM hydrochinon en 0,1 mM waterstofperoxide bevat. Bovendien werd de corresponderende kalibratiecurve getoond in Fig. 5b (rode lijn), en de lineaire regressievergelijking is I (μA) = 14.15 + 3.622 × log C _PSA (ng/ml) (R ² = 0.9986, n = 8). Het is duidelijk dat er bijna geen statistische verschillen waren tussen de twee groepen, wat aangeeft dat de voorbereide CASPE-MFD in echte steekproeven kon werken. Bovendien werd aangetoond dat de CASPE-MFD een grote selectiviteit heeft om PSA te targeten en in klinische toepassingen kan worden gebruikt om prostaatcarcinoom te diagnosticeren.

Conclusies

We hebben een eenvoudige, goedkope en draagbare commerciële gezeefdrukte elektrode-gebaseerde microfluïdische elektrochemische detectie ontwikkeld. Bovendien hebben we de toepassing van onze CASPE-MFD's voor de kwantitatieve analyse van PSA in PBS-buffer en in menselijke serummonsters aangetoond. De meting toonde een goede gevoeligheid en reproduceerbaarheid doordat het apparaat direct op de commerciële gezeefdrukte elektroden was gefabriceerd. De CASPE-MFD's hebben vijf voordelen:(i) het is lichtgewicht, draagbaar en multifunctioneel; (ii) het is gestandaardiseerd; (iii) het heeft een uitstekende reproduceerbaarheid met een hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid; (iv) het is gemakkelijk te gebruiken en vereist geen professioneel medisch personeel of ingewikkelde instrumenten; en (v) het maakt de integratie van detectiesystemen met hoge dichtheid in een klein apparaat mogelijk. Bovendien zou het gebruik van een geminiaturiseerde potentiostaat de CASPE-MFD's in staat kunnen stellen tot veld- of thuisdiagnose. Bovendien zouden de commerciële elektroden en eenvoudige fabricage de standaardisatie en industrialisatie van de CASPE-MFD's kunnen bereiken. Daarom zijn we van mening dat dit platform op grote schaal kan worden gebruikt voor point-of-care-diagnose zoals kleine moleculen (natrium, kalium, chloride, glucose), kankermarkers (B-type natriuretisch peptide of BNP, troponine I), cellen (CD₄ ), en nucleïnezuren (DNA, RNA).

Afkortingen

MFD's:: Microfluïdische apparaten
CASPE-MFD's:: Microfluïdische apparaten op basis van zeefdruk
PDMS:: Polydimethylsiloxaan
PSA:: Prostaatspecifiek antigeen
CA:: Chronoamperometrie
SWV:: Blokgolfvoltammetrie
LOD:: Detectielimiet
HRP:: Mierikswortelperoxidase
TEOS:: Tetra-ethoxysilaan
MTES:: Metastabiele overdrachtsemissiespectroscopie
BNP:: B-type natriuretisch peptide

Zelfpolarisatie van PVDF-film veroorzaakt door hydrofiele behandeling voor pyro-elektrische sensor met ultralage piëzo-elektrische ruis Fotonisch ontwerp en elektrische evaluatie van dubbelfunctionele zonnecellen voor energieconversie en weergavetoepassingen

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal