Bioimaging-tools op basis van polyelektrolytmicrocapsules gecodeerd met fluorescerende halfgeleidernanodeeltjes:ontwerp en karakterisering van de fluorescerende eigenschappen

Resultaten en discussie

Ontwikkeling van QD-gecodeerde polyelektrolytmicrocapsules

We gebruikten de laag-voor-laag depositietechniek voor het verkrijgen van bio-imaging-agentia in de vorm van QD-gecodeerde fluorescerende microdeeltjes omdat de voorgestelde methode geen organische oplosmiddelen vereiste, het gebruik van biocompatibele polymeren mogelijk maakte [23, 24], en zorgde voor een efficiënte immobilisatie van QD's in de polymeerschil [21]. De fabricage van de fluorescerende polyelektrolytmicrocapsules die optisch zijn gecodeerd met in water oplosbare, aan het oppervlak gemodificeerde QD's, bestaat uit het aanbrengen van vijf tegengesteld geladen polyelektrolytlagen op het oppervlak van calciumcarbonaatmicrodeeltjes die als matrices dienen als de eerste stap, gevolgd door het coderen van de polyelektrolytmantel met negatief geladen QD's, de QD-laag bekleden met beschermende lagen van tegengesteld geladen polyelektrolyten, oplossen van de kernmatrix van het microdeeltje en, ten slotte, modificatie van het microcapsule-oppervlak met BSA (Fig. 1). De negatieve oppervlaktelading van de calciumcarbonaatmicrodeeltjes zorgt voor de adsorptie van PAK als gevolg van elektrostatische interactie van het polykation met het microdeeltjesoppervlak. Het positieve ζ-potentieel van het oppervlak als gevolg van PAK-adsorptie op de deeltjes maakt de daaropvolgende toepassing van het PSS-polyanion mogelijk, evenals QD's die zijn gemodificeerd met HS-PEG₁₂ -COOH, dat ook een negatieve oppervlaktelading heeft vanwege de carboxylgroep en daarom kan worden geadsorbeerd op de PAK-polykationlaag. Inbedding van de QD's in het polymere polyelektrolytmembraan wordt uitgevoerd door extra dekkende polyelektrolytlagen aan te brengen (ten minste vier tot zes), zoals weergegeven in Fig. 1a, b.

Het ontwerp en de structuur van de polyelektrolyt-microcapsules gecodeerd met kwantumdots (QD's):a Een schematisch diagram van de rangschikking van de lagen in het polymeermicrocapsulemembraan. b Veranderingen in de ζ-potentiaal van het oppervlak van de calciumcarbonaatmicrodeeltjes tijdens gelaagdheid van polymere elektrolyten en QD-codering. c Een fluorescerende microfoto van de polyelektrolytmicrocapsules gecodeerd met CdSe/ZnS QD's opgelost met HS-PEG₁₂ -COOH. * De ζ-potentialen van het microcapsule-oppervlak nadat de kern was verwijderd; ** een extra stap in de fabricage van QD-gecodeerde polyelektrolyt microcapsules met een BSA-gemodificeerd oppervlak

Holle microcapsules die geïmmobiliseerde QD's in hun polymeermembraan bevatten, worden verkregen door de calciumcarbonaatmicrodeeltjes op te lossen met 0,2 M EDTA (pH 6,5) en de vorming van het in water oplosbare complex van calciumzout van ethyleendiaminetetraazijnzuur, waarvan de diffusie door het polymeermembraan resulteert in de vorming van holtes in de microcapsules. Voor het verkrijgen van QD-gecodeerde polyelektrolytmicrocapsules met een BSA-gemodificeerd oppervlak, wordt het PAA-polyanion gelaagd op de 11e laag van het PAK-polykation. PAA wordt gebruikt vanwege de waarde van de dissociatieconstante bij interactie met het microcapsule-oppervlak. pKa-waarde van PAA (pKa ≈ 4.7) is lager en dus zuurder in vergelijking met PSS (pKa ≈ 7.5) [25, 26], wat resulteert in een hoger ζ-potentiaal van het microcapsule-oppervlak. De lading van het PAA-gemodificeerde oppervlak vergemakkelijkt BSA passieve adsorptie als gevolg van elektrostatische interactie tussen BSA en PAA. Assemblage tussen PAA en BSA resulteert echter in een afname van de negatieve oppervlaktelading van microcapsules (figuur 1b). Na afzetting van BSA op het oppervlak van de microcapsule, vindt de afscherming van de negatief geladen PAA-laag door elektrostatisch positieve aminogroepen van BSA plaats, vandaar dat het ζ-potentieel van de met BSA gecoate QD-gecodeerde microcapsules waarschijnlijk primair wordt bepaald door elektrostatisch gedrag van BSA als een buitenste microcapsulecoating [26].

De in water oplosbare gePEGyleerde QD's worden gekenmerkt door een smalle grootteverdeling, de afwezigheid van aggregaties in de dispersie en een hoge colloïdale stabiliteit. Dit zorgt waarschijnlijk voor homogene adsorptie van QD's op het microbolletjesoppervlak en vergemakkelijkt een effectieve codering en dus het verkrijgen van helder fluorescerende microcapsules (Fig. 1c).

Het gebruik van eiwitten, zoals BSA, voor oppervlaktemodificatie maakt de polymeermicrocapsules meer biocompatibel en beter bestand tegen adhesie met elkaar. Dit zorgt ook voor tijdelijke passivering van het microcapsule-oppervlak, wat belangrijk is voor de daaropvolgende studie van de microcapsules gevormd door PAH-PSS- of PAH-PAA-interpolymeercomplexen in termen van in vitro interactie met cellen en in vivo gedrag [27,28,29] .

De verkregen QD-gecodeerde microcapsules zijn bolvormig (Fig. 1c) en worden gekenmerkt door een smalle grootteverdeling (Fig. 2) met een gemiddelde grootte van 4,45 ± 0,65μm. Deze grootte is vergelijkbaar met die van rode bloedcellen en is zelfs kleiner [30]. Bovendien, zoals eerder getoond, is het polymeermembraan van de microcapsules een flexibele structuur die vatbaar is voor vervorming. Omdat ze intraveneus worden geïnjecteerd, kunnen microcapsules van deze grootte niet door de bloed-weefselbarrières dringen, waardoor het transport en de distributie van optisch gecodeerde microcapsules in het lichaam kunnen worden getraceerd [31, 32]. In lokalisaties met een verbeterde permeabiliteit van de bloedvatwand, bijv. in ontstekings- en tumorgroeigebieden, kunnen microcapsules echter doordringen in de extravasculaire ruimte, wat naar verwachting de beeldvorming en monitoring van gerichte levering zal garanderen [33,34,35 ,36].

Grootteverdeling van de polyelektrolytmicrocapsules optisch gecodeerd met kwantumdots, waarbij het aantal geanalyseerde microcapsules 600 was

De fluorescentie- en structuurkenmerken van de QD-gecodeerde polyelektrolytmicrocapsules

De gefabriceerde microcapsules worden gekenmerkt door een fluorescentiepiek bij een golflengte van 590 nm, wat overeenkomt met die van de originele in water oplosbare QD's die worden gebruikt voor de optische codering van de microcapsules. Dit geeft aan dat de polymere polyelektrolyten die het microcapsulemembraan vormen geen invloed hebben op de fluorescerende eigenschappen, met name het fluorescerende maximum, van de QD's in de microkralen en de microcapsules die daaruit zijn bereid (Fig. 3).

Het effect van de opname van kwantumdots (QD) in het polymeermembraan van de microbeads (MCB's) en microcapsules (MCC's) op hun fluorescentiekenmerken:het fluorescentiespectrum van een QD-oplossing die 2.241 mg QD's bevat, wordt getoond; dit komt overeen met het aantal QD's dat wordt gebruikt voor de optische codering van de MCB's

Figuur 4 toont de distributiehistogrammen voor de intensiteit van signalen van de populaties van QD-gecodeerde microcapsules, evenals placebo-microcapsules, in het PE (575/25 nm) fluorescentiekanaal en FSC-A en SSC-A (488/10 nm ) kanalen van de flowcytometer. De gegevens wijzen op een effectieve differentiatie tussen de placebo en optisch gecodeerde microcapsules in het PE-kanaal (575/25 nm) (figuur 4a, b). De intensiteit van het fluorescentiesignaal van de microcapsules in het PE (575/25 nm) kanaal is ~ 10 ⁴ , die een hoge fluorescentiecapaciteit van de QD-gecodeerde microcapsules aantoont. In de FSC-A en SSC-A (488/10 nm) kanalen overlappen de verdelingen voor de twee microcapsulepopulaties, wat wijst op vergelijkbare relatieve grootten en granulariteitsparameters van de placebo en gecodeerde microcapsules (Fig. 4c, d) en dus , homogeniteit van de bevolking. Blijkbaar is dit te wijten aan het feit dat de microcapsulemembranen uit gelijke aantallen polymeerlagen bestaan, waarbij het membraan van de gecodeerde microcapsules slechts één laag QD's bevat. De verkregen microcapsules worden dus gekenmerkt door een homogene grootteverdeling en optimale fluorescentiekenmerken die hun detectie in de overeenkomstige kanalen van een flowcytometer verzekeren.

Detecteerbaarheid van QD-gecodeerde polyelektrolytmicrocapsules door flowcytometrie:a microcapsule dot-plot-profiel in SSC-PE-kanalen; b microcapsule-distributiehistogram in PE-kanaal; c microcapsule dot-plot-profiel in SSC-FSC-kanalen; d microcapsule-distributiehistogram in FSC-kanaal. QD-vrije microcapsules (placebo) werden gebruikt als controle en worden grijs weergegeven, terwijl die gecodeerd met CdSe/ZnS-kwantumdots (maximum fluorescentie-emissie bij 590 nm) in oranje worden weergegeven. Het aantal geanalyseerde gebeurtenissen was 2500. De dot-plots en histogramassen worden weergegeven als SSC-A, FSC-A, PE-A, waarbij A betekent dat de gegevens worden weergegeven door het signaalgebied

De microfoto's van secties van de QD-gecodeerde polyelektrolytmicrocapsules getoond in Fig. 5 tonen aan dat de microcapsules hol zijn, waarbij het gedetecteerde heldere fluorescerende signaal wordt uitgezonden door de polymeermembranen die QD's bevatten. Deze gegevens bevestigen de efficiëntie van de procedure die wordt gebruikt voor het oplossen van de kern en demonstreren een helder fluorescentiesignaal van de gefabriceerde microcapsules, die kunnen worden gedetecteerd met behulp van de overeenkomstige filters, Texas Red en PE in het geval van respectievelijk fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie. De bereide polyelektrolytmicrocapsules die QD's in hun polymeeromhulsel bevatten, hebben hogere fluorescerende eigenschappen in vergelijking met polyelektrolytmicrocapsules die zijn gelabeld met conventionele kleurstoffen zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) of aminofluoresceïne [14, 37]. Anders hebben de microcapsules die zijn gecodeerd met QD's met behulp van de laag-voor-laagbenadering een helderheid die vergelijkbaar is met of zelfs minder is dan die van de microbolletjes die zijn gecodeerd met organische kleurstoffen met behulp van zweltechniek. De helderheid wordt bepaald door het product van de extinctiecoëfficiënt en de kwantumopbrengst. De kwantumopbrengsten van in water oplosbare QD's bij kamertemperatuur zijn ongeveer 40%, wat vergelijkbaar is met die voor organische kleurstoffen [22, 38, 39], terwijl het uitsterven van QD's bijna 100 keer groter is dan die voor organische kleurstoffen. Anders, vanwege de grote omvang van QD's, is het mogelijk dat hun hoeveelheden in de microcapsule-omhulling niet vergelijkbaar worden gemaakt met die voor organische kleurstofmoleculen. De hoeveelheden coderende organische kleurstofmoleculen kunnen dus veel beter worden gemaakt dan die voor QD's, waardoor een vergelijkbare helderheid wordt gegarandeerd. Aan de andere kant biedt het coderen van de microcapsules met de QD's zo'n belangrijk comparatief voordeel als de volledige afwezigheid van fotobleking. Bovendien kunnen de QD's van verschillende kleuren (groottes) worden geëxciteerd met dezelfde golflengte-excitatie. Het gebruik van de QD's van verschillende kleuren voor het coderen van microcapsules kan dus een praktisch onbeperkt aantal spectraal opgeloste optische codes opleveren [21].

Microfoto's van secties van de polyelektrolyt-microcapsules gecodeerd met kwantumstippen. De pijlen in (a ) geef de gebieden aan die worden weergegeven in (b , c ) bij een hogere vergroting