Zelfassemblagestabiliteit en variabiliteit van bacteriële microcompartiment-shell-eiwitten als reactie op de milieuverandering

Abstract

Bacteriële microcompartimenten (BMC's) zijn eiwitachtige zelfassemblerende organellen die wijdverspreid zijn in het prokaryotische koninkrijk. Door belangrijke metabole enzymen en routes te segmenteren met behulp van een polyedrische schaal, spelen BMC's een essentiële rol bij koolstofassimilatie, pathogenese en microbiële ecologie. De BMC-schaal is samengesteld uit meerdere eiwithomologen die zichzelf assembleren om de gedefinieerde architectuur te vormen. Er is een enorme belangstelling voor het ontwerpen van BMC's om nieuwe nanobioreactoren en moleculaire steigers te ontwikkelen. Hier rapporteren we de kwantitatieve karakterisering van de vorming en zelfassemblagedynamiek van BMC-schaaleiwitten onder variërende pH- en zoutomstandigheden met behulp van snelle atoomkrachtmicroscopie (HS-AFM). We laten zien dat een zoutconcentratie van 400 mM de neiging heeft om te resulteren in grotere enkellaagse schaalpleisters gevormd door schaalhexameren, en een hogere dynamische snelheid van zelfassemblage van hexameer werd waargenomen bij neutrale pH. We visualiseren ook de variabiliteit van shell-eiwitten van hexamere assemblages tot vezelachtige arrays. Deze studie bevordert onze kennis over de stabiliteit en variabiliteit van zelfassemblages van BMC-eiwitten als reactie op veranderingen in de micro-omgeving, wat zal leiden tot rationeel ontwerp en constructie van synthetische BMC-structuren met het vermogen om hun zelfassemblage en structurele robuustheid te hermodelleren. Het biedt ook een krachtige toolbox voor het kwantitatief beoordelen van de zelfassemblage en vorming van op BMC gebaseerde nanostructuren in biotechnologische toepassingen.

Inleiding

Bacteriële microcompartimenten (BMC's) zijn eiwitachtige organellen, die qua structuur lijken op virale capsiden, die het cytoplasma van bacteriën verdelen [1]. Ze zijn wijdverbreid onder bacteriële phyla [2] en stellen bacteriën in staat om belangrijke metabole routes te compartimenteren in de afwezigheid van membraangebonden organellen die worden aangetroffen in eukaryoten [3, 4]. BMC's worden gevormd door een semi-permeabele eiwitschil die een luminale enzymkern inkapselt. De schaal is samengesteld uit drie soorten structurele eiwitcomponenten, waaronder BMC-H (met een Pfam00936-domein), BMC-T (met twee Pfam00936-domeinen) en BMC-P (met een Pfam03319-domein) [5,6,7, 8,9]. De belangrijkste componenten van de schaal zijn BMC-H, die verschijnen als hexameren met convexe en concave oppervlakken en de schaalfacetten betegelen met hun concave kant naar buiten gericht [10] (Fig. 1). BMC-P vormt pentameren waarvan wordt voorgesteld dat ze de hoekpunten van de icosaëdrische vorm afdekken, en BMC-T vormt pseudohexameren die zich in de schaalfacetten bevinden die vermoedelijk verantwoordelijk zijn voor de permeabiliteit van de schaal.

Bacterieel microcompartiment, schaalorganisatie en zelfassemblage. een Honderden kopieën van homologen van BMC-schaaleiwitten assembleren zichzelf om een icosahedraal eiwitorganel te vormen. BMC-H-eiwitten, in geel, vormen de facetten en BMC-P-eiwitten, in rood, bezetten de hoekpunten. b AFM-topografen van schaalfacetten samengesteld uit Hoch_5815 BMC-H hexameren. Dynamische gebeurtenissen (cirkels) werden binnen enkele seconden waargenomen met HS-AFM

Specifieke eiwit-eiwit-interacties zorgen voor de zelfassemblage van BMC-eiwitten om sterk gedefinieerde architecturen te vormen om hun metabolische functionaliteit te vervullen. Aangenomen wordt dat de laterale interacties tussen schileiwitten de belangrijkste factor zijn voor het bepalen van de zelfassemblage-eigenschappen van de icosahedrale schil [10]. Er is waargenomen dat BMC-H-homologen verschillende vormen kunnen vormen, waaronder tweedimensionale platen [11, 12], nanobuisjes [13,14,15,16,17] en filamentstructuren [15, 18,19,20] .

Op basis van de zelfassemblage, selectieve permeabiliteit en enzyminkapselingseigenschappen van de natuurlijk voorkomende organellen, worden BMC's beschouwd als een ideaal systeem met een groot potentieel in bio-engineering, inclusief bio-geïnspireerde constructie van bioreactoren op nanoschaal door metabole enzymen in te kapselen en het genereren van nieuwe moleculaire steigers met nieuwe functies [21,22,23,24,25,26]. Er moeten echter nog enkele belangrijke problemen worden aangepakt in BMC-bioengineering, bijvoorbeeld hoe stabiel de BMC-structuren zijn en hoe de zelfassemblage en vorming van BMC-eiwitaggregaten effectief kunnen worden gemanipuleerd en beoordeeld. Onderzoeken van de structuren en assemblage van BMC-schalen en volledige BMC's zijn uitgevoerd met behulp van röntgenkristallografie, elektronenmicroscopie (EM), fluorescentiemicroscopie en dynamische lichtverstrooiing (DSL) [10, 11, 16, 22, 27,28 ,29,30,31]. Onlangs hebben we high-speed AFM (HS-AFM) gebruikt om de eerste visualisatie van het dynamische zelfassemblageproces van BMC-H-eiwitten [12] uit te voeren.

In dit werk gebruiken we HS-AFM om de structurele dynamiek van BMC-H-pleisters onder variërende pH- en ionische omstandigheden te volgen, wat inzicht geeft in de modulatie van BMC-schaaleiwitassemblage en een krachtig hulpmiddel biedt voor kwantitatieve beoordeling, bij de moleculaire resolutie , over de stabiliteit en variabiliteit van zelfassemblage van BMC-schaaleiwitten.

Methoden

Voorbereiding van monsters

Het gezuiverde BMC-H-eiwit (Hoch_5815) uit Haliangium ocraceum werd vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. Kerfeld (Lawrence Berkeley National Laboratory). Voor bufferuitwisseling, voorraadmonsters bij ~ 80 mg mL⁻¹ in Tris-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂ ) werden verdund tot 0,5 mg mL⁻¹ met behulp van de gewenste buffer voorafgaand aan AFM-beeldvorming (aanvullend bestand 1:Afbeelding S1). De controlebuffer is 50 mM Tris-HCl (pH 7,8) en 10 mM MgCl₂ .

Atoomkrachtmicroscopie

Gewenste buffers werden gebruikt voor monsterabsorptie op mica- en AFM-beeldvorming. Na 5 min absorptie op de mica, werd Hoch_5815 gespoeld met de gewenste buffer om geïmmobiliseerde eiwitten te verwijderen en vervolgens afgebeeld met AFM (aanvullend bestand 1:figuur S1). HS-AFM-beelden werden vastgelegd bij 30 of 40 Hz in oplossing in AC-modus met behulp van een JPK NanoWizard ULTRA speed AFM uitgerust met een ULTRA Speed 2,8 m scanner en Ultra-Short Cantilever USC-0,3 MHz-sondes (NanoWorld). Minimale belastingskrachten van ~ 100 picoNewton werden toegepast tijdens AFM-beeldvorming om verstoring van eiwitassemblage te verminderen [12, 32,33,34,35,36].

Beeldverwerking en analyse

Beeldanalyse werd aanvankelijk uitgevoerd met behulp van JPK SPM Data Processing (JPK). HS-AFM-beeldanalyse werd uitgevoerd met behulp van een aangepaste macro op Image SXM (//www.ImageSXM.org.uk), zoals eerder beschreven [12]. Om de grootte van Hoch_5815-patches te analyseren, werden afbeeldingen van 512 × 512 pixels vastgelegd met een scansnelheid van 30 Hz afgevlakt om elke XY-kanteling en Z-drempelwaarde te verwijderen, gevolgd door binaire conversie om eiwit weer te geven in plaats van eiwit. Deeltjesanalyse werd gebruikt om het oppervlak van eiwitten in deze binaire afbeeldingen te berekenen. Patches werden gedefinieerd als objecten gescheiden door> 3 pixels (~ 2 nm), om individuele patches versus aangrenzende patches te identificeren. Eerste tests toonden aan dat als een groter aantal pixels is ingesteld, aangrenzende patches kunnen worden geteld als een enkele continue patch, terwijl met een kleiner aantal pixels de gaten tussen individuele hexameren in patches verkeerd kunnen worden geteld als de grens tussen patches. Om de eiwitdynamiek te analyseren, werden beeldreeksen van 256 × 256 pixels vastgelegd met een scansnelheid van 40 Hz geanalyseerd, wat een tijdelijke resolutie van ongeveer 6,4 s per frame opleverde. Binaire afbeeldingen werden afgetrokken van de vorige afbeelding in de serie om verschillende AFM-afbeeldingen te tonen. Deeltjesanalyse van de verschilbeelden werd gebruikt om het gebied van geassembleerde en gedemonteerde eiwitten te tellen. De vergelijking die wordt gebruikt voor het berekenen van de dynamische snelheid wordt als volgt weergegeven:

$$ \mathrm{Rate}\ \mathrm{of}\ \mathrm{dynamic}\ \mathrm{events}\ (R)=\frac{\mathrm{Number}\ \mathrm{of}\ \mathrm{hexamers} \ \mathrm{toegevoegd}\ \mathrm{of}\ \mathrm{verwijderd}\ \mathrm{in}\ \mathrm{a}\ \mathrm{s}\mathrm{eries}\ \mathrm{of}\ \mathrm {frame}\mathrm{s}\kern0.5em (N)}{\mathrm{Total}\ \mathrm{surface}\ \mathrm{area}\ \mathrm{of}\ \mathrm{proteïne}\ \mathrm{ in}\ \mathrm{frame}\kern0.5em (A)\times \mathrm{time}\kern0.5em (T)}, $$

waar N vertegenwoordigt de som van witte en zwarte pixels in een afbeelding met een drempelverschil, gedeeld door het aantal pixels dat overeenkomt met een enkele hexameer op die schaal (aanvullend bestand 1:Afbeelding S3, Afbeelding S5). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van multivariate ANOVA of two-way ANOVA zoals gespecificeerd.

Resultaten

We gebruikten de BMC-H-eiwitten (Hoch_5815) van een myxobacterium Haliangium ocraceum , die tot expressie werden gebracht in Escherichia coli en gekenmerkt als hexameren met een zesvoudige symmetrie [12]. Hoch_5815-hexameren zouden zichzelf kunnen assembleren om op de tweede tijdschaal enkellagige vellen te vormen, die de structurele basiscomponenten van de icosahedrale BMC-architectuur vertegenwoordigen (figuur 1a). HS-AFM-beeldvorming stelt ons in staat om de dynamische assemblage en organisatorische flexibiliteit van bladfragmenten te visualiseren (Fig. 1b) en kwantitatief de patchgrootte en dynamische snelheid van BMC-H-eiwitten te schatten met behulp van de ontwikkelde beeldvormingsanalyse (zie de sectie "Methoden").

Reactie op pH-variatie

We hebben de veranderingen in patchgrootte gemeten als een indicatie van het algehele vermogen van Hoch_5815 om zichzelf te assembleren. De grootte van de pleister neemt toe met de stijging van de pH van 3 naar 10 (Fig. 2a; Aanvullend bestand 1:Figuur S2, Tabel S1), wat suggereert dat een hoge pH gunstiger is voor de zelfassemblage van Hoch_5815-eiwitten dan omstandigheden met een lage pH. Dit verschilt enigszins van het assemblagegedrag van RmmH-eiwitten, die onoplosbaar bleken te zijn bij pH 6, geordende arrays van nanobuisjes vormen bij pH 8, en vatbaar waren voor demontage bij pH 10 [13]. Daarnaast hebben we een hoge mate van structurele variabiliteit waargenomen van de HOCH_5815 zelfassemblages (zoals aangegeven door een grote SD in figuur 2a, aanvullend bestand 1:figuur S2).

Effecten van omgevings-pH op de zelfassemblage van Hoch_5815. een De gemiddelde oppervlakten van individuele patches van Hoch_5815 bepaald door AFM (n = 50) (Extra bestand 1:Afbeelding S2). b De gemiddelde snelheid van dynamische gebeurtenissen bepaald door HS-AFM (n = 50). *p < 0.05, ns niet significant (multivariate ANOVA)

AFM-beeldvorming van de zelfassemblage van Hoch_5815-eiwitten in schaalplaten heeft onthuld dat de vorming van schaalplaten wordt toegeschreven aan een combinatie van de assemblage en demontage van hexameren [12]. We onderzochten verder de snelheden van Hoch_5815 zelfassemblagedynamiek en dynamische gebeurtenissen onder verschillende pH (aanvullend bestand 1:tabel S2) om de stabiliteit van Hoch_5815 eiwit-eiwit-interacties te onderzoeken. De snelheid van zelfassemblage is het hoogst bij pH 7 en neemt af in zowel zure als alkalische omstandigheden (Fig. 2b; Aanvullend bestand 1:Figuur S3). Het neemt met name snel af in zure omstandigheden, met name van pH 7 tot pH 6 en lijkt relatief constant tussen pH 4 en pH 3, zoals weergegeven in figuur 2b.

Het is waarschijnlijk dat de pH een grote invloed heeft op de elektrostatische eigenschappen van aminozuurresiduen die zich op het hexameer-hexameer grensvlak bevinden. De verminderde dynamiek en een kleinere omvang van shell-patches die worden waargenomen in zure omstandigheden, illustreren dat Hoch_5815 een verminderd zelfassemblerend vermogen heeft. De verminderde dynamiek en een grotere omvang van schaalpleisters waargenomen in de alkalische omstandigheden suggereren stabiele hexameer-hexameer-interacties, terwijl de verhoogde dynamiek van Hoch_5815 hexameren flexibele hexameer-hexameer-interacties in de neutrale pH-conditie impliceren.

Reactie op de variatie van zoutconcentraties

We hebben ook geverifieerd of de zoutconcentratie van de buffer invloed heeft op de assemblage van Hoch_5815. Bij lage concentraties (100-200 mM) van MgCl₂ , CaCl₂ , en KCl, Hoch_5815-eiwitten vormen relatief kleinere patches dan die geassembleerd in hogere concentraties (300-500 mM) (figuur 3a; aanvullend bestand 1:figuur S4). Bij 500 mM zagen we dubbel- of meerlagige Hoch_5815-vellen (aanvullend bestand 1:Afbeelding S4). Deze waarnemingen komen overeen met de eerdere bevinding dat een hogere ionsterkte de vorming van uitgebreidere en goed geordende 2D-kristallen door CcmK, de schaaleiwitten van carboxysomen voor koolstofassimilatie, zou kunnen vergemakkelijken [37]. De zeer geordende nanobuisjes gevormd door RmmH werden echter gedemonteerd toen de NaCl-concentratie werd verhoogd van 50 tot 500 mM [13], wat wijst op de mogelijk verschillende mechanismen die de vorming van platte platen en buisvormige vormen door schaalhexameren bemiddelen.

Effecten van zoutconcentratie op de zelfassemblage van Hoch_5815. een De gemiddelde pleisteroppervlakken gemeten door AFM onder een bereik van 100-500 mM CaCl₂ , MgCl₂ , en KCl (n = 50). De stijging van de zoutconcentratie resulteerde in grotere pleistergroottes. Significante veranderingen in het gebied van de pleister werden waargenomen tussen 200 en 300 mM (***p < 0.001, *p < 0.05, ns niet significant, tweerichtings-ANOVA). b De gemiddelde snelheid van dynamische gebeurtenissen bepaald op basis van snelle AFM-beeldreeksen onder een bereik van 100–500 mM CaCl₂ , MgCl₂ , en KCl (n = 50). Elke verandering van 100 mM in de zoutconcentratie leidde tot een significante verandering in de snelheid van dynamische gebeurtenissen (***p < 0.001, *p < 0.05, ns niet significant, tweerichtings-ANOVA)

Bovendien zijn de variaties van Hoch_5815 zelfassemblage veroorzaakt door de veranderingen in MgCl₂ en KCl-concentraties zijn relatief vergelijkbaar. Daarentegen is de verandering in pleistergrootte het meest uitgesproken (tot een 3000-voudige toename) wanneer de CaCl₂ concentratie wordt verhoogd van 200 tot 300 mM (Fig. 3a), wat wijst op de hogere gevoeligheid van Hoch_5815 zelfassemblage voor CaCl₂ dan aan MgCl₂ of KCl.

De dynamische snelheid van Hoch_5815 zelfassemblage wordt ook beïnvloed door veranderingen in de bufferzoutconcentratie. De toename van MgCl₂ , CaCl₂ of KCl-concentraties kunnen leiden tot een afname van de dynamische snelheid van Hoch_5815 (Fig. 3b; Aanvullend bestand 1:Figuur S5). Gezien de toename van de pleistergrootte die wordt waargenomen bij hogere zoutconcentraties (figuur 3a), lijkt het erop dat de laterale interacties tussen Hoch_5815-hexameren stabieler zijn bij hoge zoutconcentraties. Veranderingen in CaCl₂ concentratie had een meer uitgesproken respons en er was een significante verschuiving in de snelheid van dynamische gebeurtenissen tussen 200 en 300 mM (Fig. 3b), terwijl de reacties op de veranderingen in MgCl₂ en KCl zijn relatief vergelijkbaar, consistent met de veranderingen in de pleistergrootte (figuur 3a). Interessant genoeg werden de hoogste percentages montagegebeurtenissen versus demontagegebeurtenissen waargenomen onder 400 mM MgCl₂ , CaCl₂ , of KCl (aanvullend bestand 1:Tabel S2). Dit leidde tot de vorming van grote en stabiele enkellaagse Hoch_5815-assemblages onder 400 mM zout (aanvullend bestand 1:figuur S4). De dubbellaagse assemblages die zijn waargenomen bij 500 mM zijn ook stabiel en vertonen lage snelheden van hexameerbeweging.

Flexibiliteit van BMC-H-eiwitassemblage

Door de scankracht te verminderen tot 100 pN, hebben we de effecten van AFM-tipscanning op de assemblage van BMC-eiwitten geminimaliseerd en AFM-beelden met moleculaire resolutie van individuele hexameren verkregen (Fig. 4). Zowel montage- als demontagegebeurtenissen kunnen in dezelfde weergave worden gezien, wat de dynamische aard van BMC-schaalassemblages verifieert in plaats van tipscanartefacten [12]. HS-AFM-beeldvorming onthulde ook de variabiliteit van Hoch_5815-eiwitaggregaties. Bij beeldvorming van de monsters bij pH 7,5 in aanwezigheid van slechts 10 mM MgCl₂ , verrassend genoeg zagen we af en toe de vorming van vezelachtige structuren samen met de demontage van Hoch_5815-hexameren op de tweede tijdschaal (figuur 4a). Deze vezelachtige structuren zouden parallel dicht opeengepakt kunnen zijn, vergelijkbaar met de nanobuisbundels die zijn geassembleerd door shell-hexameren [13,14,15,16]. De ruimte tussen twee vezels is echter 3,72 ± 0,31 nm (n = 30) en hun gemiddelde lengte is 2,46 ± 0,22 nm (n = 30), minder dan die van schaalplaten gevormd door Hoch_5815 hexameren (3,45 ± 0,16 nm, n = 25) (Fig. 4b-f). Deze vezelstructuren zijn redelijk flexibel en dynamisch tijdens beeldvorming en kunnen rechte of opgerolde architecturen met verschillende afmetingen vertonen. Gezien het gelijktijdige uiterlijk van de vezelstructuren met de demontage van Hoch_5815-hexameren en hun verminderde hoogte in vergelijking met de enkellaagse hexameervellen, speculeren we dat deze vezelachtige structuren worden gevormd door de individuele Hoch_5815-peptiden die uit hexameren zijn gedemonteerd (Fig. 4g) . Het is waarschijnlijk dat de substraatabsorptie in specifieke bufferomstandigheden (zoals lage ionsterkte) zou kunnen leiden tot hechting van de alfa-helixzijden van Hoch_5815-peptiden aan het substraatoppervlak en de lineaire binding van de peptiden met naburige peptiden, hoewel wordt aangenomen dat dat intra-hexameer interacties waarschijnlijk sterk zijn [5]. Het gedetailleerde mechanisme dat ten grondslag ligt aan de variabiliteit van de aggregatie van schaaleiwitten moet nog verder worden opgehelderd.

Vorming en dynamiek van vezelachtige structuren samen met de schaalplaatassemblages onder HS-AFM. een Verschijning van vezelachtige structuren tijdens de demontage van schaalplaten samengesteld uit Hoch_5815 hexameren, zoals getoond door AFM-beeldreeksen. b AFM-topografie van vezelstructuren. c Doorsnede-analyse (stippellijn in paneel b ) onthult een afstand van 3,72 ± 0,31 nm (n = 30) tussen aangrenzende vezelstructuren, en de gemiddelde hoogte is 2,46 ± 0,22 nm (n = 30). d AFM-topograaf van schaalpatches samengesteld uit Hoch_5815 hexameren. e Doorsnede-analyse (stippellijn in paneel d ) laat zien dat de gemiddelde hoogte van Hoch_5815 hexameren 3,45 ± 0,16 nm is (n = 25). v De vezelachtige structuren vertonen een verminderde hoogte in vergelijking met vlakke platen bestaande uit Hoch_5815 hexameren (*p < 0,05, tweerichtings-ANOVA). g Voorgestelde organisatie en vorming van de vezelachtige structuur, die een reeks Hoch_5815-monomeren vertegenwoordigt

Discussie

BMC's omvatten honderden eiwitten die zichzelf assembleren om de hoger geordende structuren te vormen. De BMC-schaal, bestaande uit talrijke eiwithomologen, is een ideaal systeem voor het bestuderen van zelfassemblage en interacties van eiwitten. Als een krachtige techniek voor het analyseren van biomembraanorganisatie, eiwitassemblage en fysieke interacties die zeer relevant zijn voor de fysiologische rollen van biologische systemen [32, 35, 38, 39], is AFM gebruikt om de organisatie en zelfassemblagedynamiek van BMC-schileiwitten en de architecturen en mechanische kenmerken van BMC-structuren [12, 30, 31, 40,41,42]. Dit werk vertegenwoordigt, voor zover wij weten, de eerste kwantitatieve bepaling van de zelfassemblagedynamiek van BMC-schaaleiwitten bij de vorming van tweedimensionale platen als reactie op veranderingen in de omgeving met behulp van AFM. De resultaten benadrukken de inherente variabiliteit en omgevingsafhankelijkheid van zelfassemblage van BMC-H-eiwitten. Vergeleken met EM en DSL vertoont AFM een groot potentieel bij het in realtime volgen van de dynamische acties van de zelfassemblage van BMC-eiwitten met moleculaire details.

Eiwit-eiwit-interacties zijn van groot belang bij het vormen en vormgeven van de BMC-schaal [10]. De eiwitconcentratie is ook gedocumenteerd als een kritische factor voor het aansturen van schelpvorming [41, 43]. Bovendien hebben in vitro oplosbaarheidsstudies aangetoond dat pH en ionsterkte in oplossing de structurele stabiliteit van BMC's [17, 27] kunnen beïnvloeden, evenals het assemblagegedrag van BMC-schaaleiwitten bij de vorming van tweedimensionale vellen [37, 41] ], nanobuisjes [13, 17] en nanokooien [28], die doen denken aan hun impact op de assemblage van viruscapsides [44, 45]. We vonden ook eiwitprecipitatie en er werden geen patches gevormd bij pH > 10 en < 3 of de zoutconcentratie < 10 mM of> 600 mM (niet-gepubliceerde gegevens). Hier hebben we verder aangetoond dat de assemblagetendens en -dynamiek afhankelijk zijn van pH en zoutconcentratie. Hoewel schaaleiwitten zichzelf kunnen assembleren bij een breed pH-bereik, lijkt de neutrale pH-omgeving in staat te zijn de assemblagedynamiek te verbeteren (figuur 2b). Kationen met een concentratie van ≥ 300 mM bleken de vorming van tweedimensionale platen te bevorderen; 400 mM kationen lijken wenselijk te zijn voor de vorming van grote en stabiele enkellaagse platen (Fig. 3). Deze omstandigheden komen overeen met de cytosolische omstandigheden van bacteriële cellen en zijn fysiologisch relevant. Onder de meeste fysiologisch relevante omstandigheden kan bijvoorbeeld de pH van de E. coli cytosol is ongeveer 7,4-7,8 [46] en de ionenconcentratie is ongeveer 100-400 mM, wat van vitaal belang is voor eiwitinteracties, eiwit-ligandbinding, signalering, het in stand houden van elektrostatische membraanpotentialen en eiwitgradiënt over membranen [47, 48]. Hoewel de manier waarop interacties tussen monsters en het micasubstraat de zelfassemblage van BMC-eiwitten beïnvloeden, nog verder moet worden onderzocht, biedt AFM-beeldvorming ons de mogelijkheid om de dynamische veranderingen van de zelfassemblage van BMC-eiwitten in reactie op omgevingsvariaties kwantitatief te analyseren.

De omgevingsafhankelijke assemblagedynamiek van BMC-eiwitten bij de vorming van schaalfragmenten die hier worden beschreven, kan hun gedrag bij de vorming van de gehele BMC vertegenwoordigen. In feite lijken de 3D BMC-structuren de dynamisch onderhouden organellen te zijn die in de natuur zijn ontworpen. BMC's vertonen opmerkelijke structurele flexibiliteit en heterogeniteit; de mechanische zachtheid van BMC-schaalstructuren bepaald door AFM-nano-indentatie [30] en de niet-evenwichtsdynamiek van BMC-assemblage onthuld door computationele simulaties [49] benadrukten de verschillen tussen BMC en robuuste virusassemblages. Evenzo is opgehelderd dat de biosynthese van carboxysomen correleert met licht en chaperons [50, 51]. Zeer recent is aangetoond dat CcmK3 en CcmK4 heterohexameren kunnen vormen en zich op een pH-afhankelijke manier op de carboxysoomschil kunnen hechten, wat mogelijk een middel biedt voor het reguleren van de permeabiliteit van de carboxysoomschil en CO₂ assimilatie in de zeer dynamische micro-omgeving [52]. Het exacte mechanisme dat ten grondslag ligt aan hoe omgevingsomstandigheden in oplossing de thermodynamische assemblage van BMC-eiwitten beïnvloeden, moet nog worden onderzocht, bijvoorbeeld met behulp van een combinatie van experimentele studies en computersimulaties.

Gezien de zelfassemblage van BMC-structuren, is er een aanzienlijke interesse in de engineering van BMC's en het ontwerp van nieuwe BMC-gebaseerde nanobioreactoren, moleculaire steigers en biomaterialen in biotechnologische toepassingen, bijvoorbeeld het verbeteren van het celmetabolisme, de inkapseling van enzymen, moleculaire levering en therapie . Geavanceerde kennis over de structurele veerkracht en variabiliteit van BMC's als reactie op veranderingen in de omgeving zal niet alleen strategieën opleveren voor het produceren van robuuste op BMC gebaseerde nanostructuren in heterologe gastheren, d.w.z. E. coli of planten [31, 53, 54], maar effenen ook de weg voor het moduleren van de vorming van 2D-nanomaterialen en het openen en sluiten van op BMC-schaal gebaseerde eiwitkooien, waardoor de functionele regulatie en gerichte moleculaire levering worden vergemakkelijkt. Eerder hebben we de haalbaarheid aangetoond van het gebruik van genetische modificatie om de specifieke contacten op de interfaces van shell-eiwitten en hun zelfassemblagegedrag te manipuleren [12]. Deze studie versterkt onze toolbox voor het beoordelen en manipuleren van BMC-schaal zelfassemblage in verschillende omgevingen.

Conclusies

Samenvattend hebben we HS-AFM gebruikt om het kwantitatieve onderzoek naar de zelfassemblage van BMC-schaaleiwitten onder verschillende pH- en zoutomstandigheden uit te voeren. Aangetoond werd dat de vorming van grotere enkellaagse pleisters van schelphexameren bevorderd werd bij een zoutconcentratie van 400 mM, en een neutrale pH resulteerde in een hogere dynamische snelheid van zelfassemblage van hexameer. De organisatorische overgang van shell-eiwitten van hexamere assemblages naar vezelachtige arrays werd ook gevisualiseerd. Deze studie illustreerde dat omgevingscondities een belangrijke rol spelen bij het bepalen van de organisatie en zelfassemblage van BMC-schaaleiwitten.

Afkortingen

BMC:: Bacterieel microcompartiment
BMC-H:: Bacterieel microcompartiment hexameer
BMC-P:: Bacteriële microcompartiment pentameer
BMC-T:: Bacteriële microcompartimenttrimeer
DSL:: Dynamische lichtverstrooiing
E. coli :: Escherichia coli
EM:: Elektronenmicroscopie
HS-AFM:: Atomaire krachtmicroscopie met hoge snelheid

Atomaire laagafzetting bij lage temperatuur van SiO2 met behulp van koolstofdioxide Diëlektrische verbetering van door atoomlaag afgezette Al2O3/ZrO2/Al2O3 MIM-condensatoren door middel van microgolfgloeien

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal