Gemodificeerde Fe3O4 magnetische nanodeeltjesafgifte van CpG remt tumorgroei en spontane longmetastasen om immunotherapie te verbeteren

Resultaten

Voorbereiding en karakterisering van FeNP/CpG-deeltjes

Om een ​​magnetisch deeltje voor CpG-afgifte met lage cytotoxiciteit te ontwikkelen, Fe₃ O₄ deeltjes werden gesynthetiseerd met behulp van de co-precipitatiemethode zoals weergegeven in figuur 1a. Het enten van de aminopropylsilaangroepen (–O)3Si–CH2-CH2-CH2-NH2 van APTES op het oppervlak van Fe₃ O₄ om FeNP-deeltjes te vormen (figuur 1b). Negatief geladen CpG (CpG) bindt aan effectieve functionele groepen die door de APTES worden geleverd om FeNP / CpG-deeltjes te vormen door elektrostatische interacties zoals schematisch weergegeven in figuur 1c. Gebaseerd op de dynamische lichtverstrooiingsmeting, de grootte van de voorbereide Fe₃ O₄ deeltjes was 10,7 ±  4,1 nm (figuur 2a). Zoals waargenomen door TEM (Fig. 2b) en SEM (Fig. 2c), Fe₃ O₄ ontwikkeld in dit werk vertoonden een uniforme en bijna bolvormige vorm. De dynamische diameter van APTES-gemodificeerd Fe₃ O₄ deeltjes was 34,5 ± 5,0 nm (Fig. 2d), wat goed overeenkwam met de TEM-resultaten (Fig. 2e).

Bereiding van FeNP/CpG-deeltjes. een Vergelijking van synthese van Fe₃ O₄ magnetische deeltjes met behulp van de co-precipitatiemethode. b Hydrolyse- en condensatiereacties met productie van silaanpolymeer en silanisatiereactie van APTES op het magnetietoppervlak om FeNP-deeltjes te vormen. c Schematisch diagram van de FeNP/CpG-deeltjes. CpG wordt door elektrostatische interacties aan het oppervlak van de FeNP's gebonden om FeNP/CpG-deeltjes te vormen

Karakterisering van FeNP/CpG-deeltjes. een Grootteverdelingsspectrum van Fe₃ O₄ deeltjes. b Transmissie-elektronenmicroscopisch beeld (TEM) van Fe₃ O₄ . c Scanning elektronenmicroscopie beeld van Fe₃ O₄ deeltjes. d Grootteverdeling van met APTES gecoat Fe₃ O₄ (FeNP) deeltjes. e Het TEM-beeld van FeNP-deeltjes. v Het CpG-bindingsvermogen van FeNP's bepaald door gelvertragingstest. Alle gegevens vertegenwoordigen drie onafhankelijke experimenten

Om het bindingsvermogen van FeNP-deeltjes aan CpG te illustreren, werd een gelvertragingstest uitgevoerd (figuur 2f). Toen de molaire verhouding van FeNP met CpG 10:1 was, werd geen heldere CpG-band waargenomen, wat aantoont dat de negatief geladen CpG volledig kan worden geadsorbeerd door FeNP-deeltjes door elektrostatische interacties na elektroforese. Daarom hebben we die receptratio gekozen voor verdere toepassing in ons onderzoek. Samen toonden deze resultaten aan dat CpG succesvol kan worden gecombineerd op het oppervlak van FeNP's door middel van elektrostatische interacties, wat stabiliteit en een kleine dimensie laat zien.

Levensvatbaarheid van cellen en transfectie van FeNP/CpG-deeltjes in vitro

Om de biofysische karakterisering in vitro verder te beschrijven, hebben we de cytotoxiciteit van FeNP's in 293T-, 4T1- en C26-cellen gedetecteerd op het punt van 24 uur of 72 uur (figuur 3a). Er was geen duidelijke dosisafhankelijke relatie tussen de levensvatbaarheid van de cellen en FeNP-deeltjes in de 293T-, C26- en 4T1-cellen. Het celoverlevingspercentage was meer dan 80% na 24 uur en 60% na 72 uur op drie soorten cellen, zelfs bij een FeNP-concentratie van 1,25 mg/ml. Deze resultaten bewezen de biocompatibiliteit van FeNP-deeltjes, zowel voor normale cellen (293T) als voor tumorcellen (C26, 4T1).

Cytotoxiciteit en opnameactiviteit van FeNP/CpG-deeltjes in vitro. een MTT-test. We hebben de levensvatbaarheid van 293T-, 4T1- en C26-cellen gedetecteerd na behandeling met verschillende concentraties FeNP-deeltjes gedurende 24 uur of 72 uur. Er was geen significant verschil in cellevensvatbaarheid bij elke dosis FeNP's. b , c De detectie van FeNP/CpG-opname in BMDC's. BMDC's bereid na GM -CSF behandeling gedurende 7 dagen werden gedurende 1 of 3 uur getransfecteerd met CpG-FITC of FeNP-geleverd CpG-FITC voordat het intensief werd gewassen, gefixeerd en gelabeld met DAPI. Beelden werden vastgelegd door laser scanning confocale microscopie (LSCM). Vergeleken met die van vrij FITC-gelabeld CpG, de FeNP/CpG met verbeterde fluorescentie-intensiteit (b ) en transfectie-efficiëntie waren statistisch significant (c ). Deze gegevens waren representatief voor drie onafhankelijke experimenten, de gemiddelde ± standaardfout; *P < 0,05, *P < 0,01 en ***P < 0,001 vs de onbehandelde groep

Dendritische cellen als belangrijkste receptorcellen voor CpG spelen een belangrijke rol in een antitumorale immuunrespons die wordt gemedieerd door TLR9. CpG als een krachtig type 1-polariserend adjuvans induceert DC's om een ​​immuunrespons in de tumor te activeren door chemokinen en cytokinen uit te scheiden. Daarom is de efficiënte levering van CPG in DC-cellen cruciaal om een ​​antitumorrespons te bereiken. In onze studie werden FITC-geconjugeerde CpG gebruikt om het afgiftevermogen van FeNP-deeltjes aan DC's in vitro te onderzoeken. Na 1 of 3 uur na transfectie, via laser scanning confocale microscopie (LSCM), was de cellulaire fluorescentie-intensiteit in de met FITC geconjugeerde CpG-gecoate FeNP-deeltjes (FeNP/CpG-FITC) behandelde groepen hoger dan die voor de equivalente hoeveelheid vrije CpG-groepen (Fig. 3b). De FeNP/CpG-FITC-deeltjes waren in staat om na 1 uur tot 18,3% van de DC's te transfecteren. Vervolgens, 3 uur na transfectie, nam de verhouding van de positieve cellen toe tot 39,2% (figuur 3c). Ondertussen kon met betrekking tot de vrije FITC-geconjugeerde CpG-behandelde cellen zelfs 3 uur na transfectie minimale fluorescentie worden waargenomen, met minder dan 10% transfectie. Er wordt dus gesuggereerd dat het leveren van CpG door FeNP-deeltjes de cellulaire opname van CpG verhoogde.

FeNP's leveren CpG aan xenotransplantaat en remmen tumorgroei en spontane longmetastasen in vivo

De antikankeractiviteit van CpG / FeNP-deeltjes werd voor het eerst geëvalueerd in C26-darmkanker- en 4T1-borstkanker-subcutane transplantatietumormodellen in vivo. Wanneer het tumorvolume ongeveer 50 mm was ³ , werden de muizen willekeurig verdeeld in vier groepen om de behandeling te starten (n = 10). Muizen werden gedurende het hele experiment driemaal behandeld met een intratumorale injectie van CpG / FeNP-deeltjes (figuur 4a). In onze studie resulteerde intratumorale injectie van FeNP/CpG-deeltjes in een significante remming van xenograft-tumorgroei in vergelijking met die van de controlegroepen, en de remming bedroeg tot 69% (P < 0,05 versus NS) (Fig. 4b). Vergeleken met de behandelingsgroep met normale zoutoplossing (NS) (0,90 ± 0,08 g) en de FeNP-groep (0,81 ± 0,03 g), ondervonden de met FeNP/CpG-deeltjes behandelde groepen een statistisch significante vermindering van het tumorgewicht (0,38 ± 0,03 g, P < 0,001). Ter vergelijking:de vrije CpG-groep vertoonde een minimaal antikankervermogen (0,68 ±  0,03 g) (figuur 4c). Bovendien ontwikkelden muizen in de PBS-controlegroep uitgebreide longmetastasen, in vergelijking vertoonden die behandeld met de FeNP / CpG-deeltjes een afname van 64,1% in het aantal tumorknobbeltjes in de long (Fig. 4d, e), wat de kracht aantoont van de FeNP/CpG-deeltjes bij de behandeling van uitgezaaide tumoren. Zoals getoond in Fig. 4f, vertoonde H &E-kleuring van de long een verminderde longbelasting met duidelijk longmetastasen na FeNP / CpG-behandeling dan andere groepen. Deze resultaten geven aan dat FeNP-afgifte van CpG in 4T1-cellen niet alleen de 4T1-tumorgroei significant remde (P < 0,001 versus NS), maar onderdrukte ook de uitzaaiing van borstkanker naar de longen.

Antitumorvermogen van FeNP/CpG-deeltjes in vivo. een Behandelingsschema van antitumor door FeNP / CpG-deeltjes zowel in C26-darmkanker- als 4T1-borstkanker-xenotransplantaatmodellen via intratumorale injectie in vivo. b –d Behandeling met FeNP/CpG-deeltjes remde de groei van 4T1-tumoren. b Representatieve tumorgroeicurven van het 4T1-tumormodel. c Gemiddeld tumorgewicht. d Gemiddelde longtumorknobbel in elke groep die duidelijk longmetastase laat zien na FeNP/CpG intratumorale injectie. e , v Brightfield-beeldvorming en H&E-kleuring van de longen:e Het aantal zichtbare longmetastasen, pijlen geven longmetastasen aan. v H &E-kleuring van de longmetastase. Schaalbalken, 100 μm voor H &E-kleuring. g , u FeNP/CpG-deeltjes remden significant de groei van C26-xenotransplantaattumoren:e tumorgroeicurven van elke groep tijdens het experiment en f gemiddeld tumorgewicht. Er waren 10 muizen in elke groep. g Tumor re-challenge experiment. ik In het C26-model werden muizen die waren genezen met FeNP/CpG-behandeling opnieuw uitgedaagd met 5 × 10 ⁵ C26 (rechter flank) of 4T1 cellen (linker flank) s.c. in twee afzonderlijke plaatsen aan de andere kant van de flank zonder verdere behandeling. De getoonde afbeeldingen zijn representatieve muizen 20 dagen na het opnieuw uitdagen van de tumor. Alle gegevens waren representatief voor drie onafhankelijke experimenten, het gemiddelde   ±  SEM; *P < 0,05, *P < 0,01 en ***P < 0,001

Evenzo werd een significant versterkt antitumoreffect met FeNP/CpG-behandelingsgroepen waargenomen in het subcutane model van C26-geïncubeerde muizen. Zoals weergegeven in Fig. 4g, groeide de tumor snel in de controlemuizen, de vehikelgroep en de CpG-groep, met gemiddelde tumorvolumes van ongeveer 2300 ± 239,4 mm ³ , 2116,7 ± 360,9 mm ³ , en 1353,3 ± 158,9 mm ³ respectievelijk op dag 31. Daarentegen was in de FeNP/CpG-groep de tumorgroei extreem geremd, met een gemiddeld tumorvolume van ongeveer 153,7 ± 62,7 mm ³ (P < 0,01 versus NS) en een remmingspercentage van 94,4%. De tumoren leken langzaam te groeien na de eerste behandeling en een deel van de tumoren begon geleidelijk te verdwijnen na het einde van de drie behandelingen. Nog belangrijker is dat in de FeNP/CpG-deeltjesbehandelingsgroepen de tumoren in bijna de helft van de muizen aan het einde van het experiment volledig waren verdwenen. Zoals getoond in Fig. 4h, had de FeNP/CpG-behandelingsgroep een veel lager gemiddeld tumorgewicht dan dat van de andere groepen (P < 0,001):FeNP/CpG-behandelingsgroep (0,14 ± 0,08 g), NS-groep (2,41 ± 0,26 g), FeNP-groep (2,50 ± 0,4 g) en CpG-groep (1,44 ± 0,32 g). Om te bepalen of FeNP / CpG-deeltjes voldoende waren om de specifieke antitumorrespons te mediëren, werd een tumor-rechallenge-experiment verwerkt in het C26-model (figuur 4i). De muizen waarvan de tumoren volledig regressief waren na de FeNP/CpG-deeltjesbehandeling in het C26-darmkankermodel, werden subcutaan geïnoculeerd met 4T1- en C26-tumoren op verschillende posities op de BALB/c-muizen en er werd geen verdere behandeling gegeven. Alle 4T1-tumoren groeiden snel en hun volumes overtroffen de 1000 mm3 op dag 20 na de challenge. Daarentegen waren er solide tumoren die onzichtbaar waren voor het blote oog in het C26-model, wat suggereert dat de FeNP/CpG-deeltjesgroepen een specifieke antitumorrespons stimuleerden. Deze resultaten suggereerden dat de intratumorale injectie van FeNP/CpG-deeltjes de groei van een subcutane xenotransplantaat.

FeNP/CpG-deeltjes stimuleren verbeterde systematische antitumor-immuunrespons

De in vivo antitumormechanismen van FeNP/CpG-deeltjes in de bovenstaande twee modellen werden verder bestudeerd. Om het type immuunrespons te bestuderen, hebben we de ELISpot-assay toegepast om de IFN-γ/IL-4-niveaus van de milt van de muis te analyseren. Als het IFN-γ-niveau in miltlymfocyten (met erytheem op het ELISpot-bord) significant hoger is dan het IL-4-niveau (met blauwe vlekken op het ELISpot-bord), was het type immuunrespons dat werd gestimuleerd Th1, namelijk om CD8 + T-lymfocyten en vooral de CTL-respons van het lichaam. Anders was het type immuunrespons Th2, namelijk om voornamelijk CD4 ⁺ . te activeren T-lymfocyten, waardoor B-lymfocyten worden gestimuleerd en antigeenspecifieke antilichamen worden geproduceerd. Een tweekleurige ELISpot-assay werd uitgevoerd om de expressie van IFN-γ en IL-4 in verschillende behandelingen te meten (Fig. 5a). Vergeleken met dat in de andere drie groepen had het aantal vlekvormende cellen (SFC's) van IL-4 en IFN-γ uitgescheiden door miltlymfocyten van muizen een stijgende trend in de FeNP/CpG-deeltjesbehandelingsgroep, en het aantal SFC's het uitscheiden van IFN-γ was 1,5 keer groter dan dat voor IL-4 (P <-0,05), wat een verhoogde antitumor cellulaire immuunrespons impliceerde na intratumorale injectie met FeNP/CpG-deeltjes. Bovendien werd het serum van de met NS, FeNP, CpG en FeNP/CpG behandelde muizen geanalyseerd met behulp van een ELISA-assay op de aanwezigheid van totaal tumorspecifiek IgG na drie immunisaties. In het C26-tumormodel was er, hoewel FeNP/CpG-geïmmuniseerde muizen significant hogere titers van tumorspecifiek IgG ontwikkelden dan die in andere groepen (Fig. 5b), geen statistisch verschil tussen FeNP/CpG-geïmmuniseerde muizen en CpG-geïmmuniseerde muizen. .

The mechanism of antitumor immune response. een ELISpot assay. Splenocytes were harvested from NS or treated mice after the final treatment, and ELISpot assays were performed using the mice IFN-γ/IL-4 Dual-Color ELISpot kit in the C26 xenograft model. b In the C26 model, serum antibody titers in tumor-bearing mice treated by FeNP/CpG particles were tested using an ELISA assay. Each symbol represents an individual mouse, and horizontal lines indicate the median as determined by Mann–Whitney U testen. c CTL assays. The cytotoxicity of splenocytes against C26 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay. d Representative immunofluorescence images showing infiltrating immune cells in tumor tissues in each group. The FeNP/CpG particles treatment groups with enhanced CD4 ⁺ T, CD8 ⁺ T and NK (CD57 ⁺ ) cell infiltration in tumors compared to that of other groups. e The cytotoxicity of splenocytes against 4T1 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay

To assess the cell-mediated immune response stimulated by the FeNP/CpG, CTL activity was assessed using the 51Cr release assay on C26 and 4T1 cells ex vivo (Fig. 5c, e). When the killing activity of CTL was at a 100:1 ratio of effector cells to target cells, in the C26 cells, the effectors in the FeNP/CpG groups showed 8.2-fold more tumor-killing activity than that in the NS group and 9.7-fold and 1.7-fold more than that in the FeNP and CpG groups (P  < 0.05 versus NS) (Fig. 5c). Similarly, this observation was coincident with the result in the 4T1 cells; the FeNP/CpG group had 7.4-fold more tumor-killing activity than that of the NS group and 6.6-fold and 1.4-fold more than that of the FeNP and CpG groups (P  < 0.01 versus NS). These results illustrated that compared to that of free CpG, the use of APTES-coated Fe₃ O₄ to deliver CpG can stimulate a more intense humoral immune response and result in a better antitumor efficiency in vivo.

The FeNP/CpG Increases Infiltrating Lymphocytes in Tumors and Alters Tumor Microenvironments

Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), a primary immune component infiltrating solid tumors, are considered the manifestation of the host antitumor reaction. Immunofluorescence analyses were performed to study TILs in tumors. The intensity of infiltration by CD4 ⁺ T cells, CD8 ⁺ T cells and CD49B ⁺ NK cells was studied (Fig. 5d). There was a significant increase in the intensity of infiltration of NK cells, CD4 ⁺ T cells, and CD8 ⁺ T cells in tumors from the FeNP/CpG groups compared with that in the FeNP, CpG, and NS groups (P  < 0.005), which suggests that FeNP/CpG not only stimulates a higher immune response but also alters the tumor microenvironment by activating more immune cells into the tumor tissues. During the entire experiment, the mouse body weight and state were observed, and there was no piloerection, poor appetite, weight loss, or abnormal behavior in the C26 xenograft model (Fig. 6a). As shown in Fig. 6b, no significant pathological changes in heart, liver, spleen, lung, or kidney were observed through HE analysis. No histopathological changes and changes of body weight were observed in the 4T1 subcutaneous xenograft model (data not shown). Overall, our data suggested that the developed FeNP particles for CpG delivery were capable of treating cancer and inhibiting tumor metastasis with high safety.

Safety and toxicity evaluation of FeNP/CpG formulation. (een ) Body weight changes in NS, FeNP, CpG, and FeNP/CpG groups. b The section of the heart, liver, spleen, lung, and kidney in each group was collected and stained with H&E staining. No significantly pathological changes were observed in any group (magnification, × 200)