Verbeterde plasmonische biosensoren van hybride gouden nanodeeltjes-grafeenoxide-gebaseerde labelvrije immunoassay

Resultaten en discussie

Structuur- en morfologieanalyse

De grootte van de AuNP's was afhankelijk van de aard van het reductiemiddel en de omstandigheden van vorming en opslag. De SEM-analyse gaf aan dat de GO-vellen en AuNP's uniform op het GO-oppervlak waren bevestigd, met een gemiddelde AuNP-grootte van 60 nm (figuur 3). Figuur 3a toont SEM-afbeeldingen van de GO-vellen op de Au-film en dat de GO-vellen minder dan 1 m waren. Door GO en AuNP-GO te vergelijken, kon een gouden element worden waargenomen in de AuNP-GO-composiet. Dit gaf aan dat de AuNP's met succes waren geadsorbeerd op het gerimpelde GO-oppervlak. De gesynthetiseerde AuNP-GO-hybriden werden gekarakteriseerd met behulp van TEM zoals weergegeven in figuur 3b. Figuur 3b, c toont de synthesevoorwaarden. De concentratie van 10 ml GO-veloplossing was 0,1 g/l en 200 μl AuNP-oplossing had een concentratie van 2,2 nM. De TEM-afbeeldingen in figuur 3a met een schaalbalk van 100 nm en figuur 3b met een schaalbalk van 0, 5 m tonen verschillende amplificaties van de grootte en laten duidelijk zien dat de AuNP's geïmmobiliseerd waren op het oppervlak van de GO-vellen. De AuNP's hadden een bolvorm, wat suggereert dat de carboxylfunctionaliteit op het oppervlak van de GO-vellen een belangrijke rol kan spelen bij de vorming van chemische covalente bindingen met de AuNP's, zoals weergegeven in figuur 2b.

Oppervlaktemorfologieanalyse van het nanocomposiet. een SEM-afbeeldingen van een GO-blad en b TEM-beeld van AuNP-GO-composiet. c Het TEM-beeld van de ERGO AuNP-GO-film

Kenmerken van GO door XPS-, Raman- en FTIR-spectroscopie

Afbeelding 4a toont de C 1s XPS-spectrale analyse met hoge resolutie van de GO-bladen. De C1's met de hoogste intensiteit bij een bindingsenergie van 284,6 eV kwamen overeen met carbonyl-functionele groepen voor C-C (sp2), en de pieken bij 285,6, 286,6, 288,2 en 289,4 eV kwamen overeen met C-C (sp3) in aromatische ringen , C–O in respectievelijk hydroxyl- en epoxygroepen, C=O in carbonylgroepen en O–C=O in carboxylgroepen. De C 1s XPS-spectra van de GO-vellen op een goudfilmsubstraat toonden aan dat de relatieve atoompercentages van C–C (sp2), C–C (sp3), C–O, C=O en O–C=O waren respectievelijk 77,44, 2,16, 18,14, 1,77 en 0,49% [66]. Afbeelding 4b toont de Raman-spectrale analyse van de GO-vellen in NaCl-oplossing met spectrale kenmerkpieken bij 1614 cm ^− 1 (G-band), 1355 cm ^− 1 (D-band), 2714 cm ^− 1 (2D-band), 2947 cm ^− 1 (G + D-band), en ~ 3240 cm ^− 1 (2D'-band) [38, 67]. De vorming van de GO-vellen werd verder geanalyseerd om de eigenschappen van verschillende geoxygeneerde soorten op te helderen met behulp van ATR-FTIR-spectra zoals weergegeven in figuur 4c. Deze ATR-FTIR-spectra onthulden ook verschillende karakteristieke pieken van GO; C–O op 850 cm ^− 1 vanwege (C–O–C) epoxidetrillingen, C–O bij 1080 cm ^− 1 vanwege (C–O) alkoxy-rektrillingen, C=C bij 1500~1600 cm ^− 1 vanwege aromatische C=C-bindingen en C–O bij 1260 cm ^− 1 door (C–O–C) epoxide asymmetrische trillingen. De carboxylgroepen aan de randen van de GO-vellen vertoonden –COOH-rektrillingen, met pieken op 1652 en 1731 cm ^− 1 overeenkomend met C=O strektrillingen van carbonylgroepen. De spectra vertoonden ook drie pieken op 2900 cm ^− 1 gerelateerd aan asymmetrische en symmetrische rektrillingen van –CH₂ en een vervormingspiek van 1462 cm ^− 1 vanwege alkeengroepen (C-H) in het vlak van GO. FTIR-spectra van GO vertoonden een groot bereik aan absorptiebreedbandpieken van C–OH en H₂ O trillingen bij 3370 cm ^− 1 door rektrillingen [67].

Spectrale analyse van GO-bladen. een XPS-scan met hoge resolutie in de C1s-regio, b Raman en c FTIR

Analyse van GO en AuNP met eiwitinteractie-eigenschappen

UV-vis-spectra van waterige GO- en AuNP's met eiwitinteractie-dispersies worden weergegeven in Fig. 5. De AuNP's hadden hoge extinctiecoëfficiënten en een unieke grootte, afhankelijk van de absorptiebanden van het oppervlakplasmon (SP). De gemodificeerde AuNP's van twee verschillende dimensies waren 15 en 60 nm voor 520 en 540 nm SP-absorptiespectra [68, 69]. Figuur 5a toont de AuNP-oplossing (520 nm) gemodificeerd met Cys in een concentratie van 5 mM met de AuNP-Cys-extinctieband [69]. De UV-vis-spectra van waterige GO-dispersies leverden twee absorptiepieken op:het maximum bij 230 nm komt overeen met de π–π*-plasmonpiek van aromatische C–C-bindingen in aromatische sp2-clusters van verschillende grootte, en de schouder bij 300 nm komt overeen met de n-π* plasmonpiek vanwege de aanwezigheid van epoxide- en carbonyl (C=O) bindingen (Fig. 5b) [9, 20]. De UV-vis-spectra van GO-EDC/NHS en GO-EDC/NHS-BSA-oplossing (Fig. 5b) toonden aan dat GO-EDC/NHS en GO-EDC/NHS-BSA een piek vertoonden bij ongeveer 270 nm, wat waarschijnlijk vanwege sterke interacties tussen GO en aminegroepen [70, 71]. Figuur 5c toont de absorptiespectra van de bindingen voor verschillende concentraties antiBSA met AuNP's (60 nm). Figuur 1b toont de syntheseoplossing van de AuNP-antiBSA-probe (monster B1). De golflengten hadden duidelijke absorptiepieken bij 540 en 755 nm, waarbij de golflengte bij 540 nm voornamelijk werd veroorzaakt door de AuNP's (60 nm), en de piek bij 755 nm correspondeerde met een AuNP+Cys+antiBSA combinatie-absorptiepiek. Dit resultaat toonde aan dat een toename van de antiBSA-concentratie een geleidelijke toename van de absorptie bij 540 nm en een continue toename van de bijna-IR-absorptie bij 755 nm veroorzaakte. De verschillende antiBSA-bindende interacties aan het oppervlak van de AuNP's veroorzaakten veranderingen in de oppervlaktebrekingsindex, die op zijn beurt werd omgezet in absorptie-intensiteit van de LSPR. De LSPR-band werd beïnvloed door de deeltjesgrootte. De AuNP's vertoonden sterke SPR-banden in het zichtbare gebied. Met verhogingen van de brekingsindex van de middelgrote deeltjes, zou de verschuiving in SPR-piekposities kunnen worden afgestemd van het zichtbare naar het nabij-infrarood. In de experimentele resultaten van eiwitinteractie hebben we AuNP-antiBSA gemengd zoals weergegeven in Fig. 5d. De gevoeligheid werd bepaald door de LSPR-golflengte van de 500-760 nm-band uit te zetten als een functie van de gemeten brekingsindex. We gebruikten vervolgens verdunningen van verschillende concentraties antiBSA-eiwit van 1,45 nM tot 145 fM en mengden ze in een volume van 200 μl. De veranderingen in 540 en 760 nm absorptie werden veroorzaakt door de verschillende concentraties antiBSA en AuNP. Vervolgens werden 5 minuten later spectrale metingen gedaan, die verschillende concentraties van absorptie van lichtintensiteit vertoonden, en een absorptiepiek van 60 nm voor de AuNP's werd waargenomen bij 540 en 755 nm. Deze resultaten waren consistent met de AuNP-antiBSA-absorptiekalibratiecurven. De kalibratiecurves zijn aangebracht door y = 2,43 + 0,25× (correlatiecoëfficiënt, R ² = 0,91) voor de absorptiepiek van 540 nm, en y = 2.56 + 0.31× (correlatiecoëfficiënt, R ² = 0,96) voor de 760 nm absorptiepiek, waarbij x is de concentratie van antiBSA en y is de optische absorptie.

Analyse van UV-vis-absorptiespectra voor AuNP met antiBSA-interactierespons. een SP-absorptiespectra van AuNP's, b GO-gebonden BSA, c AuNP-anti-BSA-sonde, en d Kalibratiecurves voor AuNP met antiBSA-interactierespons bij verdunning verschillende concentraties antiBSA-eiwit van 1,45 nM ~ 145 fM

Analyse van AuNP-antiBSA en AuNP-GO-antiBSA op basis van immunoassay-interacties

Om het immunologische detectiemechanisme van GO- en AuNP-GO-nanocomposieten te begrijpen, werd spectrale analyse voor bindingsreacties uitgevoerd zoals weergegeven in Fig. 6. Figuur 6a toont de UV-vis-absorptiespectra van de AuNP-GO- en GO-BSA-nanocomposieten. Voor de GO-sheet (0,1 g/l)-oplossing was er een piek bij ongeveer 230 nm [70] en een schouder bij ongeveer 300 nm, en de GO-BSA-conjugaten vertoonden een absorptiepiek bij ongeveer 270 nm en een piek bij ongeveer 230 nm [9, 20, 70]. In de combinatie van AuNP-GO-nanocomposieten werden drie absorptiepieken waargenomen bij respectievelijk 230, 300 en 540 nm. De π–π-stapeling of covalente bindingsinteracties tussen AuNP's en het GO-bladoppervlak waren de belangrijkste drijvende kracht die de AuNP's verankerde op de zeer biocompatibele GO-materialen. De GO-vellen zijn gemaakt om samen te komen in de AuNP's, wat resulteert in een sterke absorptieband van 200-300 nm. Daarom was de absorptie van de GO-vellen veel groter dan de absorptie van AuNP's in de zichtbare lichtband. Figuur 6b laat zien dat de UV-vis-spectra van de AuNP-absorptiepiek bij 540 nm waren [50, 68, 69]. De absorptiepieken waren bij 540 en 660 nm voor AuNP+Cys-conjugaten; 230, 300, 540 en 660 nm voor AuNP+Cys+GO-conjugaten; en 230, 270, 540 en 660 nm voor AuNP+Cys+GO+antiBSA-conjugaten. De GO-platen hadden twee absorptiepieken bij 230 nm (π–π* plasmonpiek) en 300 nm (n–π* plasmonpiek). Er werd een verschuiving in de absorptiegolflengte opgemerkt en deze absorptieverschuiving werd beschouwd als bevestiging van antiBSA (0 fM ~ -1,45 nM) absorptie op het AuNP + Cys + GO-oppervlak. Figuur 6c toont de synthese van de oplossing van de AuNP+Cys+GO+antiBSA-probe (monster B2) zoals in figuur 2b. De toename van de antiBSA-concentratie was relatief hoog bij 540 nm. Figuur 6c toont verschillende concentraties van absorptie van lichtintensiteit en een absorptiepiek van 60 nm voor de AuNP's werd waargenomen bij 540 nm. De toename van de antiBSA-concentratie was relatief hoog bij 540 nm. Dit resultaat toonde aan dat AuNP-GO de plasmonabsorptie-eigenschappen bij 540 nm kon verbeteren wanneer de antiBSA-concentratie werd verhoogd. Bovendien hebben we in het immunoassay-experiment het GO-BSA (1, 52 μM) -doel (monster A) en AuNP + Cys + GO + antiBSA-probe gemengd, zoals weergegeven in figuur 6d. Naast hydrofobe en π–π-interactiekenmerken van de GO-vellen, ondersteunden covalente bindingen tussen eiwitten en carboxylgroepen op de GO-vellen ook oppervlakteadhesie. Dit resultaat was waarschijnlijk te wijten aan de AuNP+GO-antiBSA hybride structuur om een ​​stabiele immuunrespons te vormen met andere eiwitten op GO-BSA. De golflengten hadden een duidelijke absorptiepiek bij 260 nm. Naast hydrofobe en π–π (π–π* plasmonpiek) interactiekenmerken van de GO-vellen, ondersteunden covalente bindingen tussen eiwitten en carboxylgroepen op de GO-vellen ook oppervlakteadhesie. Voor en na BSA- en antiBSA-binding waren de π–π*-plasmonpiekwaarden van GO (230 en 270 nm) significant verschoven, wat aantoonde dat BSA en antiBSA positief waren gebonden.

Analyse van UV-vis absorptiespectra voor immuunrespons. een AuNP-gebonden GO en GO-gebonden BSA, b AuNP's en GO-gebonden anti-BSA, c AuNP-GO-antiBSA-sonde, en d AuNP-GO-antiBSA-sonde en GO-BSA-doelwit voor immuunrespons

Figuur 7 laat zien dat deze resultaten goed overeenkwamen met de kalibratiecurves. Gedetailleerde analyse van de bovenstaande experimentele resultaten (figuur 6c, d) toonde aan dat de waarnemingsreacties op de overeenkomstige gemiddelde onnauwkeurigheden van absorptie 1,3487, 1,1776, 1,0698, 0,8755 en 0,8588 waren (figuur 7a) en 0,9226, 0,8535, 0,7649, 0,7243 en 0,695 (Fig. 7b), overeenkomend met respectievelijk 1,45 nM, 145 pM, 14,5 pM, 1,45 pM en 145 fM eiwitconcentraties. Afbeelding 7a laat zien dat de lineaire regressie van de kalibratiecurves f(x) . was = 0.918 + 0.124× (correlatiecoëfficiënt, R ² = 0,94) voor de AuNP-GO-sonde met antiBSA-interacties, waarbij x is de eiwitconcentratie en y is de optische absorptie. Bovendien laat figuur 7b zien dat de lineaire regressievergelijking van de aangepaste curve f(x) was = 0.791 + 0.057× (correlatiecoëfficiënt, R ² = 0,954) voor GO en AuNP-GO op basis van de immunoassay.

Vergelijking van de kalibratiecurven van detectiereacties verkregen bij verschillende eiwitconcentraties. een Kalibratiecurven voor AuNP-GO-sonde met antiBSA-interacties. b Kalibratiecurves voor GO en GO-AuNP's op basis van een immunoassay

Tijdens het kwantificatie-experiment hebben we een vaste concentratie van 10 ng/ml humaan choriongonadotrofine (hCG)-eiwit toegevoegd om als interferentie te fungeren. De resultaten toonden aan dat het gefixeerde interfererende hCG-eiwit op de kalibratiecurves van de immunoassay werd aangepast door f(x) = 0,843 + 0,113× (correlatiecoëfficiënt, R ² = 0,89) voor de AuNP-GO-sonde met antiBSA-interacties (Fig. 7a), en f(x) = 0.722 + 0.051× (correlatiecoëfficiënt, R ² = 0,73) voor de GO en AuNP-GO op basis van de immunoassay (Fig. 7b).

Bovendien toonden onze experimentele resultaten aan dat de detectiestrategie oppervlakteregeneratie mogelijk maakte zonder verlies in specificiteit (vier regeneraties) en dat het ook kon worden gebruikt om antiBSA-eiwit te detecteren met dynamische responsen variërend van 1,45 nM, 145 pM, 14,5 pM, 1,45 pM , 145 fM en 0 fM. The results demonstrated that with a decreased concentration of antiBSA (from 1.45 nM to 145 fM) and even without the presence of antiBSA (0 fM), the spectral absorption intensity did not change the minimum level of quantitation. The hCG protein interfered with the antibody recognition in the immunoassay to a limited extent, possibly due to non-specific adsorption. This implies a very low cross-reactivity of the hCG protein and non-specific interactions at a low adsorption. In the practical quantitative analysis with immunoassays, a LOD of 145 fM for antiBSA was achieved in both buffer and interference protein samples.