Magnetic Gold Nanoparticle-Labeled Heparanase Monoclonal Antibody en de daaropvolgende toepassing voor Tumor Magnetic Resonance Imaging

Methoden

Cellijnen en muizen

In dit onderzoek werden zeven cellijnen gebruikt. Heparanase-positieve cellijnen, waaronder leverkankercellijn HepG2, menselijke maagkankercellijnen MKN45 en SGC-7901, colonkankercellijn SW480 en menselijke osteosarcoomcellijn U2OS, werden gekocht bij de American Type Culture Collection. Heparanase-negatieve cellijnen, menselijke borstkankercellijn MCF-7 en menselijke primaire embryonale fibroblastcellijn HF werden geleverd door Dr. Liang (Burn Research Institute, Third Military Medical University, Chongqing, China). HepG2-cellen werden gekweekt in DMEM dat 10% foetaal runderserum bevatte. SGC-7901, SW480, U2OS en HF-cellen werden gekweekt in RPMI 1640 dat 10% foetaal runderserum bevatte. MKN45- en MCF-7-cellen werden gekweekt in RPMI 1640 dat 15% foetaal runderserum bevat. Alle cellen werden gekweekt in een 5% CO₂ incubator bij 37 ° C en werden elke 24-48 uur gepasseerd. Vijftien BALB/c naakte muizen (4 tot 5 weken oud) werden gekocht van de Animal Department, Third Military Medical University. Dierstudies werden uitgevoerd in overleg met de lokale ethische commissie van de Derde Militaire Medische Universiteit. Alle naakte muizen werden in een specifieke pathogeenvrije omgeving gehouden.

Western Blot

Western blot werd uitgevoerd om Hpa-eiwitexpressie te detecteren volgens de procedure die is beschreven in onze vorige studie [17]. Elke cellijn werd gelyseerd met het M-PER-extractiereagens (Pierce Co.). Eiwitconcentraties werden bepaald door BCA-assay (Bio-Rad, CA, VS). Dertig microgram eiwitten werd gefractioneerd door 10% SDS-PAGE en vervolgens overgebracht naar een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan (Roche, Rotkreuz, Zwitserland). Het membraan was geblokkeerd met 5% (w /v ) magere melk in TBST (20 mM Tris-HCl [pH 8,0], 150 mM NaCl en 0,1% [v /v ] Tween-20) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Vervolgens werd het membraan gedurende de nacht bij 4 ° C onderzocht met een 1:200 verdunning van anti-HPA-antilichaam (Insight, Israël). Het membraan werd vier keer gewassen met TBST en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met een met mierikswortelperoxidase geconjugeerd antilichaam tegen muis-IgG. Het membraan werd vervolgens gespoeld met TBST en de eiwitbanden werden zichtbaar gemaakt met ECL Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare, NJ, VS). De beelden werden geanalyseerd met de Quantum One 4.1-software (Bio-Rad). De experimenten werden minstens drie keer herhaald.

Immunohistochemische kleuring

Hpa-expressie in de bovenstaande cellijnen werd gedetecteerd door middel van immunocytochemie. In het kort, de bovenstaande cellen werden gekweekt op steriele dekglaasjes bij 37 ° C in een 5% CO₂ broedstoof gedurende 48 uur. Nadat endogene peroxidase-activiteit was geblokkeerd door behandeling met een 0,3% H₂ O₂ -methanoloplossing gedurende 20 minuten, werden de cellen een nacht bij 4 °C geïncubeerd met het primaire Hpa-antilichaam (de verdunning van het antilichaam was 1:100). Na grondig wassen met PBS dat 0,1% Triton X-100 bevat, werden de objectglaasjes gedurende 20 minuten bij 20°C met een secundair antilichaam geïncubeerd. Ten slotte werden de objectglaasjes 15 minuten geïncubeerd met een avidine-biotine-enzymreagens. De objectglaasjes werden vervolgens ondergedompeld in een 3,3'-diaminobenzidine/H202-oplossing. PBS werd gebruikt als een negatieve controle.

Constructie van HPA&GoldMag Molecular Probe en Atomic Force Micrograph

De constructie van de moleculaire sonde werd uitgevoerd met behulp van de GoldMagTM-CS-kit (Xi'an Gold magnetische nano-biotechnologiebedrijf, GNK0202, Xi'an, China) volgens de bedieningsinstructies. De concentratie HPA-antilichaam is 1 mg/ml. Een atomic force micrograph (AFM) werd gebruikt om de vorm, grootte en oppervlakte-uiterlijk van de nanodeeltjes te evalueren. De niet-gelabelde magnetische gouden nanodeeltjes of gelabelde magnetische gouden nanodeeltjes werden op het dekglaasje geplaatst en werden 24 uur bij kamertemperatuur aan de lucht gedroogd. De gedroogde monsters werden geanalyseerd met behulp van een atoomkrachtmicroscoop (AFM, Nanoscope, Digital Instruments, Santa Barbara, CA).

Immunofluorescentie

In het kort, cellen werden gekweekt op steriele dekglaasjes bij 37 ° C in een 5% CO₂ broedstoof gedurende 48 uur. Vervolgens werden cellen gefixeerd met 4% (w /v ) formaldehyde in PBS gedurende 30 min en gepermeabiliseerd met 0,2% (v /v ) Triton X-100 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Cellen werden geblokkeerd door de dekglaasjes te incuberen met 10% (v /v ) geitenserum in PBS gedurende 30 minuten. Vervolgens werden cellen gekleurd met HPA&GoldMag moleculaire sondes of normale muis IgG&GoldMag sondes in een verdunning van 1:50 gevolgd door Cy3-gelabeld geit anti-muis IgG bij een verdunning van 1:100. De cellen werden vervolgens gekleurd met 0,4 mg / ml DAPI (Sigma-Aldrich) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Microscopische beelden werden verkregen met behulp van een laserconfocale microscoop. Normale muis IgG&GoldMag-sondes werden gebruikt als een negatieve controle.

Flowcytometrie

De activiteit van de HPA&GoldMag-sonde werd bepaald door middel van flowcytometrie. Cellen werden gedurende 1 uur geblokkeerd met geitenserum. Vervolgens werden de cellen gekleurd met een 10-μg HPA &GoldMag-sonde of normale muis IgG &GoldMag bij 4 ° C 's nachts, vier keer gewassen met PBS en vervolgens geïncubeerd met een FITC-gelabeld antilichaam tegen muis IgG gedurende 1 uur bij 37 ° C. De cellen werden gewassen met PBS en de fluorescentie-intensiteit werd gemeten met een flowcytometer (Becton Dickinson).

In vitro onderzoek van magnetische gouden nanodeeltjes voor MR-beeldvorming

De magnetische gouden nanodeeltjesoplossing (5 mg / ml) werd twee keer serieel verdund (1:20-1:1280) met een 1% agarose-oplossing. De oplossingen werden gestold in EP-buizen. MR-scanning werd uitgevoerd met een 1% agarosegel als blanco controle. De scanparameters waren als volgt:T1WI; TR600 ms/TE12 ms; dikte, 2,0 mm; gezichtsveld, 150 mm; en T2WI; TR6000 ms/TE92 ms; dikte, 2,0 mm; gezichtsveld, 150 mm. HPA &GoldMag MR moleculaire sondes werden geconstrueerd met behulp van HPA mAbs gelabeld met 30 nm magnetische gouddeeltjes. Cellen werden routinematig gekweekt in kweekschalen van 100 mm en HPA &GoldMag-sondes of negatieve IgG &GoldMag-sondes werden vervolgens aan de celculturen toegevoegd en 90 minuten bij 37 ° C geïncubeerd. Niet-gebonden sondes werden geblokkeerd door een geschikte hoeveelheid geitenserum toe te voegen. Na driemaal wassen met PBS werden de cellen verteerd met trypsine. Cellen werden vervolgens verzameld, gemengd met een 1% agarose-oplossing en overgebracht in EP-buizen van 1,5 ml. MR-scanning werd uitgevoerd met een 3,0 T MRI-scanner (scanparameters waren hetzelfde als hierboven beschreven) met behulp van de specifieke magnetische resonantiespoel voor dieren. Vóór het scannen werden de muizen verdoofd met 1% pentobarbital en in een scanbed geplaatst.

In vivo onderzoek van magnetische gouden nanodeeltjes voor MR-beeldvorming

Vier tot zes weken oude mannelijke naakte muizen (26-30 g) werden subcutaan in de heup geïnjecteerd met 200 μl MKN45-cellen. Elke naaktmuis werd geïnjecteerd met ongeveer 2,0 × 10 ⁶ cellen. Na 2 weken zijn de tumoren zichtbaar en worden ze gebruikt voor MR-beeldvorming. Vóór injectie en 2 uur na injectie werd MR-scanning uitgevoerd met behulp van een 3,0 T MRI-scanner. De parameters waren T2WI, TR6000 ms/TE92 ms; dikte, 1,5 mm; en gezichtsveld, 120 mm. Daarna werden de tumor-, milt-, lever-, nier-, milt-, hart- en longweefsels verzameld om Pruisische blauwe Fe-kleuring uit te voeren.

Statistische analyse

Alle gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde   ± standaarddeviatie. ANOVA-analyse werd uitgevoerd met behulp van SPSS13.0-software. EEN P waarde <  0,05 gaf aan dat het verschil significant was.

Resultaten

HPA werd anders tot expressie gebracht in verschillende kankercellen

Zowel Western-blot- als immunohistochemische kleuranalyses werden gebruikt om de expressie van Hpa in HepG2-, SGC-7901-, MKN45-, MCF-7-, SW480- en U2OS-cellen te testen. De resultaten toonden aan dat Hpa-expressie veel hoger was in HepG2-, SGC-7901-, MKN45-, SW480- en U2OS-cellen, terwijl een veel lagere expressie van Hpa werd gedetecteerd in MCF-7-cellen (Fig. 1).

Expressie van Hpa-eiwitten in verschillende cellijnen. een Western-blot werd gebruikt om HPA-eiwitexpressie (65 kDa) in verschillende tumorcellijnen te detecteren. Baan 1, HepG2; baan 2, SGC-7901; baan 3, MKN45; baan 4, MCF-7; baan 5, SW480; baan 5, U2OS. b Immunohistochemische analyse van HPA-expressie in HepG2-, SGC-7901-, MKN45-, MCF-7-, SW480- en U2OS-cellijnen

Constructie en detectie van HPA&GoldMag Molecular Probe

De HPA &GoldMag moleculaire sonde werd bereid door de HPA-mAbs te koppelen aan magnetische gouden nanodeeltjes met behulp van de koppelingsreactie tussen de oppervlakken van magnetische gouden nanodeeltjes. Atoomkrachtmicroscopie (AFM) werd gebruikt om de oppervlaktestructuur van de sonde direct te observeren. We toonden aan dat de gemiddelde diameter van magnetische gouden nanodeeltjes 13,78 nm was zonder labeling met HPA-mAbs (figuur 2a); de deeltjesgroottes waren homogeen. Na te zijn gelabeld met HPA-mAbs, was de gemiddelde diameter ongeveer 24,80 nm (figuur 2b). Deze resultaten suggereerden dat magnetische gouden nanodeeltjes geschikt waren voor koppeling met HPA-mAbs.

een Model voor het koppelen van magnetische gouden nanodeeltjes met HPA mAbs. b Atomic force scanning van magnetische gouden nanodeeltjes

HPA&GoldMag moleculaire sondes kunnen specifiek binden aan HPA

Eerst werd de specificiteit van de binding tussen de moleculaire probe en HPA geëvalueerd door middel van immunofluorescentie. De resultaten toonden aan dat een grote hoeveelheid rode fluorescentie werd gedetecteerd in het cytoplasma van HepG2-, MKN45-, SW480- en U2OS-cellen, terwijl slechts een kleine hoeveelheid rode fluorescentie werd gedetecteerd in MCF-7-cellen en geen fluorescentie werd gedetecteerd in HF-cellen . Negatieve muis IgG &GoldMag vertoonde echter geen enkele interactie met HPA in cellijnen (Fig. 3). We gebruikten verder flowcytometrie om de specificiteit van de HPA &GoldMag moleculaire probe te testen. We toonden een negatieve respons in HF-cellen en zagen 40% positieve percentages in MCF-7-cellen en 95% positieve percentages in HepG2-, SW480-, U2OS- en MKN45-cellen. Deze resultaten geven aan dat de probes specifiek kunnen binden aan HPA dat tot expressie wordt gebracht in tumorcellen.

Specificiteit en bindingsactiviteit van de sonde gedetecteerd door immunofluorescentie en flowcytometrie. een Immunofluorescentie werd uitgevoerd met behulp van sondes zoals aangegeven. b Flowcytometrie werd gebruikt om de specificiteit van de HPA&GoldMag moleculaire probe te testen

MR-beeldvorming van HPA&GoldMag-sondes in vitro

Na seriële verdunning met 1% agarose, vertoonde MR-beeldvorming van magnetische gouden nanodeeltjes met behulp van een T2WI-sequentie een andere signaalreductie. Het T2WI-signaal van een 1:640 verdunning was veel lager dan dat van de 1% agarosegelcontrole (P < 0.05) (Fig. 4a, b). De resultaten toonden aan dat de magnetische gouden nanodeeltjes het MR-signaal effectief konden verminderen, zelfs in een lage concentratie, wat suggereert dat magnetische gouden nanodeeltjes geschikt zouden kunnen zijn voor moleculaire beeldvorming. Vervolgens werden HPA &GoldMag moleculaire sondes gebruikt om HepG2-, SGC7901-, MKN45-, SW480-, U2OS-, HF- en MCF-7-cellen te labelen die vervolgens werden gemengd met 1% agarose en onder 3.0 T magnetische resonantie (MR) werden geplaatst (Fig. 4c). MR-scanning met behulp van T1WI (Fig. 4c, d) of T2WI (Fig. 4c, e) sequentie voor axiale plus coronale scanning. De resultaten toonden aan dat in vergelijking met de T1WI-sequentie, het signaal met behulp van de T2WI-sequentie van MR-scanning significant was verminderd (P < 0.05) terwijl het signaal in de HF-cellen na labeling niet significant veranderd was (P> 0,05), en het signaal in de MCF-7-cellen na labeling was minimaal verminderd (P < 0.05).

een MR-beeldvorming van magnetische gouden nanodeeltjes na twee seriële verdunningen. b Diagram van de statistische resultaten van MR-beeldvormingssignaalsterkten van twee serieel verdunde magnetische gouden nanodeeltjes. c MR-beeldvorming van alle cellen na labeling met de sondes. Baan 1, HF; baan 2, MCF-7; baan 3, HepG2; baan 4, SGC-7901; baan 5, MKN45; baan 5, SW480; baan 6, U2OS. d Statistische resultaten die de signaalsterkten van MR-beeldvorming vergelijken met behulp van de T1WI-sequentie op cellen die zijn gelabeld met HPA &GoldMag-sondes. e Statistische resultaten voor de signaalsterkten die zijn gedetecteerd met MR-beeldvorming met behulp van de T2WI-sequentie op cellen die zijn gelabeld met HPA&GoldMag-sondes

MR-beeldvorming van HPA&GoldMag-sondes in naakte muizen

Alle naakte muizen werden verdoofd met pentobarbital-natrium in een dosis van 50 mg/kg. De moleculaire sonde werd in de staartader van de naakte muizen geïnjecteerd en de MR-scan werd vóór en 2 uur na toediening uitgevoerd. Omdat de sonde kon worden geabsorbeerd door macrofagen in de longen en lever en uitgescheiden door de nieren, toonden de scanresultaten aan dat na injectie de tumor-, lever-, nier- en longweefsels in de naakte muizen significant verminderde signalen hadden, vergeleken met de signalen die vóór de injectie werden gedetecteerd (P < 0,05) (Fig. 5).

een MR-beeldvorming van naakte muizen voor en 2 uur na de injectie van controle- of HPA &GoldMag-sondes. De pijl geeft de tumoren bij muizen aan. b Vergelijking van de signaalsterkten van MR-beelden met behulp van T2WI voor en na de injectie van de controle- of HPA &GoldMag-sondes in naakte muizen. ^* P < 0.01

Discussie

Tumorinvasie en metastase is een complex biologisch proces dat de slechte prognose van tumoren veroorzaakt. Vroege diagnose van tumormetastase is dus een belangrijke strategie voor het selecteren van klinische behandelingsstrategieën. MRI is een nuttige niet-invasieve methode voor tumordetectie; het maakt multidimensionale weefselbeeldvorming met hoog contrast mogelijk. MRI kon echter geen tumoren met een kleine omvang detecteren en middelen met een hoog contrast, zoals metalen nanodeeltjes (ijzer, goud, enz.) Moeten worden gebruikt om de tumorvisualisatie te verbeteren [18,19,20]. De ontwikkeling van nieuwe contrastmiddelen op basis van nieuwe nanomaterialen is gunstig voor het verbeteren van MRI-technieken voor de vroege detectie van kankers. Onder de beeldvormende middelen wordt het superparamagnetische ijzeroxidedeeltje (SPIO) gebruikt als een veelgebruikt contrastmiddel in MR-moleculaire beeldvorming, waarbij magnetische gouden nanodeeltjes superparamagnetische nanocomposietmaterialen zijn met een Fe₃ O₄ (kernen)/Au (schil) structuur [21,22,23,24]. De superparamagnetische eigenschappen van anorganische nanodeeltjes zijn nuttig voor magnetische resonantie beeldvorming (MRI) [25]. Een combinatie van deze nanodeeltjes met weefselspecifieke middelen (antilichamen of laagmoleculaire stoffen) maakt nauwkeurige detectie en diagnose van tumoren mogelijk. Talrijke onderzoeken hebben aangetoond dat HPA in veel tumoren tot expressie wordt gebracht, en het expressieniveau ervan hangt nauw samen met het metastatische potentieel van tumoren [26]. HPA kan de integriteit van de ECM en BM vernietigen door de afbraak van HSPG, waardoor actieve moleculen zoals bFGF, HGF en VEGF verankerd in de ECM vrijkomen, waardoor tumorprogressie wordt bevorderd [27,28,29,30]. Omdat HPA voornamelijk tot expressie wordt gebracht in tumoren in het midden tot late stadium, hebben onze eerdere onderzoeken aangetoond dat HPA zou kunnen worden gebruikt als een algemene TAA voor tumortherapie [13,14,15]. Daarom kan HPA een potentieel nuttig doelwit zijn voor moleculaire beeldvorming en therapie van tumoren.

Magnetische gouden nanodeeltjes zijn superparamagnetische composiet nanomaterialen met een Fe₃ O₄ (kern)/Au (schil) structuur die wordt geproduceerd door de reductie van Au ³⁺ door hydroxylamine hydrochloride van superparamagnetisch Fe₃ O₄ deeltjes [31, 32]. Omdat de labelingsmethode vrij eenvoudig is, kunnen ze worden gebruikt voor biologische toepassingen zoals celselectie, eiwitzuivering, nucleïnezuurscheiding en immunoassays. Door een vastgestelde procedure te volgen, waren we dus in staat om met succes goudgecoate ijzeroxide-nanodeeltjes te bereiden en te karakteriseren die zijn gekoppeld aan anti-HPA-antilichamen. In dit onderzoek zijn 30 nm magnetische gouddeeltjes gebruikt omdat deze veel stabieler zijn dan 50 nm magnetische gouddeeltjes. Eén milligram magnetische gouddeeltjes van 30 nm kan binden aan ongeveer 200 μg HPA-mAbs. Onze gegevens toonden aan dat het gebruik van magnetische gouden nanodeeltjes in een verdunning van 1:640 (ongeveer 10 μg) verminderde signalering produceerde in vergelijking met de blanco controlegroep bij 3,0 T MRI-scanning (P < 0,05). Zo kon de kritische waarde voor in vivo beeldvorming met magnetische gouddeeltjes worden berekend.

De activiteit en specificiteit van de magnetische gouden nanodeeltjes-gekoppelde HPA mAb-sondes werden vervolgens gedetecteerd met behulp van laserconfocale microscopie, flowcytometrie en atoomkrachtmicroscopie. In het kort werd de sonde in vitro getest door incubatie van de gerichte sonde en de negatieve controlesonde met zowel HPA (+) als (-) cellen. Hier vertoonden menselijke MCF-7-borstkankercellen een zwakke HPA-expressie, terwijl MKN45-, SW480-, U2OS-, HepG2- en SGC-7901-cellen een hogere HPA-expressie hadden. Verder werd normaal muis-IgG gebruikt als controle voor de HPA-mAbs om de specificiteit van het nanodeeltje verder te bewijzen.

Nadat de specificiteit van de sonde in vitro was getest, de gerichte en controlesondes werden geïnjecteerd in naakte muizen die subcutaan waren geïnjecteerd met menselijke MKN45-maagkankercellen. Zodra de diameter van de tumorweefsels 1 cm bereikte, werd MR-scanning uitgevoerd met behulp van een 3,0 T MRI-kamer om signaalveranderingen in tumoren voor en na de injectie met sondes te detecteren. De scanresultaten toonden aan dat tumorsignalen 2 uur na injectie van de sonde significant waren verminderd in vergelijking met de signalen vóór injectie van de sonde. Deze resultaten toonden aan dat de HPA&GoldMag-sondes uitstekende immuunactiviteiten en betere effecten hadden bij naakte muizen met MKN45-cellen.

Conclusies

Samenvattend hebben we aangetoond dat de HPA&GoldMag moleculaire probes gekoppeld aan HPA mAbs uitstekende fysische en chemische eigenschappen hadden. De sonde zou specifiek gericht kunnen zijn op veel tumorcellen die hoge HPA tot expressie brengen, zowel in vitro als in vivo. Met behulp van 3.0 T MRI-scanning werd aangetoond dat de sondes het T2WI-signaal in tumorweefsels aanzienlijk verminderen; dit kan een experimentele basis bieden voor moleculaire beeldvorming van tumormetastase.

Afkortingen

AFM:

Microfoto van atoomkracht

BM:

Keldermembraan

CT:

Computertomografie

ECM:

Extracellulaire matrix

HPA:

Heparanase

HSPG:

Heparansulfaat proteoglycaan

MRI:

Magnetische resonantie beeldvorming

PVDF:

Polyvinylideendifluoride

TAA:

Tumorgeassocieerd antigeen