Identificatie van karakteristieke macromoleculen van Escherichia coli genotypen door Atomic Force Microscope mechanische kartering op nanoschaal

Resultaten en discussie

Surface Ultrastructure door Multiple Mapping

Bij het scannen met AFM op een observatieschaal van 10 μm op een bacterieel monster, worden verschillende enkele E. coli MG1655-cellen konden worden gezien en de cellulaire vorm in drie dimensies kon worden waargenomen vanaf het topografische beeld (figuur 1a); de duidelijke contouren van de cellen die in twee dimensies worden getoond, werden verkregen door het beeld van de afbuigingsfout (figuur 1b), en er konden verschillende tubuli naast de bacteriecellen worden gevonden. De golfachtige filamenten (figuur 1c) kwamen overeen met het verschijnen van microbiële flagella gerapporteerd in een ander werk, dat een dergelijke bevinding als flagella bevestigde, en de kortere en haarachtige pili kon ook worden gezien [11]. Bij het verkleinen van het waarnemingsgebied van de sonde voor de gedetailleerde studie van afzonderlijke microbiële cellen, vertoonde de topografie een klein verschil in de verticale richting tussen cellulaire oppervlakken, zoals weergegeven in figuur 1d, en het beeld van de doorbuigingsfout leek meer morfologische informatie te bieden, terwijl het verzamelde omgevingsgeluid was te veel om de ultrastructuur van het celoppervlak te onderzoeken (figuur 1e). Toen de gelijktijdige biomechanische eigenschappen van het monster werden gemeten tijdens het contact tussen de tip en het geteste object, bleek dat het bacteriële oppervlak eigenlijk bestond uit een enorme hoeveelheid macromoleculen met een specifieke vorm en grootte, zoals bleek uit de adhesieve krachtmapping ( Afb. 1f); zo werd de morfologische resolutie in topografische en doorbuigingsfoutbeelden verder verbeterd met biomechanische informatie.

Oppervlakte-ultrastructuur van E. coli MG1655 met behulp van AFM multiple mapping. een en b waren de topografische en doorbuigingsfoutbeelden, en c was het gedetailleerde beeld van de doorbuigingsfout van de bacteriële cel met de expressie van flagella en pili. Een enkele cel werd vervolgens gefocust, waar d en e waren de topografische en doorbuigingsfoutbeelden, en f was de overeenkomstige adhesiekartering. De schaalbalken = 1 μm in a en b , 500 nm in c , en 200 nm in d –f

In figuur 2a is de uitdrukking van flagella door E. coli MG1655 was duidelijk te zien, waar de grootte van de filamenten vergelijkbaar was met die in figuur 1b, met de adhesie-eigenschappen relatief lager dan die van het substraat. Bovendien bleek het bacteriële oppervlak te zijn samengesteld uit cirkelvormige componenten die werden gekenmerkt als minder hechtend in vergelijking met de omringende matrix. Deze waarneming is vergelijkbaar met onze eerdere bevindingen over de weefsellagen van de huid van muizen, en de terugkerende en vergelijkbare korrels werden beschouwd als macromoleculen, waarvan de structuur dichter en consistenter is dan die in het intermoleculaire gebied, zodat de verschillen in adhesieprestaties konden gemakkelijk worden waargenomen [12]. De buitenste laag van de cellulaire envelop in Gram-negatieve bacteriën is een laag van zelf-assemblerende eiwitten, zoals geïllustreerd in figuur 2b, die bekend staat als een oppervlaktelaag (S-laag) eiwit [13]. S-laagstructuren werden traditioneel gemeten met elektronenmicroscopie, terwijl de vereisten van vacuümomgevingen en geleidende coating de oorspronkelijke en realtime informatie over de eiwitten verloren. Hoewel sommige onderzoeken de S-laag-eiwitten extraheren en opnieuw in elkaar zetten op mica-substraat voor de AFM-scanning, ontbraken de resultaten voor de in situ en realtime prestaties van de S-laagstructuur [14, 15]. Op basis van de cellulaire architectuur en enkele eerdere afbeeldingen van het microbiële oppervlak door elektronenmicroscopie, beschouwden we de waargenomen macromoleculen als S-laageiwitten [16].

Illustratie van verticale en oppervlaktestructuren van E. coli cellen. een De oppervlaktemacromoleculen op E. coli MG1655-cel afgebeeld door AFM-adhesiemapping. b De moleculaire architectuur van celenvelop in Gram-negatieve microben, die bestaat uit cytoplasmatisch membraan, peptidoglycaan, buitenmembraan en S-laag. De schaalbalk = 200 nm

Door de AFM- en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) -metingen te vergelijken, heeft de eerste verschillende voordelen ten opzichte van de laatste, zoals eenvoudigere monstervoorbereiding, minder beperkte experimentele vereisten en meer biologisch-vriendelijke beeldvormingstoepassingen. De selectie van TEM op biologisch gebied wordt over het algemeen geselecteerd vanwege het vermogen om de intercellulaire organellen te zien en de ultraresolutie (meestal nanometer of sub-nanometer) beeldvorming die kan worden verkregen. De AFM-adhesiemapping in het huidige werk verbeterde de kenmerkresolutie en presenteerde de rangschikkingen van oppervlaktemacromoleculen op een manier die niet afhing van de tipgrootte, maar in plaats daarvan van de intrinsieke structuur van het monster zelf. Bovendien maakt deze benadering resolutie op nanoschaal van microbiële oppervlakken mogelijk over een gebied van tientallen micrometers.

Genomisch manipulerende verschillen in morfologische kenmerken

Na het observeren van de oppervlakte-ultrastructuur van E. coli MG1655-cellen, is een kwestie van belang hoe de macromoleculen in andere stammen zijn gerangschikt. De menselijke pathogenen E. coli CFT073 en RS218 werden dus onderzocht door AFM met dezelfde experimentele parameters, en er waren geen significante verschillen in cellulaire vormen en afmetingen tussen deze drie genotypen bij de kenmerkgrootte van 10 m, te zien in Fig. 3a-c. Het in kaart brengen van de adhesieve kracht werd gebruikt om de S-laag-eiwitten te identificeren, en er werden ongelijke structuren met verschillende vormen en maten gedetecteerd tussen de verschillende E. coli stammen, zoals getoond in Fig. 3d-f. Voor het gemak van vergelijking zijn de gedetailleerde adhesiekaarten van de E. coli stammen werden weergegeven in Fig. 3g-i. De oppervlaktemacromoleculen werden gekarakteriseerd als een ronde vorm in MG1655- en RS218-cellen, hoewel verschillende moleculaire diameters, die 38 ± 1.1 nm waren (n = 80) voor MG1655 en 58 ± 2.7 nm (n = 46) voor RS218. Aan de andere kant bezaten de CFT073-cellen een unieke vorm van S-laag-eiwitten, die nierachtig waren met een lengteverschil tussen twee eindpunten van 66 ± 3.2 nm (n = 44). Na analyse van de grootte van de S-laag-eiwitten van deze drie genotypen voor meerdere vergelijkingen, toonden de resultaten de significante verschillen tussen deze stammen aan (Fig. 4).

Morfologische kenmerken van de E. coli genotypen. De bovenste rij toonde de doorbuigingsfoutafbeeldingen van a MG1655, b CFT073 en c RS218. De middelste rij toonde de 3D-topografieën gekleurd met adhesiekaarten op d MG1655, e CFT073 en f RS218-cellen. De onderste rij was de gedetailleerde hechtingskaart op g MG1655, h CFT073, en i RS218. Bij het in kaart brengen van hechting verwees de donkerdere kleur naar minder hechtingsprestaties en vice versa. De schaalbalken waren 2 μm voor a –c , 200 nm voor d –f , en 100 nm voor g –ik

Moleculaire grootten van E. coli genotypen. De diameters van oppervlakte-eiwitten werden gedetecteerd door AFM en verwerkt via eenrichtings-ANOVA voor de meerdere vergelijkingen. ****p < 0.001 en *p < 0.05

Microbiële S-lagen spelen naar verluidt een belangrijke rol in veel functies, die cellen beschermen tegen ernstige omgevingen, aanvallen van fagocytose en roofzuchtige bacteriën. Bovendien dienen S-lagen ook als adhesine dat de effectieve kolonisatie mogelijk maakt [17]. De S-laagstructuren zijn goed bestudeerd door TEM en zijn onderverdeeld in verschillende roostertypes met een ruimte tussen hart op hart in het bereik van 4-35 nm [16]. De variatie tussen onze AFM-resultaten en TEM-rapporten uit de literatuur werd beschouwd als de verschillende beeldvormingsmethodologieën, waarbij TEM de 2D-morfologie van de S-laagstructuur geeft en AFM de 3D-topografie vastlegt die de meerdere invloeden omvat die worden bijgedragen door cellulaire radiaal en ruwheid en de geometrie van AFM-sonde.

Oorspronkelijk werd gedacht dat verschillende soorten S-laagstructuren mogelijk waren om hun verschillende taxonomische kenmerken te gebruiken om onderscheid te maken tussen bacteriesoorten, hoewel toen werd ontdekt dat zelfs voor enkele soorten de microbiële vlekken verschillende roosters van eiwitten konden hebben [13, 16, 18, 19]. Hoewel sommige studies de rol van de S-laag bij de vorming van filamenten, de soorten eiwitten op celmembranen en de genomische diversiteit in grootte tussen E. coli genotypen zijn de verschillen in S-laag-eiwitten zelden opgemerkt [20,21,22]. De resultaten van de huidige studie onthulden de verschillen in morfologische kenmerken tussen E. coli MG1655, CFT073 en RS218 en suggereren dat het uiterlijk van de oppervlaktemacromoleculen waarschijnlijk specifiek was voor individuele E. coli genotype.