Effect van gemanipuleerde nanodeeltjes op exopolymere stoffen die vrijkomen uit marien fytoplankton

Abstract

Engineered nanoparticles (ENP's), producten van moderne nanotechnologieën, kunnen mogelijk een impact hebben op het mariene milieu en een ernstige bedreiging vormen voor mariene ecosystemen. De cellulaire reacties van marien fytoplankton op ENP's zijn echter nog steeds niet goed ingeburgerd. Hier onderzoeken we vier verschillende diatomeeënsoorten (Odontella mobiliensis , Skeletonema grethae , Phaeodactylum tricornutum , Thalassiosira pseudonana ) en een groene alg (Dunaliella tertiolecta ) voor hun extracellulaire polymere stoffen (EPS) afgifte onder model ENP-behandelingen:25 nm titaniumdioxide (TiO₂ ), 10–20 nm siliciumdioxide (SiO₂ ) en 15–30 nm ceriumdioxide (CeO₂ ). We hebben SiO₂ . gevonden ENP's kunnen de EPS-afgifte van deze algen aanzienlijk stimuleren (200-800%), terwijl TiO₂ ENP-blootstelling veroorzaakte de laagste afgifte. Verder is de toename van intracellulair Ca²⁺ concentratie kan worden veroorzaakt door ENP's, wat suggereert dat het EPS-afgifteproces wordt gemedieerd via Ca²⁺ signaalwegen. Met een beter begrip van het cellulaire mechanisme gemedieerde ENP-geïnduceerde EPS-afgifte, kunnen mogelijke preventieve en veiligheidsmaatregelen worden ontwikkeld om de negatieve impact op het mariene ecosysteem te verminderen.

Achtergrond

Engineered nanodeeltjes (ENP's), die in grootte variëren tussen 1 en 100 nm (in ten minste één dimensie), worden gebruikt bij de fabricage van tal van consumptiegoederen, waaronder printerinkten en -verven, wasmiddelen, bactericiden, coatings, cosmetica, zonnebrandlotions, banden, computerconstructie en medicijnafgifte. Gezien de veelbelovende toepassing van ENP's, bedroeg de financiering voor het National Nanotechnology Initiative (NNI) in de VS alleen al in 2017 $ 1,4 miljard [1,2,3]. Het vestigen van fundamentele kennis op nanoschaal was de belangrijkste focus van de onderzoeksgemeenschap op het gebied van nanotechnologie in de eerste fase. Vanaf 2009 was deze nieuwe kennis de basis voor een wereldwijde markt van ongeveer een kwart biljoen dollar, waarvan ongeveer 91 miljard dollar in Amerikaanse producten die componenten op nanoschaal bevatten [4]. Met de snelle ontwikkeling van nanotechnologie is het onvermijdelijk dat ENP's uiteindelijk hun weg naar aquatische systemen zullen vinden. De grootste zorg met ENP's in termen van hun potentiële toxiciteit (bijvoorbeeld het potentieel voor het produceren van reactieve zuurstofsoorten, ROS) in het milieu houdt verband met hun grote en unieke oppervlaktereactiviteit. De daadwerkelijke impact op het mariene ecosysteem blijft echter grotendeels onbekend vanwege complexe ecologische en biologische factoren van natuurlijke wateren en de verscheidenheid aan ENP's [1, 5, 6]. Eerdere studies hebben aangetoond dat ENP's aanzienlijke schade kunnen toebrengen aan het op algen gebaseerde mariene ecosysteem [7, 8]. Van mariene organismen (met name fytoplankton) is aangetoond dat ze interageren met ENP's, wat leidt tot negatieve gevolgen [9,10,11]. Met het potentieel toegenomen gebruik van nanotechnologie op diverse gebieden, kunnen steeds meer ENP's in aquatische omgevingen terechtkomen, dus de cellulaire reacties van marien fytoplankton op ENP's verdienen verdere aandacht [12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21].

De meeste mariene microben, of ze nu auto- of heterotroof zijn, zijn over het algemeen in staat om exopolymere stoffen (EPS) te produceren, die verschillende functionele rollen en fysische eigenschappen in het mariene ecosysteem hebben en fungeren als groeiremmers, groeibevorderaars, toxines, metaalvangers of als substraten voor de heterotrofe cyclus [22,23,24,25,26]. EPS dat vrijkomt uit fytoplankton en bacteriën in de oceaan zijn polysaccharide-rijke anionische colloïdale biopolymeren die essentieel zijn voor de vorming van mariene gels, mariene sneeuw en biofilms, evenals voor het opruimen van colloïden en sporenelementen en voor het bieden van bescherming tegen verschillende bedreigingen van het milieu, inclusief ENP's [7, 15, 19, 20, 25, 27]. Bovendien wordt aangenomen dat de afscheiding van EPS een natuurlijke reactie is wanneer fytoplankton verschillende stress ervaart [8].

Ca²⁺ is een veel voorkomende tweede boodschapper die betrokken is bij een groot aantal intracellulaire signaalroutes. Het is aangetoond dat Ca²⁺ is vereist voor chemotaxis, motiliteit en adhesie in de diatomeeënaarde Amphora coffeaeformis [28]. Verbeterde intracellulaire vrije Ca²⁺ Het is bekend dat deze niveaus leiden tot de activering van proteïnekinase C, dat betrokken is bij veel intracellulaire signaalroutes [29]. Aangezien het vrijkomen van EPS nauw verband houdt met de beweeglijkheid en adhesie van diatomeeën, werd voorgesteld dat een Ca²⁺ -gemedieerd secretieproces controleert de afgifte van EPS uit diatomeeën [30], en het directe bewijs dat Ca²⁺ verifieert signalering, exocytose en correlatie Ca²⁺ signalering met exocytose is gerapporteerd in onze vorige studie [31]. Eerdere onderzoeken hebben ook aangetoond dat interacties met ENP's de intracellulaire Ca²⁺ routes, die essentieel zijn voor celsignalering [29, 32,33,34]. Specifieke intracellulaire Ca²⁺ concentratieveranderingen zijn belangrijk bij celsignalering en secretieprocessen; er zijn echter geen meldingen van titaniumdioxide (TiO₂ ), siliciumdioxide (SiO₂ ), of ceriumdioxide (CeO₂ ) om intracellulair Ca²⁺ . te veranderen niveau in fytoplankton.

In 2013 Quigg et al. [8] vatte de directe en indirecte toxische effecten van ENP's op algen samen. In onze eerdere experimenten werd aangetoond dat ENP's EPS-aggregatie vergemakkelijken [35]. In dit opzicht kan EPS de directe ENP-geïnduceerde toxiciteit voor in het water levende organismen verergeren of verminderen [7, 15, 36]. Directe meting van EPS-afgifte uit fytoplankton onder ENP-stress is echter nooit gerapporteerd. In deze studie is het doel om de afgifte van EPS van vier verschillende diatomeeënsoorten (Odontella mobiliensis) te bestuderen. , Skeletonema grethae , Phaeodactylum tricornutum , Thalassiosira pseudonana ) en een groene alg (Dunaliella tertiolecta ) onder ENB-behandelingen. Door inzicht te krijgen in de onderliggende mechanismen van de door ENP geïnduceerde EPS-afgifte in fytoplankton, kan de implementatie van preventieve en veiligheidsmaatregelen de mogelijk schadelijke effecten op mariene organismen verminderen.

Resultaten en discussies

ENP-karakterisering

Dynamische laserverstrooiing (DLS) werd gebruikt om de groottestatistieken van de volgende ENP's gesuspendeerd in zuiver water te karakteriseren:TiO₂ , SiO₂ , en CeO₂ . De deeltjesgrootteverdeling varieerde van 7 tot 66 nm in TiO₂ , 9 tot 66 nm in SiO₂ , en 12 tot 70 nm in CeO₂ . Sommige grotere maten kunnen te wijten zijn aan aggregatie of agglomeratie, terwijl de overheersende maat voor TiO₂ is 25 nm, SiO₂ is 10 tot 20 nm, en CeO₂ is 15 tot 30 nm, wat overeenkomt met de informatie van de fabrikant (Fig. 1).

ENP-karakterisering door DLS-beoordeling van a TiO₂ , b SiO₂ , en c CeO₂ in L1-medium na sonicatie met hun grootteverdeling. De ENP-eindconcentratie in het DLS-monster is 1 μg/ml, de meettijd is 3 min direct na de sonicatie

ENP's induceren intracellulair Ca²⁺ Concentratie in fytoplankton

Om te onderzoeken of ENP's een toename van intracellulair Ca²⁺ . kunnen veroorzaken concentratie, werden fytoplanktoncellen (OD 600 = 0.8) geladen met Fluo-4AM-kleurstof en blootgesteld aan 1 mg/ml 25 nm TiO₂ , 10–20 nm SiO₂ , en 15–30 nm CeO₂ ENP's respectievelijk. De verandering in intracellulair Ca²⁺ concentratie, zoals weergegeven door de fluorescentie-intensiteit in fytoplanktoncellen, werd gedurende 150 s gevolgd. Figuur 2a–e laat zien dat 1 mg/ml van drie respectieve ENP's Ca²⁺ verhoogde concentratie in SiO₂ met ongeveer 50–300%, TiO₂ met ongeveer 40%, en CeO₂ met ongeveer 150-200%, terwijl de controleomstandigheden (L1-medium) ongewijzigd bleven. De resultaten laten zien dat ENP's significante intracellulaire Ca²⁺ . kunnen induceren reacties in fytoplankton en suggereren dat fytoplankton via Ca²⁺ op verschillende ENP's reageert signaleringsroutes. Onze gegevens duiden slechts op kleine veranderingen in intracellulair Ca²⁺ niveaus wanneer TiO₂ aanwezig is, mogelijk toegeschreven aan substantiële fytoplanktonceldood door TiO₂ -geïnduceerde toxiciteit [37, 38]. In onze vorige studie, TiO₂ veroorzaakte toename van de intracellulaire Ca²⁺ concentratie [34] naast significante celapoptose [39]. SiO₂ toonde verrassend genoeg de meest voor de hand liggende intracellulaire Ca²⁺ toename voor alle fytoplanktonsoorten, terwijl CeO₂ kan alleen een intercellulair Ca²⁺ . veroorzaken concentratieverhoging. Eerder onderzoek suggereerde potentieel van hoge CeO₂ concentraties (> 50 mg/ml) om intracellulaire oxidatieve stress en verhoging van intracellulair Ca²⁺ te induceren niveaus, hoewel de effecten klein waren, en ondersteunden onze bevinding [40]. We hebben ook het zeta-potentieel van elk ENP in kunstmatig zeewater gemeten om het mogelijke effect van de oppervlaktelading aan te pakken; de waarde was echter laag. De meting gaf aan dat de ENP's als ongeveer neutraal worden beschouwd [41] (Aanvullend bestand 1:aanvullende gegevens). Dit was het eerste rapport waarin werd vastgesteld dat ongelijksoortige ENP's intracellulair Ca²⁺ induceren. concentratieveranderingen in specifiek fytoplankton, wat uiteindelijk een nieuwe weg vrijmaakt voor toekomstig onderzoek.

Meting van intracellulair Ca²⁺ concentratie na stimulatie door verschillende ENP's. Verschillende fytoplanktoncellen a Dunaliella tertiolecta , b Thalassiosira pseudonana , c Skeletonema grathae , d Phaeodactylum tricornutum , en e Odontella mobiliensis werden behandeld met TiO₂ 25 nm (groen), SiO₂ 10–20 nm (rood), CeO₂ 15-30 nm (paars) met een concentratie van 1 mg/ml en controle (blauw). De zwarte pijl geeft het tijdstip aan waarop EPN's zijn toegepast (30 s). De metingen tonen representatieve gegevens van gemiddeld 20 individuele cellen

ENP-geïnduceerde EPS-afgifte in fytoplankton

Enzym-linked lectine assay (ELLA) werd gebruikt om de hoeveelheid EPS-afgifte uit fytoplanktoncellen te beoordelen wanneer gestimuleerd met TiO₂ , SiO₂ , en CeO₂ ENP's, concentratiebereik van 1 μg/ml tot 5 mg/ml op basis van eerdere onderzoeken voor TiO₂ [42, 43] en CeO₂ [44,45,46]. EPS-secretie werd genormaliseerd naar de totale hoeveelheid fytoplankton-DNA (aanvullend bestand 1:supplementgegevens) om een gelijke basis voor vergelijking te hebben. In vergelijking met de controle vonden we dat 10–20 nm SiO₂ kan de EPS-afgifte tot 550% verhogen in Dunaliella , 500% in Thalassiosira , 1000% in Skeletonema , 400% in Odontella , en 900% in Phaeodactylum (Afb. 3). Toen de fytoplanktonsoorten werden blootgesteld aan TiO₂ , was er geen sterk effect op de EPS-secretie, aangezien alleen Skeletonema en Phaeodactylum belangrijke veranderingen vertoonden. EPS-afgiftegegevens zijn dus consistent met onze intracellulaire Ca²⁺ concentratie resultaten. TiO₂ had geen significant effect op de productie van EPS, vergelijkbaar met het feit dat intracellulair Ca⁺² concentraties vertoonden zeer limietveranderingen als gevolg van de toxiciteit van TiO₂ tot fytoplankton. De productie en residuen van ROS kunnen leiden tot veel complicaties zoals apoptose in het fytoplankton [47,48,49]. In de CeO₂ behandeling, resultaten lieten een klein effect zien in Dunaliella , Skeletonema , Odontella , en Phaeodactylum . SiO₂ toonde de meest significante EPS-inductie in Thalassiosira pseudonana (ongeveer 600%) en Skeletonema grethae (ongeveer 1000-1500%). Deze gegevens geven aan dat verschillende ENP's specifieke EPS-afgifte uit fytoplankton en intracellulair Ca²⁺ kunnen induceren. wijzigingen komen ook overeen met de resultaten van de EPS-release. Door de veranderingen in intracellulair Ca²⁺ . te beoordelen concentratie, is het duidelijk dat er een direct verband is in de Ca²⁺ cellulaire paden waarin ENP's de EPS-secretie van fytoplankton oproepen. De waarneming hier is in overeenstemming met onze eerdere studies op basis van Phaeocystis EPS-release [31]. De resultaten leveren direct bewijs dat fytoplankton ENP's kan detecteren en onderscheiden die reageren met verschillende EPS-afgifte gereguleerd door Ca²⁺ cellulaire paden.

Door het gebruik van ELLA konden we de afgifte van EPS bepalen via de interacties van het fytoplankton met de ENP's. Onze resultaten geven aan dat de EPS-secretie significant was verhoogd naarmate het fytoplankton een interactie aanging met SiO₂ voor Dunaliella tertiolecta , Thalassiosira pseudonana , en Skeletonema grethae . Het lijkt erop dat deze diatomeeën klaar zijn om SiO₂ . te herkennen deeltjes. In Phaeodactylum tricornutum , werd geen sterke EPS-secretie gevonden. Dit verschil vertegenwoordigt EPS-afgifte veroorzaakt door ENP's die afhankelijk zijn van de fytoplanktonsoort en ENP's-concentratie (Fig. 3). In een eerdere studie veroorzaakten olielozingen grote mariene microbiële EPS-afgiftes die werden voorgesteld om de negatieve gevolgen van olielozingen tegen te gaan [50]. Bovendien ontdekten Boglaienko en Tansel dat SiO₂ deeltjes waren in staat om olieaggregaten efficiënt te verwijderen [51]. Onze bevinding biedt een nieuw potentieel mechanisme waarbij SiO₂ . met lage toxiciteit deeltjes kunnen EPS-afgifte van specifiek fytoplankton induceren, wat de verwijdering van olielekken mogelijk maakt door EPS-aggregatie te bevorderen. Van ceriumdioxide is nooit gemeld dat het op fytoplankton gebaseerde mariene ecosystemen verstoort. Resultaten hier toonden CeO₂ ENP's kunnen hier alle fytoplankton beïnvloeden, behalve Thalassiosira pseudonana. CeO₂ ENP's kunnen, zoals SiO_2, hebben de mogelijkheid om de EPS-afgifte van bepaald fytoplankton te stimuleren voor olieverzachtende toepassingen.

Conclusies

De interactie tussen het ENB en het mariene milieu wordt steeds belangrijker door de huidige en toekomstige lozingen van nanomaterialen. Hier demonstreren we verbeterde EPS-secretie als een van de belangrijkste effecten van ENP's op fytoplankton. We leveren ook bewijs dat verschillende soorten fytoplankton verschillend kunnen reageren op verschillende ENB-stress door Ca²⁺ te reguleren paden. Voor een volledige beoordeling van ENB's voor het mariene ecosysteem zou echter nader onderzoek nodig zijn om gedetailleerde kennis en begrip te krijgen van de interacties tussen nanomaterialen en mariene organismen.

EPS-release geactiveerd door verschillende ENP's. Verschillende fytoplanktoncellen a Dunaliella tertiolecta , b Thalassiosira pseudonana , c Skeletonema grathae , d Phaeodactylum tricornutum , en e Odontella mobiliensis werden behandeld met TiO₂ (cirkels), SiO₂ (driehoeken), CeO₂ (vierkantjes), met concentraties van respectievelijk 5 mg/ml en 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,1 mg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml (n = 3)

Methoden

Fytoplanktoncultuur

Batchculturen van Odontella mobiliensis (CCMP597), Dunaliella tertiolecta (UTEX999), Skeletonema grethae (CCMP775), Phaeodactylum tricornutum (UTEX646), Thalassiosira pseudonana (Provasoli - Guillard mariene fytoplankton-cultuurcollectie, West Boothbay Harbor, MN, VS) werden gekweekt in L1 marien medium (Sigma, MO, VS) op een 14:10 (licht:donker) cyclus bij 100 μmol m⁻² s⁻¹ en 24 ° C onder axenische omstandigheden. De groeifase van de kweek werd bepaald door celtelling met een hemocytometer.

Nanodeeltjes en karakterisering

Alle ENP's, TiO₂ , SiO₂ , CeO₂ (Sigma-Aldrich, MO, VS), werden vóór gebruik in zuiver water gesoniceerd. ENP's werden gereconstitueerd met gefilterd L1-medium (Sigma, MO, VS) voordat ze werden getest. De grootte van ENP's werd onafhankelijk bevestigd met behulp van homodyne dynamics laser scattering (DLS). In het kort werden zeewatermonsters opnieuw gefiltreerd door een Millipore-membraan van 0,22 μm (voorgewassen met 0,1 N HCl) en rechtstreeks in vijf 10 ml verstrooiingscellen gegoten die vervolgens in de goniometer van een Brookhaven BI-200SM-laserspectrometer (Brookhaven Instruments, New York, VS). De autocorrelatiefunctie van de onder een hoek van 45° gedetecteerde fluctuaties in de verstrooiingsintensiteit werd on-line verwerkt door een Brookhaven BI 9000AT autocorrelator en de deeltjesgrootteverdeling werd berekend met de CONTIN-methode (Provencher, 1982). Resultaten van elk monster werden direct na sonicatie in drievoud verzameld. Kalibratie van de DLS-spectrometer werd uitgevoerd met behulp van standaardsuspensies van monodisperse latexmicrosferen (Polysciences, PA, VS).

ENP-behandeling

De fytoplanktoncellen werden 24 uur gekweekt in een plaat met 96 putjes met L1-medium. Cellen werden behandeld met ENP-voorraden:5 mg/ml en 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,1 mg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml van de TiO₂ , SiO₂ , en CeO₂ (Sigma-Aldrich, MO, VS) of L1-medium (controle) gedurende 48 uur. Het supernatant dat uitgescheiden EPS bevat, werd verzameld en kort gecentrifugeerd bij 4000 tpm om de resterende ENP's te verwijderen. Dit protocol is aangepast van onze vorige publicatie [34]. Het hier gebruikte concentratiebereik is niet bedoeld om de huidige ENB-niveaus in het milieu weer te geven of na te bootsen, maar is bedoeld om de volledige potentiële impact van ENP's op marien fytoplankton te beoordelen en de bijbehorende cellulaire mechanismen te onderzoeken. Als veelbelovend opkomend nanomateriaal hebben ENP's hun volledige commerciële capaciteit nog niet bereikt. Een gedetailleerde beoordeling van hun volledige ecologische effecten is hard nodig voordat ENB's de commerciële en huishoudelijke productmarkt betreden om meer ENP's in de oceaan te introduceren.

Enzym-Linked Lectine Assay (ELLA)

Het supernatant dat uitgescheiden polysacharide bevat, werd verzameld en kort gecentrifugeerd bij 1700 rcf (Megafuge 1.0R) om de resterende ENP's te verwijderen. Het supernatant werd vervolgens een nacht bij 4 ° C geïncubeerd in een plaat met 96 putjes (Nunc MaxiSorp, VWR, CA, VS). Daarna werd de plaat met 96 putjes gewassen met PBST (PBS +-0,05% Tween-20) en PBS en vervolgens geblokkeerd met 1% BSA. De plaat met 96 putjes werd opnieuw gewassen met PBST en PBS en geïncubeerd met lectine (Concanavalin A, ConA) (Sigma-Aldrich, MO, VS), geconjugeerd aan mierikswortelperoxidase (HRP; 5 mg/ml) (Sigma-Aldrich, MO , VS), gedurende 1 uur bij 37 ° C. Het substraat, 3,39,5,59-tetramethylbenzidine (TMB; Sigma-Aldrich, MO, VS), werd bij kamertemperatuur aan elk putje toegevoegd, gevolgd door H₂ SO4 (Sigma-Aldrich, MO, VS) om de reactie te beëindigen. De optische dichtheid werd gemeten bij 450 nm door PerkinElmer VICTOR3 (MA, VS). Dit protocol is aangepast van onze vorige publicatie [34, 52].

DNA-bepaling

De pellet met fytoplankton werd verzameld en verkregen de ZR-96 Quick-gDNA-kit (ZYMO Research, CA, VS). In het kort werd 4x lysisbuffer gebruikt om fytoplanktoncellen te breken en door de DNA-bindingskolom te stromen, uiteindelijk geëlueerd door elutiebuffer. DNA-concentraties werden gemeten met NanoDrop ND-1000 (Thermo, CA, VS). Het protocol is aangepast van het gefabriceerde kitprotocol.

Metingen van intracellulair Ca²⁺ Concentraties veroorzaakt door ENP's

De fytoplanktoncellen werden vervolgens gedurende 60 minuten geladen met een Fluo-4AM-kleurstof (1 mM) (Kd =-335 nM, λEx = 494 nm en λEm = 506 nm, ThermoFisher, CA, VS). Na het laden van de kleurstof werden de fytoplanktoncellen gespoeld, geïncubeerd met L1-medium en behandeld met de 1 mg/ml TiO₂ , SiO₂ , en CeO₂ respectievelijk. Alle calciumsignaleringsexperimenten werden uitgevoerd op een Nikon-microscoop (Nikon Eclipse TE2000-U, Tokyo, Japan). Protocol en voorwaarden zijn aangepast van eerdere publicaties [31, 34].

Zetapotentieel van ENP-meting

Om de oppervlakteladingen van ENP's te meten, werd de zeta-potentiaal (ζ) van ENP's gemeten met een Zetasizer Nano ZS, Malvern, in aanwezigheid van kunstmatig zeewater van 25 ° C. Nadat de gegevens van elk monster waren verzameld, werden de geregistreerde waarden gemiddeld.

Statistische analyse

De gegevens worden gerapporteerd als gemiddelden ± SD. Elk experiment werd ten minste drie keer onafhankelijk uitgevoerd. Histogrammen zijn gemaakt door GraphPad Prism 6.0. (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, VS).

Een tweestapsmethode om de invloed van aggregatie/agglomeratie van nanodeeltjes op Young's Modulus of Polymer Nanocomposites te bestuderen Hybride UV-ozon-behandelde rGO-PEDOT:PSS als een efficiënt gattransportmateriaal in omgekeerde vlakke perovskiet-zonnecellen

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal