Magnetisch poly(N-isopropylacrylamide) nanocomposieten:effect van bereidingsmethode op antibacteriële eigenschappen
Abstract
De meest uitdagende taak bij de bereiding van magnetisch poly(N-isopropylacrylamide) (Fe3 O4 -PNIPAAm) nanocomposieten voor bio-toepassingen is om hun reactiviteit en stabiliteit te maximaliseren. Emulsiepolymerisatie, in situ precipitatie en fysische toevoeging werden gebruikt om Fe3 . te produceren O4 -PNIPAAm-1, Fe3 O4 -PNIPAAm-2 en Fe3 O4 -PNIPAAm-3, respectievelijk. Hun eigenschappen werden gekarakteriseerd met behulp van scanning-elektronenmicroscopie (morfologie), zeta-potentiaal (oppervlaktelading), thermogravimetrische analyse (stabiliteit), vibrerende monstermagnetometrie (magnetisatie) en dynamische lichtverstrooiing. Bovendien onderzochten we het antibacteriële effect van elk nanocomposiet tegen Gram-negatieve Escherichia coli en Gram-positieve Staphylococcus aureus . Beide Fe3 O4 -PNIPAAm-1 en Fe3 O4 -PNIPAAm-2 nanocomposieten vertoonden hoge thermische stabiliteit, zeta-potentiaal en magnetisatiewaarden, wat wijst op stabiele colloïdale systemen. Over het algemeen is de aanwezigheid van Fe3 O4 -PNIPAAm-nanocomposieten veroorzaakten, zelfs bij lagere concentraties, aanzienlijke schade aan zowel E. coli en S. aureus DNA en leidde tot een afname van de levensvatbaarheid van de cellen. Fe3 O4 -PNIPAAm-1 vertoonde een sterker antimicrobieel effect tegen beide bacteriestammen dan Fe3 O4 -PNIPAAm-2 en Fe3 O4 -PNIPAAm-3. Staphylococcus aureus was gevoeliger dan E. coli aan alle drie magnetische PNIPAAm-nanocomposieten.
Achtergrond
Magnetische thermoresponsieve polymeer nanocomposieten zijn gebruikt voor een breed scala aan toepassingen, waaronder waterbehandeling en nanogeneeskunde [1,2,3,4]. Elke nanocomposiet is specifiek ontworpen om te profiteren van de combinatie van eigenschappen die inherent zijn aan beide componenten, d.w.z. magnetische deeltjes en temperatuurgevoelige polymeren, waardoor een nanocomposiet wordt gecreëerd dat specifieker en controleerbaarder is. Magnetiet (Fe3 O4 ) nanodeeltjes verlenen magnetische eigenschappen die een snelle en gemakkelijke scheiding mogelijk maken na het aanleggen van een extern magnetisch veld [5]. Poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) vormt een driedimensionale hydrogel die een omkeerbare faseovergang met lagere kritische oplossingstemperatuur (LCST) ondergaat van een enkele spoel met een gezwollen gehydrateerde toestand naar een ingeklapte en gekrompen gedehydrateerde toestand [6] bij verhitting in water boven 32 °C. Het afdekken van de magnetische nanodeeltjes met een PNIPAAm-laag zorgt niet alleen voor colloïdale stabiliteit in water, maar zorgt ook voor oppervlaktefunctionaliteit door binding met andere moleculen, zoals medicijnen, eiwitten of enzymen [7]. De constructie van dubbel reagerende nanocomposieten wordt bereikt door twee eigenschappen te combineren die gelijktijdig reageren op een combinatie van temperatuur en magnetisme. De meest gebruikte methoden voor de synthese van Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposieten zijn fysische additie, in situ precipitatie en emulsiepolymerisatie. Fysieke toevoeging, de eenvoudigste methode, vereist het fysiek mengen van eerder gesynthetiseerde magnetische nanodeeltjes en PNIPAAm-deeltjes. De tweede methode, in situ precipitatie, omvat precipitatie van magnetische nanodeeltjes in aanwezigheid van het PNIPAAm nanopolymeer [8]. De derde (en meest voorkomende) route, emulsiepolymerisatie, vereist polymerisatie van het (N-isopropylacrylamide) monomeer in aanwezigheid van magnetische nanodeeltjes [9,10,11]. Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposieten zijn wijdverbreid gebruikt in biomedische en biotechnologische toepassingen. Er zijn zeer stabiele, gecontroleerde en goed verspreide magnetische nanodeeltjes nodig om de geschiktheid van dergelijke nanocomposieten voor toekomstige toepassingen te vergroten. Een recente innovatie betreft een extern magnetisch veld dat een lokale warmtebron creëert voor zelfverwarmende deeltjes, waardoor de PNIPAAm krimpt en op zijn beurt ingekapselde medicijnen vrijkomen [12]. Dit fenomeen, in combinatie met magnetische kralen gericht op tumoren, opent andere potentiële kankertherapieën zoals hyperthermie. Hyperthermie kan worden geïnitieerd door oscillerende nanodeeltjes in een oscillerend magnetisch veld met frequenties variërend van kilohertz tot megahertz. Overige Fe3 O4 -PNIPAAm-nanocomposieten zijn onlangs gesynthetiseerd om de afgifte van bio-actieve moleculen, zoals myoglobine of vitamine B12, en voor medicijnafgifte te regelen [13]. Een recent onderzoek met PNIPAAm-gecoate superparamagnetische Fe3 O4 nanodeeltjes konden aantonen dat thermisch geïnduceerde aggregatie van ijzeroxide-nanodeeltjes het T2-contrast aanzienlijk verhoogt tijdens magnetische resonantiebeeldvorming [14]. Duidelijk, Fe3 O4 -PNIPAAm is veelbelovend voor toekomstige ontwikkelingen in zowel biomedische als biotechnologische toepassingen. Daarom is het belangrijk dat er verder onderzoek wordt gedaan naar de biocompatibiliteit van dit materiaal en zijn antibacteriële werking.
In deze studie onderzochten we het effect van drie bereidingsmethoden op de fysisch-chemische eigenschappen van Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposieten. Daarbij willen we de meest geschikte bereidingsmethode beoordelen voor het produceren van nanocomposieten met verbeterde eigenschappen voor biologische toepassingen. Voor het eerst beschrijven we ook de antibacteriële effecten van de drie Fe3 O4 -PNIPAAm-nanocomposieten met behulp van een multi-endpointbenadering, bacteriële groeisnelheid, levensvatbaarheid, celmorfologie en mate van DNA-schade.
Methoden
Chemische stoffen
IJzer(III)chloride-hexahydraat (FeCl3 .6H2 O, ≥ 98%), IJzer(II)chloridetetrahydraat (FeCl2 .4H2 O, ≥ 99%), ammoniumhydroxide (26% NH3 in H2 O), N-isopropyl-acrylamide (NiPAM, ≥ 99%), N,N-methyleenbis(acrylamide) (BIS, ≥ 99%), natriumdodecylsulfaat (SDS, ≥ 99%) en ammoniumpersulfaat (APS, ≥ 98.5 %) werden allemaal vers gekocht bij Sigma-Aldrich, Duitsland.
Bereiding van PNIPAAm door emulsiepolymerisatie
NiPAM (4 g), BIS (0,2 g) en SDS (0,3 g) werden opgelost in 350 ml gedeïoniseerd water (DI) bij 70 ° C onder atmosferische stikstof. APS (0,0035 g) werd opgelost in 1 ml DI en toegevoegd aan het reactievat om de reactie te starten. Na 4 uur werd de reactie gestopt en werden de bereide deeltjes gewassen met DI-water. Ten slotte werden de PNIPAAm-nanodeeltjes gescheiden door centrifugatie (12.000 tpm gedurende 30 min) en gebruikt in verdere reacties.
Voorbereiding van magnetiet (Fe3 O4 ) Nanodeeltjes
FeCl2 ·4H2 O (1,9 g) en FeCl3 ·6H2 O (5,4 g) (molverhouding 1:2) werd opgelost in DI (100 ml) en verwarmd tot 70 ° C. Ammoniumhydroxide (NH4 OH; 6 ml) werd snel aan de oplossing toegevoegd, wat onmiddellijk een diepzwart magnetisch precipitaat produceerde. Eindelijk, de Fe3 O4 suspensie van nanodeeltjes werd 30 minuten bij 70 ° C geroerd. Het product werd meerdere keren gewassen met DI, waarna de Fe3 O4 nanodeeltjes werden gedroogd in een roterende verdamper (25 mbar bij 40°C) totdat een fijn poeder was gevormd. Dit werd gebruikt in alle verdere reacties.
Voorbereiding van magnetische PNIPAAm-nanocomposiet door emulsiepolymerisatie (Fe3 O4 -PNIPAAm-1)
NiPAM (0,4 g), vers bereide Fe3 O4 nanodeeltjes (0,2 g), BIS (0,2 g) en SDS (0,3 g) werden opgelost in 350 ml DI en onder een stikstofatmosfeer tot 70 ° C verwarmd. APS (0,0035 g) werd vervolgens opgelost in 1 ml DI en toegevoegd aan het reactievat om de reactie te starten. Na 4 uur werd de reactie gestopt en het bereide nanocomposiet gewassen met DI. Eindelijk, Fe3 O4 -PNIPAAm-1 werd afgescheiden door centrifugeren (12.000 rpm gedurende 30 min) en vervolgens gedroogd met behulp van een roterende verdamper (25 mbar bij 40 ° C). Het poedervormige materiaal werd in het donker bij kamertemperatuur bewaard.
Voorbereiding van magnetische PNIPAAm-nanocomposiet door in situ-precipitatie (Fe3 O4 -PNIPAAm-2)
FeCl2 (0,148 g), FeCl3 (0,4 g) en 10 ml DI werden goed gemengd en toegevoegd aan 1 g PNIPAAm. NH4 OH (3 ml) werd vervolgens snel aan de oplossing toegevoegd, wat onmiddellijk een diepzwart magnetisch precipitaat produceerde. De suspensie werd vervolgens 30 min bij 70°C geroerd. Het bereide nanocomposiet werd gewassen met DI, waarna de Fe3 O4 -PNIPAAm-2 werd afgescheiden door centrifugatie (12.000 rpm gedurende 30 min) en gedroogd met een roterende verdamper (25 mbar bij 40 °C). Het resulterende poeder werd in het donker bij kamertemperatuur bewaard.
Voorbereiding van magnetische PNIPAAm-nanocomposiet door fysieke toevoeging (Fe3 O4 -PNIPAAm-3)
Vers bereide PNIPAAm (1 g), vers bereide Fe3 O4 nanodeeltjes (0,5 g) en DI (5 ml) werden goed gemengd en de resulterende suspensie werd 30 minuten bij 70 ° C geroerd. Het aldus bereide nanocomposiet werd gewassen met DI, waarna de Fe3 O4 -PNIPAAm-3 werd afgescheiden door middel van centrifugatie (12.000 rpm gedurende 30 min) en gedroogd met een roterende verdamper (25 mbar bij 40 °C). Het poedervormige materiaal werd in het donker bij kamertemperatuur bewaard.
Nanocomposietenkarakterisering
De grootte en zeta-potentiaal van de Fe3 O4 -PNIPAAm-nanocomposieten werden gemeten na volledige oplossing van de nanodeeltjes in DI (verspreiding in DI gevolgd door sonificatie gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur). Zeta-potentiaalmetingen werden uitgevoerd met behulp van een Zetasizer Nano-analysator (Malvern Instruments, VS) bij pH 7. Een Zetasizer Nano-eenheid voor dynamische lichtverstrooiing (DLS) werd gebruikt om de hydrodynamische diameter van deeltjesaggregaten in DI te meten. Thermogravimetrische analyse (TGA) werd uitgevoerd om de hoeveelheid coating te kwantificeren en om de thermische stabiliteit van het nanocomposiet te bepalen. Thermische studies werden uitgevoerd op 3-4 mg droog monster bij temperaturen van 25 tot 900 ° C, met behulp van een TGA Q500 (TA Instruments, VS) onder een stikstofatmosfeer (verwarmingssnelheid 10 ° C/min). De magnetische eigenschappen van het materiaal werden gemeten met behulp van een MicroMag™ 2900 vibrerende monstermagnetometer (Princeton metingen Corporation, VS). Microscopiebeelden werden verkregen met behulp van een scanning elektronenmicroscoop (SEM), waarbij de deeltjes eerst grondig werden opgelost in DI en een druppel van de oplossing werd geplaatst op het koperen rooster van een Zeiss ULTRA Plus veldemissie SEM uitgerust met een Schottky-kathode. Alle afbeeldingen zijn geanalyseerd met Smart SEM-software v 5.05 (Zeiss, Duitsland) voor beeldvorming op 1,5 kV.
Bacteriële stammen en media
Gram-negatieve Escherichia coli CCM3954 en Gram-positieve Staphylococcus aureus CCM 3953 (Brno, Tsjechië) werd voor alle experimenten gebruikt. Gedetailleerde informatie over de stammen is te vinden op de webpagina van de 'Czech Collection of Micro-organismen' (http://www.sci.muni.cz/ccm/). Elke bacteriecultuur werd vers bereid en een nacht bewaard in een soja-voedingsbouillon (Sigma-Aldrich) voordat de biologische experimenten werden uitgevoerd.
DNA-schade
Comet-assays werden uitgevoerd volgens de methodologie van Singh et al. [15] en Solanky et al. [16]. Alle chemicaliën zijn gekocht bij PENTA (Tsjechië), tenzij anders vermeld. Een verse bacteriecultuur (aangepast op 10 7 cellen/ml) werd een nacht gekweekt en vervolgens geïncubeerd met twee concentraties (0,1 en 1 g/l) PNIPAAm en elk van de Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposieten gedurende 30 min bij 37°C.
Een microgel werd bereid door 100 ml agarose op het matte oppervlak van een objectglaasje te plaatsen en dit te bedekken met een dekglas van 24 × 50 mm (ThermoFisher Scientific, VS). De objectglaasjes werden gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur gelaten, waarna de dekglaasjes werden verwijderd en de objectglaasjes werden gedroogd. Deze gedroogde agaroselaag (eerste laag) zorgde voor een stevige basis voor volgende lagen. Na blootstelling van de bacteriën aan de PNIPAAm en Fe3 O4 -PNIPAAm-nanocomposieten gedurende 30 minuten, 2 μl (met ongeveer 10.000 blootgestelde cellen) werd genomen en gemengd met 100 μl vers bereide 0,5% agarose. Dit mengsel werd op gematteerde objectglaasjes gepipetteerd en onmiddellijk bedekt met een dekglas (tweede laag). De objectglaasjes werden vervolgens afgekoeld in een stalen bak op ijs. De dekglaasjes werden na 1 minuut verwijderd en een derde laag van 100 μl lysis-agarose (inclusief 0,5% agarose met 5 μg/ml RNAse A [Ameresco, VS], 0,25% natrium N-lauroylsarcosine en 0,5 mg/ml lysozyme) werd geproduceerd, opnieuw met behulp van een dekglas. De objectglaasjes werden vervolgens 10 minuten op ijs gelaten en vervolgens 30 minuten bij 37 ° C in een vochtige kamer geplaatst. Na het verwijderen van het dekglas werden de objectglaasjes ondergedompeld in een lyseeroplossing die 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA-tetranatriumzout, 10 mM tris-buffer met pH 10, 1% natriumlauroylsarcosine en 1% triton X-100 bevatte. Na 1 uur lysis bij kamertemperatuur werden de objectglaasjes overgebracht naar een enzymdigestieoplossing die 2,5 M NaCl, 10 mM EDTA en 10 mM Tris pH 7 bevatte. Vier buffers met 1 mg/ml proteïnase K. De objectglaasjes werden vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 2 uur, waarna ze werden geplaatst op de horizontale plaat van een elektroforetische eenheid (Scie-plas, VK) en geëquilibreerd met 300 mM natriumacetaat en 100 mM pH 9 tris-buffer gedurende 20 minuten en vervolgens geëlektroforeerd bij 12 V (0,4 V/cm, ongeveer 100 mA) gedurende 30 min. Na elektroforese werden de objectglaasjes gedurende 20 minuten ondergedompeld in 1 M ammoniumacetaat in ethanol (5 ml 10 M ammoniumacetaat en 45 ml absolute ethanol), 0,5 uur absolute ethanol en 10 minuten 70% ethanol, waarna de objectglaasjes werden bij kamertemperatuur aan de lucht gedroogd. Om uniforme kleuring te verkrijgen, werden de objectglaasjes voorbehandeld met 50 ml van een vers bereide oplossing van 5% TE-buffer en 10 mM NaH2 PO4 . De objectglaasjes werden vervolgens 30 minuten gekleurd met 50 μl van een vers bereide 1 mM oplossing van SYBR-kleuring (Sigma-Aldrich, VS) in TE-buffer. Migratie van DNA-strengbreuken (kometen) werd gevisualiseerd met behulp van een AxioImager-fluorescentiemicroscoop bij een vergroting van × -400 en AxioVision v 4-software (Zeiss, Duitsland). Gewoonlijk werd voor elk monster een staartlengte van 50 kometen afzonderlijk gemeten.
Bacteriële groeisnelheid, cellevensvatbaarheid en morfologie
Het experimentele protocol volgde dat beschreven in Darwish et al. [17]. Kortom, een Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposiet voorraadsuspensie (10 g/l) werd toegevoegd aan verse bacteriecultuur om eindconcentraties van 0,01, 0,05, 0,5 en 1 g/l te verkrijgen. Elke concentratie werd in drievoud geproduceerd in een plaat met 24 putjes. Negatieve controles, bestaande uit bacteriële cellen alleen in groeimedia en Fe3 O4 -PNIPAAm-nanocomposiet alleen in groeimedia werden parallel uitgevoerd. De plaat werd vervolgens bij 37 ° C geïncubeerd, waarna de optische dichtheid van het monster elke 2 uur gedurende 6 uur werd gemeten bij 600 nm (OD600) met behulp van een Synergy ™ HTX-plaatlezer (Biotek, VS). Bacteriële groeisnelheid werd gedefinieerd als de lineaire R-regressie van de OD600-meting (absorptie-eenheden, AU) versus incubatietijd in uren. Voorlopige metingen van nanocomposietmonsters zonder cellen (6 uur bij 600 nm) lieten constante absorptiewaarden zien die niet interfereerden met absorptiewaarden van nanocomposieten gemeten met bacteriële cellen.
De effectieve concentratie van nanocomposiet bij 10% remming (EC10) op bacteriële groeisnelheid (µ ) werd berekend voor elke vorm van Fe3 O4 -PNIPAAm gebaseerd op de vergelijking:I (%) =(µ C −µ T )/µ C ×100, waar I is remming, µ C is de gemiddelde waarde van de controlegroeisnelheid en µ T is de groeisnelheid van de cultuur die wordt beïnvloed door het nanocomposiet [18].
Na een incubatie van 24 uur werden aliquots van 100 l van elk monster gedurende 15 minuten in het donker gekleurd met behulp van de L7007 Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, Invitrogen, VS). Bepaling van het aandeel levende (Ex/Em 485/528 nm) en dode cellen (Ex/Em 485/645 nm) werd uitgevoerd met behulp van een Synergy™ HTX-plaatlezer (Biotek, VS). Het percentage dode cellen werd berekend als de verhouding van dode tot levende cellen. Tegelijkertijd zijn afbeeldingen van E. coli en S. aureus werden verkregen met behulp van een AxioImager-fluorescentiemicroscoop (Zeiss, Duitsland) met Ex/Em 470/490-700 nm. De lengte van E. coli cellen en oppervlakte van S. aureus celclusters werden bepaald bij een vergroting van × 600 met behulp van AxioVision v 4-software (Zeiss, Duitsland).
Statistische analyse
Verschillen tussen bacteriestammen geïncubeerd in PNIPAAm, verschillende Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposieten en controlemonsters zonder nanocomposieten werden getest met behulp van ANOVA en Dunnett's test (GraphPad PRISM, VS).
Resultaten
In deze studie hebben we Fe3 . gesynthetiseerd O4 -PNIPAAm nanocomposiet met drie verschillende protocollen:emulsiepolymerisatie (Fe3 O4 -PNIPAAm-1), in situ precipitatie (Fe3 O4 -PNIPAAm-2) en fysieke toevoeging (Fe3 O4 -PNIPAAm-3). SEM-beeldvorming toonde aan dat het type protocol dat werd gebruikt een duidelijk effect had op de monstermorfologie en deeltjesgrootte, met Fe3 O4 -PNIPAAm-1, Fe3 O4 -PNIPAAm-2 en Fe3 O4 -PNIPAAm-3 met een brede grootteverdeling, agglomeratie als gevolg van hoge oppervlakte-energie tussen nanodeeltjes en aanwezigheid van magnetische dipolaire interacties ( Afb. 1 ) .
Scanning elektronenmicroscoop beelden en histogrammen van PNIPAAm (a ), Fe3 O4 -PNIPAAm-1 (b ), Fe3 O4 -PNIPAAm-2 (c ) en Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (d ). Schaalbalk = 200 nm
TGA gaf aan dat de Fe3 O4 -PNIPAAm-monsters werden relatief stabiel bij temperaturen boven 400 ° C (Fig. 2). Over het algemeen vertoonden PNIPAAm-nanodeeltjes een lager restgehalte dan de Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposieten. Zeta-potentiaalwaarden voor oppervlaktelading waren − 1,58 mV voor PNIPAAm, − 15,6 mV voor Fe3 O4 -PNIPAAm-1, − 16,4 mV voor Fe3 O4 -PNIPAAm-2 en − 1.8 mV voor Fe3 O4 -PNIPAAm-3. De waarden van de vibrerende magnetometer voor magnetisatieverzadiging waren 50,4 emu/g voor Fe3 O4 -PNIPAAm-1, 53,7 emu/g voor Fe3 O4 -PNIPAAm-2 en 21,0 emu/g voor Fe3 O4 -PNIPAAm-3. Dynamische lichtverstrooiing boven (45 °C) en lager (25 °C) LCST gaf een hydrodynamische grootte aan voor PNIPAAm van 50 nm bij 25 °C en 27 nm bij 45 °C; 412 nm bij 25 °C en 197 nm bij 45 °C voor Fe3 O4 -PNIPAAm-1; 212 nm bij 25 °C en 130 nm bij 45 °C voor Fe3 O4 -PNIPAAm-2 en 122 nm bij 25 °C en 60 nm bij 45 °C voor Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (Fig. 3).
Thermogravimetrische analyse van PNIPAAm (a), Fe3 O4 -PNIPAAm-1 (b), Fe3 O4 -PNIPAAm-2 (c) en Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (d)
Dynamische lichtverstrooiing onder (25 °C) en boven (45 °C) de faseovergang van de lagere kritische oplossingstemperatuur voor PNIPAAm (a ), Fe3 O4 -PNIPAAm-1 (b ), Fe3 O4 -PNIPAAm-2 (c ) en Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (d )
Fe3 O4 -PNIPAAm Nanocomposiet-effect op het bacteriële DNA
Na een korte blootstelling van 30 minuten werden DNA-strengbreuken bepaald voor zowel E. coli en S. aureus in cellen die zijn behandeld met de Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposieten, 40% EtOH (positieve controle) en onbehandelde cellen (negatieve controle). Alle Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposieten vertoonden een vergelijkbaar significant effect (P <0,001) op gemiddelde E. coli en S. aureus komeetstaartlengte bij alle concentraties (Fig. 4), vergeleken met controlecellen die zijn geïncubeerd zonder nanocomposieten.
Een voorbeeld van een Escherichia coli komeetstaart, na behandeling met Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (a ). Resultaten van DNA-strengbreuken (lengte van komeetstaart) voor Escherichia coli (b ) en Staphylococcus aureus (c ) 30 min geïncubeerd met 40% EtOH (positieve controle), zonder nanocomposieten (negatieve controle), PNIPAAm (0,1 en 1 g/l) en (1) Fe3 O4 -PNIPAAm-1, (2) Fe3 O4 -PNIPAAm-2 en (3) Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (foutbalken vertegenwoordigen SD voor komeetlengte van 50 cellen). Significantieniveau ***P < 0,001
Fe3 O4 -PNIPAAm Nanocomposiet antibacterieel effect
Groeisnelheden gaven aan dat Gram-positieve S. aureus was minder resistent dan Gram-negatieve E. coli op alle nanocomposieten na 6 uur blootstelling. Fe3 O4 -PNIPAAm-1 en Fe3 O4 -PNIPAAm-2 remden beide sterk de groei van bacteriën, vergeleken met PNIPAAm en Fe3 O4 -PNIPAAm-3, met E. coli groeisnelheid aanzienlijk verminderd van 0,08 naar 0,028 (P < 0.001) met Fe3 O4 -PNIPAAm-2 en 0,005 (P < 0.001) met Fe3 O4 -PNIPAAm-1 (1 g/l). Er werd geen effect waargenomen op E. coli groeisnelheid door PNIPAAm of Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (Fig. 5a). Ter vergelijking:de groeisnelheid van S. aureus werd beïnvloed door alle Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposieten en door de PNIPAAm nanodeeltjes. Bij lagere concentraties (0,01 g/l en 0,05 g/l) werd de groeisnelheid slechts licht verlaagd van 0,07 naar 0,06 (P <0,05). Bij hogere concentraties (0,5 en 1 g/l) was er echter een significante reductie van 0,07 naar 0,001 met PNIPAAm, 0,0 met Fe3 O4 -PNIPAAm-1, 0,01 met Fe3 O4 -PNIPAAm-2 en 0,009 met Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (alle P <0,001; Afb. 5b). Bovendien is de EC10 voor alle Fe3 O4 -PNIPAAm-nanocomposieten en de PNIPAAm-nanodeeltjescontrole was lager voor S. aureus dan die voor E. coli (Tabel 1).
Relatieve groeisnelheid van Escherichia coli (een ) en Staphylococcus aureus (b ) na 6 uur incubatie in verschillende concentraties (0,01, 0,05, 0,5 en 1 g/l) PNIPAAm (rode cirkels), Fe3 O4 -PNIPAAm-1 (oranje diamanten [1]), Fe3 O4 -PNIPAAm-2 (groene driehoekjes [2]) en Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (blauwe driehoekjes [3]). De foutbalken tonen SD berekend op basis van n = 3. Significantieniveau ***P < 0,001
Het percentage dode E. coli cellen namen toe met toenemende concentratie van Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposiet na 24 uur. PNIPAAm (0,5 en 1 g/l) veroorzaakte bijvoorbeeld een significante toename van E. coli dode cellen (20%) vergeleken met kweken zonder Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposiet (12%). Fe3 O4 -PNIPAAm-1 (0,5 g/l) resulteerde in tot 28% van de dode E. coli cellen en 32% bij 1 g/l (P < 0,001). Het effect van Fe3 O4 -PNIPAAm-2 was lager dan die van Fe3 O4 -PNIPAAm-1 en Fe3 O4 -PNIPAAm-3, waarbij het percentage dode cellen toenam van 13 tot 25% bij blootstelling aan concentraties van respectievelijk 0,01 en 1 g/l (P < 0,001). Met zowel 0,5 als 1 g/l, Fe3 O4 -PNIPAAm-3 resulteerde in ongeveer 25% dode cellen (P <0,001; Afb. 6a). Het percentage dode S. aureus cellen werden alleen significant beïnvloed door 1 g/l Fe3 O4 -PNIPAAm-1 en Fe3 O4 -PNIPAAm-3, met dode cellen tot respectievelijk 50 en 48% (P < 0,001). De controle zonder nanocomposieten bevatte ongeveer 18% dode cellen in lagere concentraties PNIPAAm, Fe3 O4 -PNIPAAm-1 en Fe3 O4 -PNIPAAm-3 was het aandeel dode cellen zelfs nog lager. PNIPAAm in concentraties van 0,5 en 1 g/l resulteerde in 25 en 30% (P <0,005) dode cellen, respectievelijk. Fe3 O4 -PNIPAAm-2 had geen effect op S. aureus culturen (Fig. 6b).
Percentage dode Escherichia coli (een ) en Staphylococcus aureus (b ) cellen na 24 uur blootstelling aan PNIPAAm en (1) Fe3 O4 -PNIPAAm-1, (2) Fe3 O4 -PNIPAAm-2 en (3) Fe3 O4 -PNIPAAm-3. Foutbalken tonen SD van n = 3. Betekenisniveaus *P < 0.05, **P < 0.005, ***P < 0,001
Er was geen verschil in gemiddelde E. coli cellengte (5 μm) en gemiddelde S. aureus celclustergebied (200 μm 2 ) voor elke nanocomposiet of de PNIPAAm-controle bij de laagste concentraties (0,1 g/l; Fig. 7). Bij hogere concentraties, E. coli lengte veranderde niet in aanwezigheid van Fe3 O4 -PNIPAAm-2, en S. aureus celgroepgebied in aanwezigheid van Fe3 O4 -PNIPAAm-1. Echter, E. coli lengte was significant groter in aanwezigheid van 1 g/l PNIPAAm (5,4 μm, P < 0,005), Fe3 O4 -PNIPAAm-1 (6 μm, P < 0.001) en Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (10 μm, P <0,001) (Fig. 7a), terwijl S. aureus vormden grotere clusters bij blootstelling aan PNIPAAm (1937 μm 2 , P < 0,001), Fe3 O4 -PNIPAAm-2 (924 μm 2 , P < 0.001) en Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (1722 μm 2 , P <0.001) (Fig. 7b).
Lengte van Escherichia coli cellen (a ) en gebied van cluster van Staphylococcus aureus cellen (b ) na 24-uurs incubatie met PNIPAAm en (1) Fe3 O4 -PNIPAAm-1, (2) Fe3 O4 -PNIPAAm-2 en (3) Fe3 O4 -PNIPAAm-3. De foutbalken tonen SD bepaald op basis van n = 50. Betekenisniveaus **P < 0.05 en ***P < 0,001
Discussie
Zowel de synthesemethode als de manier waarop magnetische nanodeeltjes aan de polymeermatrix werden toegevoegd, hadden een duidelijk effect op de intrinsieke fysisch-chemische eigenschappen van het magnetische Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposieten. Stapsgewijze synthese had een sterke invloed op de eigenschappen van nanocomposiet, wat resulteerde in veranderingen in de vorm van deeltjes, grootteverdeling, grootte en oppervlaktechemie, samen met daaropvolgende veranderingen in magnetische eigenschappen [19, 20]. Emulsiepolymerisatie (Fe3 O4 -PNIPAAm-1), een gemakkelijke en nauwkeurige methode, produceerde de stabiele nanocomposieten met een smalle deeltjesgrootteverdeling en de laagste neiging tot aggregatie, eigenschappen die bijzonder belangrijk zijn in biomedische toepassingen [17]. Geproduceerd als resultaat van zowel sterische als coulombafstoting, waren de deeltjesafmetingen voldoende klein om neerslag te vermijden [21]. De minst effectieve methode was fysieke toevoeging (Fe3 O4 -PNIPAAm-3). Het werd niet alleen geproduceerd via drie verschillende stappen, en daarom duurde het langer om het te bereiden, het resulterende nanocomposiet vertoonde een hogere aggregatie dan elk van de andere twee productiemethoden. Bovendien gaven onze resultaten aan dat Fe3 O4 -PNIPAAm-3 dat op deze manier is geproduceerd, bevat mogelijk ongewenste PNIPAAm en Fe3 O4 nanodeeltjesresiduen.
Polymeren kunnen zich hechten aan magnetische nanodeeltjes door fysieke (niet-covalente) of covalente bindingen, waarbij het resulterende hybride materiaal specifieke eigenschappen vertoont, afhankelijk van de gekozen synthetische route. Significante resuspensie van magnetische nanodeeltjes vindt plaats wanneer de bereiding plaatsvindt in het oplosmiddel waarin hybride nanodeeltjesvorming plaatsvindt, waarna aggregatie en segregatie een probleem kan worden. In dit geval kan in situ vorming van magnetische nanodeeltjes in veel gevallen een beter alternatief zijn. Bovendien, als de concentratie oppervlakteactieve stof te laag is, zal coalescentie de grootte van de druppeltjes veranderen, terwijl micellen zich kunnen vormen als de concentratie te hoog is, wat leidt tot micellaire nucleatie. In dit opzicht is het belangrijk dat de concentratie van oppervlakteactieve stoffen zorgvuldig wordt gekozen op basis van nauwkeurige karakterisering van oppervlakte-eigenschappen en mate van deeltjesmodificatie, om ervoor te zorgen dat het oppervlak van de anorganische deeltjes compatibel is met de polymeermatrix.
Om de magnetische eigenschappen van Fe3 . te evalueren O4 -PNIPAAm nanocomposieten, het is belangrijk om de inhoud van MNP's in de nanocomposiet te kennen. TGA werd gebruikt om de hoeveelheid MNP te kwantificeren en om de thermische stabiliteit van Fe3 . te onderzoeken O4 -PNIPAAm-nanocomposieten vergeleken met alleen PNIPAAm-nanodeeltjes. Alle drie Fe3 O4 -PNIPAAm-nanocomposieten vertoonden een hogere thermische stabiliteit dan PNIPAAm-nanodeeltjes, vermoedelijk vanwege de aanwezigheid van Fe3 O4 deeltjes in de matrix (Fig. 2). Hogere residuen in magnetische nanocomposieten kunnen worden toegeschreven aan de aanwezigheid van anorganisch Fe3 O4 verbindingen in de monsters, die zelfs bij hogere temperaturen standhielden.
Fe3 O4 -PNIPAAm-1 vertoonde de hoogste thermische nanocomposietstabiliteit, samen met het laagste verloren gewicht. Tot 200 °C was de belangrijkste bron van gewichtsverlies het verlies van water en fysieke adsorptie van de polymeerlaag [22]; boven 200 °C waren de verliezen echter voornamelijk te wijten aan de ontbinding van de chemische laag die de PNIPAAm hecht. Het monsterresidu, dat stabiel werd boven 400 °C, vertegenwoordigde 87% van het oorspronkelijke gewicht, wat overeenkomt met de hoeveelheid magnetische nanodeeltjes in het nanocomposiet. One aim of this preparation process was to produce a nanocomposite with magnetic properties preventing aggregation and enabling it to re-disperse rapidly as soon as the magnetic field is turned off. Such properties would allow its use in a range of different fields, including hyperthermic treatment of tumours, as contrasting agents in magnetic resonance imaging, in tissue repair, biomedical device coating, immunoassay, cell separation and biomagnetic separation of biomolecules [18, 23,24,25,26]. We tested our nanomaterials through magnetisation saturation, which assesses the maximum possible magnetisation of the substance beyond which no further change takes place despite an increase in the magnetic field. Our results showed Fe3 O4 -PNIPAAm-2 to have the highest magnetisation saturation level of the three nanocomposites tested. Our values were lower (53.7 emu/g) than those previously reported for uncoated Fe3 O4 nanoparticles (92 emu/g) [27], however, presumably due to surface order/disorder interactions in the magnetic spin moment and an increase in nanocomposite weight and volume due to the presence of the PNIPAAm polymer layer.
Of special interest as regards biomedical application is the behaviour of polymer-water solutions stable below a LCST [28]. After heating the prepared Fe3 O4 -PNIPAAm nanomaterials above the transition temperature, a coil-to-globule transition occurred, followed by inter-molecular association. All three Fe3 O4 -PNIPAAm nanomaterials displayed very similar behaviour, with all shrinking as temperature increased. PNIPAAm is widely used as a thermoresponsive polymer due to the proximity of its LCST (~ 30–32 °C) to physiological temperature. Furthermore, the thermo-responsibility of PNIPAAm has proved useful for drug release in vivo [28]. Nanoscale magnetic hydrogels based on PNIPAAm have now been developed for theranostic application, with those embedded with low concentrations of Fe3 O4 magnetic nanostructures resulting in an LCST of ~ 40 °C, making Fe3 O4 -PNIPAAm of especial interest for controlled drug release application [29].
SEM nanoparticle histograms displayed a broader size distribution than those using DLS (Fig. 1). Interpretation of DLS data involves the interplay of multiple parameters, however, including the size, concentration, shape, polydispersity and surface properties of the particles. Measurement of the hydrodynamic size of thermoresponsive samples in relation to temperature is a common method of characterising LCST behaviour, with nanoparticles shrinking as temperatures increase, soluble polymers precipitating and particle size increasing. As expected, PNIPAAm had a lower hydrodynamic size than the Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposites. Of the nanocomposites, Fe3 O4 -PNIPAAm-3 displayed the lowest hydrodynamic size and a narrow size distribution. Variability in hydrodynamic size is likely to be due to the presence of Fe3 O4 nanoparticles in the PNIPAM matrix, which increases both the particle dimension and aggregation in water (Fig. 3) [8].
All Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposites displayed antimicrobial properties (Table 2), with both Gram-negative and Gram-positive bacteria negatively affecting E. coli growth rate in the order Fe3 O4 -PNIPAAm-1 > Fe3 O4 -PNIPAAm-2 > Fe3 O4 -PNIPAAm-3 = PNIPAAm and S. aureus growth rate as Fe3 O4 -PNIPAAm-1 > Fe3 O4 -PNIPAAm-2 > Fe3 O4 -PNIPAAm-3 > PNIPAAm. Similarly, the antibacterial properties desired for medical applications such as biomedical device coatings and wound dressing materials have been confirmed for a number of new PNIPAAm composites, including ZnO-PNIPAAm, Ag-PNIPAAm and chitosan-PNIPAAm [23,24,25,26].
In comparison with the modified Fe3 O4 nanomaterials described in our earlier studies, the PNIPAAm-1, PNIPAAm-2 and PNIPAAm-3 nanocomposites all showed a stronger effect on both E. coli en S. aureus , with S. aureus EC10 growth inhibition ranging from 0.04 to 0.06 g/l for the three nanomaterials, while modified APTS-, PEG- and TEOS-MNPs ranged between 0.1 and 0.25 g/l [17], and polymer-coated Fe3 O4 (PEI-mC-, PEI- and OA-MNPs) had a value of 0.15 g/l [18]. Inhibition of bacterial growth could have been caused by several factors, including cell membrane damage, oxidative stress and cell elongation, resulting in the production of lethal cells. The cells could, on the other hand, survive such unfavourable conditions by employing repair enzymes, antioxidants and/or transient growth arrest. This could partly explain the phenomenon that in lower concentrations (0.01 and 0.05 g/l) of PNIPAAm, Fe3 O4 -PNIPAAm-1 and Fe3 O4 -PNIPAAm-3, the proportion of dead cells of S. aureus was lower after 24-h incubation than in control where no such factor inducing mobilisation of the defence/repair system was present. Higher concentrations of PNIPAAm and nanocomposites caused indeed significant increase in dead cells of E. coli en S. aureus corresponding well with significant decrease in growth rate of the cell cultures.
Exposure to 1 g/l of the nanocomposite resulted in changes to bacterial cell morphology, with greatest change to E. coli cell length caused by Fe3 O4 -PNIPAAm-3 > Fe3 O4 -PNIPAAm-1 > PNIPAAm > Fe3 O4 -PNIPAAm-2, and Fe3 O4 -PNIPAAm-3 > Fe3 O4 -PNIPAAm-2 > PNIPAAm > Fe3 O4 -PNIPAAm-1 for S. aureus clustering. This effect was also observed previously when the same bacteria were exposed to different functional magnetic nanoparticles [17]. Elongation of E. coli cells in the presence of nanocomposites is indicative of transient growth arrest and is evidence of an adaptive response to oxidative stress or DNA damage [30]. In the case of S. aureus , which is a biofilm formation species, the cells became embedded over a larger area than the nanocomposite-free control when exposed to PNIPAAm, Fe3 O4 -PNIPAAm-2 and Fe3 O4 -PNIPAAm-3 (Fig. 8). No S. aureus biofilm was produced when in contact with Fe3 O4 -PNIPAAm-1, possibly due to its stronger antibacterial properties. S. aureus usually produces a biofilm in harsh environments to protect the cells [31]; however, this could also have an adverse effect on the bacteria as nanocomposites can integrate through the biofilm and harm the cells, as has already been described for Pseudomonas sp. [32].
S. aureus cell culture without nanocomposites (a ) and the cells embedded in biofilm after incubation with nanocomposites for 24 h (b ). The scale bar is 10 μm
Iron could lead to DNA damage in bacterial cells as described in previous reviews [33, 34]; hence, we attempted to test whether our MNPs caused DNA damage to bacteria. The presence of Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations (0.01 or 1 g/l) caused significant damage to E. coli en S. aureus DNA, even after short exposures (30 min). To the best of our knowledge, this is the first acute genotoxicity study of magnetic composites on bacteria; as a result, we cannot compare our results with those of other authors directly. Previous studies have shown no genotoxicity attributable to PNIPAAm nanoparticles, however, and no decrease in cell viability when tested against two kinds of mammalian cell at nanoparticle concentrations of up to 800 mg/l [30]. On the other hand, previous genotoxicity studies on MNPs (γ-Fe3 O4 ) have shown a negative effect on human fibroblast cells at 100 mg/l [35]. Studies performed with mammalian cell lines, however, cannot be directly compared to studies done with bacterial cells, due to significant differences in eukaryotic and prokaryotic cells.
Conclusions
Magnetic poly(N-isopropyl-acrylamide) nanocomposites were prepared through emulsion polymerisation (Fe3 O4 -PNIPAAm-1), in situ precipitation (Fe3 O4 -PNIPAAm-2) and physical addition (Fe3 O4 -PNIPAAm-3). Both Fe3 O4 -PNIPAAm-1 and Fe3 O4 -PNIPAAm-2 showed higher values for surface charge and thermal stability, indicating a stable colloidal system. At room temperature, Fe3 O4 -PNIPAAm-3 displayed highest magnetisation saturation. Presence of Fe3 O4 -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations caused significant damage to both E. coli en S. aureus DNA, even after short exposure, and led to a decrease in cell viability. Overall, we suggest that Fe3 O4 -PNIPAAm-1, prepared through emulsion polymerisation, is the most appropriate method for producing a magnetic nanocomposite with high antimicrobial activity towards Gram-negative E. coli and Gram-positive S. aureus .
Afkortingen
- Fe3 O4 -PNIPAAm:
-
Magnetic poly(N-isopropylacrylamide)
- MNPs:
-
Magnetite nanoparticles
Nanomaterialen
- Bereidingsmethode en toepassing van wolfraam-reniumlegering:
- Toepassingen, eigenschappen en bereidingsmethoden van TZM-legering
- Wat is Superconductor:Types, Materials &Properties
- Preparatie en magnetische eigenschappen van kobalt-gedoteerde FeMn2O4-spinel-nanodeeltjes
- Op weg naar TiO2-nanovloeistoffen:deel 1:voorbereiding en eigenschappen
- Fotoluminescentie-eigenschappen van polymorfe modificaties van laagmoleculair poly(3-hexylthiofeen)
- Onderzoek naar de sorptie van zware metalen met behulp van nanocomposieten van met ijzer gemodificeerde biochar
- Effect van opsluiting op fotofysische eigenschappen van P3HT-ketens in PMMA-matrix
- Het effect van contactloos plasma op structurele en magnetische eigenschappen van Mn Х Fe3 − X О4 Spinels
- Verbeterde stabiliteit van gouden magnetische nanodeeltjes met poly(4-styreensulfonzuur-co-maleïnezuur):op maat gemaakte optische eigenschappen voor eiwitdetectie
- Synergetisch effect van grafeen en MWCNT's op microstructuur en mechanische eigenschappen van Cu/Ti3SiC2/C nanocomposieten