Bone Morphogenic Protein-2 (rhBMP2)-Loaded Silk Fibroin Scaffolds om de osteo-inductiviteit in botweefselengineering te verbeteren

Methoden

Voorbereiding van waterige oplossingen van SF/BMP2

Aanvankelijk werd SF geïsoleerd uit de cocons van de zijderups, Bombyx mori , als een waterige oplossing. Het vastgestelde protocol werd gevolgd met kleine aanpassingen [11]. Cocons werden gekookt in 100 ml 0,02 M Na₂ CO₃ gedurende 20 minuten en daarna grondig gespoeld met gedestilleerd water om overtollige in water oplosbare sericine en was te verwijderen. Geëxtraheerd fibroïne werd vervolgens gedurende 4 uur bij 60°C opgelost in 9 M lithiumbromide-oplossing en werd verder gedurende 4 dagen tegen water gedialyseerd. De eindconcentratie werd bepaald door de droge stof na droging te wegen en bleek 7% w . te zijn /v . Deze oplossing werd vervolgens gebruikt na concentratie tot verschillende niveaus door dialyse tegen 1 L 25% polyethyleenglycol (PEG, 10.000 g mol ⁻¹ ) oplossing bij kamertemperatuur. Verdunde waterige SF-oplossingen werden bereid door verdunning met gedestilleerd water en alle oplossingen werden tot verdere verwerking bij 10 ° C bewaard. Gevriesdroogd poeder van recombinant humaan botmorfogeen eiwit-2 (rhBMP2) werd opgelost in PBS (pH 3,8). De eiwitoplossing werd gesteriliseerd met 0,22 m spuitfilters en werd onder continu roeren als waterige oplossing aan elke fibroïneoplossing toegevoegd. Door glutaaraldehyde gemedieerde verknoping werd gebruikt om BMP te associëren met fibroïne. In het kort, voor 10 ml reactiemengsel werd 5 ml elk van 6% zijdefibroïne en 1% rhBMP2 verknoopt met 200 L glutaaraldehyde en 40 μL, 12 N HCl als groep-activerend middel. Met deze procedure werden drie oplossingen bereid:(i) 3% zijdefibroïne zonder rhBMP2 (SF), (ii) 3% zijdefibroïne met 0,5% rhBMP2 (SF+rhBMP2), en (iii) 12% zijdefibroïne met 0,125% van rhBMP2 zoals in (ii) (4SF+rhBMP2). Deze oplossingen werden gebruikt in elektrospinprocedures voor de fabricage van steigers.

Vervaardiging van steiger door Electrospinning

Voor de fabricage van steigers werd elke oplossing geladen in een glazen injectiespuit van 5 ml met een roestvrijstalen naald (25G, ID 0,26 mm, Sigma Aldrich) die is aangesloten op een 5,5 kV DC-voeding. Voor de bereiding van vezels werd de uitlaatstroomsnelheid gehandhaafd op 0,4 ml h ⁻¹ met behulp van een spuitpomp en elektrospun vezels werden verzameld op een aluminiumfolie die op een afstand van 15 cm van de capillaire punt werd gehouden. De monsters werden elk gedurende 4 uur verzameld.

Scanning-elektronenmicroscopie

Voor morfologisch onderzoek van geprepareerde steigers werd SEM uitgevoerd met behulp van Zeiss EVO40SEM. Monsters werden door sputteren met goud bekleed voordat de scanbeelden verder werden verwerkt. Bepaling van de vezeldiameter wordt gedaan door het gemiddelde te nemen van de diameters van 10 willekeurige vezels in het beeldframe.

Mechanische eigenschappen van steiger

Er werden compressie-experimenten uitgevoerd om de mechanische eigenschappen van ontwikkelde steigers te beoordelen met behulp van een Instron-elektromechanische tester met een enkele kolom op een tafelblad (model 3345, Instron, Canton, MA). Vezels met een diameter van 0,2 mm, verkregen door elektrospinnen bij langere duur, werden gebruikt om de treksterkte en rek bij breuk te bepalen uit de spanning-rekcurves bij 25 °C en 50% vochtigheid.

Zwellingonderzoek

Voor het meten van de zwelverhouding werd elke formulering bij 37°C opgelost in PBS (pH 7,4). Er werden monsters genomen met vooraf bepaalde tijdsintervallen en het drooggewicht werd gemeten met behulp van een elektronische balans. De test werd voortgezet totdat het evenwichtsgewicht was bereikt. De zwelverhouding werd als volgt uitgedrukt:

waar, W _o =aanvankelijk droog gewicht van de nanovezelmatrices en W _s =gewicht van de gezwollen nanovezelmatrices op elk tijdstip.

Celcultuur

Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC's) werden in de huidige studie gebruikt om het osteo-inductieve potentieel van de gefabriceerde nanoscaffolds te evalueren. hMSC's werden gekweekt en onderhouden in DMEM met 10% foetaal kalfsserum en 1% penicilline, bij 37 ° C in 5% CO₂ bevochtigde atmosfeer tot 90% samenvloeiing werd bereikt. Cellen werden vervolgens met trypsine behandeld, gecentrifugeerd en opnieuw in medium gesuspendeerd voor kwantificering.

Steigers werden gesteriliseerd door wassen met ethanol en 30 min bestralen met UV-licht en daarna gewassen met PBS (pH 7,4). Een behandeling met DMEM wordt aan scaffolds gegeven vóór het zaaien van cellen. 20 L celsuspensie werd druppelsgewijs aan elke steiger toegevoegd en plastic film diende als controle. Steigers werden in rust gehouden in een vochtige atmosfeer (37 °C, 5% CO₂ ) gedurende 30 minuten. Vervolgens werden scaffolds gedurende 21 dagen in DMEM geïncubeerd met elke andere dag regelmatige aanvulling van medium.

Celadhesietest

Om de adhesiecapaciteit van cellen met de steiger te beoordelen, werden de aantallen niet-gehechte cellen geteld na 1, 3 en 6 uur aanvankelijke zaaien volgens de methode in de literatuur met kleine aanpassingen [6]. Het celmedium werd verzameld en de celtelling werd gedaan met een hemocytometer. Het verschil tussen de aanvankelijke zaaitelling en het aantal niet-gehechte cellen werd beschouwd als het aantal aangehechte cellen. De resultaten werden uitgedrukt in procenten hechting volgens de volgende vergelijking:

Cytotoxiciteitstest

Om het toxische effect van nanovezelmatrices te meten, werd een MTT-test uitgevoerd. Na het respectieve tijdsbestek werden de constructen geïncubeerd in MTT-oplossing (1 mg ml ⁻¹ stockoplossing verdund in PBS (pH 7,4) in een verhouding van 1:10) en gedurende 4 uur geïncubeerd. Levensvatbare cellen zetten MTT tijdens deze incubatieperiode om in formazanzout. Het formazanzout werd opgelost door toevoeging van DMSO en gedurende 20 minuten opzij gehouden. De absorptie afkomstig van formazanzout werd kwantitatief gemeten door veranderingen in absorptie bij 570 nm te registreren met behulp van een microplaatlezer.

Celproliferatietest

Alamar blue (AB) kleurstofreductietest werd uitgevoerd om de proliferatie van cellen in de steiger te bepalen. Steigers werden gedurende 4 uur geïncubeerd in kleurstof verdund met DMEM en reductie in kleurstof werd spectrofotometrisch gemeten. Procent AB-reductie werd berekend als:

waar, ελ ₁ =molaire extinctiecoëfficiënt van alamar blauw bij 570 nm en ελ ₂ =de molaire extinctiecoëfficiënt van alamar blauw bij 600 nm, in de geoxideerde (ε _os ) en verminderd (ε _rood ) vormen. Aλ ₁ en Aλ ₂ duidde de absorptie van testputjes aan.

A'λ ₁ =absorptie van negatieve controleputje bij 570 nm.

A'λ ₂ =absorptie van negatieve controleputje bij 600 nm.

ALP-assay

De productie van alkalische fosfatase (ALP) door gekweekte hMSC in de scaffold werd gemeten volgens het protocol van de fabrikant in de kit [12]. In het kort werd steriele PBS (pH 7,4) gebruikt bij het wassen en incuberen van steigers, gevolgd door homogenisatie met 1 ml Tris-buffer (1 M, pH 8,0) en sonicatie gedurende 3 minuten op ijs. 25 μL van het lysaat werd vervolgens gedurende 5 minuten bij 30 ° C geïncubeerd met 1 ml p-nitrofenylfosfaatoplossing (16 mM). Spectrofotometrische metingen werden uitgevoerd bij 405 nm om de productie van p-nitrofenol in aanwezigheid van ALP te volgen.

In vivo ALP-activiteit

Negen mannelijke athymische naakte ratten, elk met een gewicht van 100-120 g, werden genomen en bilateraal in de buikspieren ontleed om buidels te creëren. Een naakt muismodel werd gebruikt om het osteo-inductieve potentieel van de scaffold in vivo aan te tonen. Een van de drie soorten steigers (5 mm x 5 mm) werd apart gesneden en in de spierzakjes verpakt. Het zakje werd vervolgens gesloten met een niet-resorbeerbare hechtdraad. Na 14 dagen operatie werden implantaten teruggewonnen door recti-buikspieren uit te snijden en in PBS bewaard. Spierflappen werden uitgesneden en explantaatweefsel werd verkregen dat werd gehomogeniseerd in extractiebuffer om alkalische fosfatase vrij te maken. Er werd een hoeveelheid van 50 L oplossing gebruikt voor het meten van ALP-activiteit.

Statistische analyse

Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd en de gepresenteerde gegevens zijn opgemaakt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van monsters, tenzij anders vermeld. Eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) werd uitgevoerd met behulp van statistische software Origin 6.0, om onzekere verschillen en significante verschillen te evalueren. P waarde van 0,05 of minder betekent significante verschillen tussen de onderzoeksgroepen.

Resultaten

Morfologie van steiger

SEM-afbeeldingen (Fig. 1) van de gefabriceerde steiger onthulden een fijngesponnen nanovezelstructuur. De gemiddelde diameters van vezels in SF- en SF+BMP2-steigers lijken vergelijkbaar te zijn, variërend van 100 tot 900 nm, bij alle concentraties, aangezien de diameter een functie blijkt te zijn van de tijd waarvoor elektrospinning werd uitgevoerd [13], terwijl SF nanovezels bleken uniform te zijn en BMP2-conjugatie leidde tot niet-uniformiteit in vezeldiameter. De poriegrootte van de steigers lijkt homogeen te zijn in de gefabriceerde steigers en bleek onafhankelijk te zijn van de concentratie van fibroïne. De concentratie van SF heeft geen significante invloed op de poriegrootte [11].

SEM-microfoto's van voorbereide steigers. een SF. b SF+rhBMP2. c 4SF+rhBMP2

Mechanische eigenschappen van steiger

Stress-rekkrommen van nanovezel-steigers zijn weergegeven in Fig. 2. Er werd waargenomen dat toevoeging van BMP de mechanische eigenschappen van SF-steiger niet verandert, maar met de toename van de concentratie van fabricagemateriaal (SF), werd de trekeigenschap van matrices verbeterd . Het kan te wijten zijn aan de vorming van intervezelbindingen tijdens verknoping. SF-vezels met een lage concentratie vertoonden dus geen betere mechanische sterkte in vergelijking met hogere.

Stress-rek-relatie van elektrospun nanovezels. De spanning-rekrelatie werd vergeleken tussen (a) SF, (b) SF+rhBMP2 en (c) 4SF+rhBMP2 steiger

Zwellingonderzoek

Zwellingsverhoudingen als functie van de tijd voor de steigers werden weergegeven in Fig. 3. De steigers zwollen aanvankelijk gelijkmatig met de tijd en bereikten een evenwicht in ongeveer 380 minuten. rhBMP2-gekoppelde vezels absorbeerden meer water in vergelijking met scaffolds met alleen SF, wat wijst op de toename van hydrofiele pockets als gevolg van BMP2-associatie. SF-vezels kwamen in evenwicht met ∼ 70%, terwijl BMP2-bevattende vezels werden geëquilibreerd met ∼ 81% water.

Zwelling eigenschap van gefabriceerde steiger. Veranderingen in de zwellingseigenschap van SF-steiger werden waargenomen na de modificatie met SF+rhBMP2 en 4SF+rhBMP2

Celadhesietest

Hechting van cellen aan de steiger is vereist voor de groei van cellen en inductie voor differentiatie. In deze studie hebben we waargenomen dat hMSC's goed hechtten aan de steigers, en de hechting van hMSC aan de 4SF-BMP2, SF-BMP2 en SF-steiger werd weergegeven in Fig. 4.

Histogram dat het percentage hechting tegen de tijd weergeeft voor drie tijdstippen. Veranderingen in het adhesieniveau in (a) SF, (b) SF+rhBMP2 en (c) 4SF+rhBMP2 steiger

Er was bezorgdheid over verlies van de hechting in de gemengde steiger, wat werd uitgesloten met de waargenomen resultaten. De vermenging met BMP2 vermindert de hechtingscapaciteit van scaffold niet. Zoals blijkt uit Fig. 3, was het goed begrepen dat met een toename van de poriegrootte (afname van de concentratie van SF), de hechting van de cel aan de steiger toeneemt. ANOVA tussen de drie formuleringen onderscheidt significant variaties in het 3e en 6e uur. Er werd echter geen significant verschil waargenomen in het eerste uur.

Cytotoxiciteitstest en celproliferatietest

De levensvatbaarheid van de cellen was significant verhoogd in de rhBMP2-geconjugeerde scaffolds, en de geconstrueerde scaffolds creëren geen cytotoxische effecten op de betreffende gastcellen (Fig. 4), en de cel prolifereerde goed in alle scaffolds in vergelijking met Fig. 5. Er was een toenemende trend in levensvatbaarheid met het aantal dagen, en SF + BMP2-steiger vertoonde op elk tijdstip de minste toxiciteit. ANOVA onthulde een significant verschil tussen de waarden van cellevensvatbaarheid van drie betrokken formuleringen.

Cellevensvatbaarheidstest weergegeven als histogram voor vier tijdstippen. De cellevensvatbaarheidstest werd uitgevoerd door MTT-assay en de resultaten worden weergegeven als percentage ten opzichte van de controle

Uit Fig. 6 kan celproliferatie worden onderzocht. Cel prolifereerde goed in alle drie de steigerpreparaten met het beste in SF + BMP2 op elk tijdstip. Grotere poriën in SF + BMP2-steiger boden maximale ruimte voor groei van cellen. Het belang van verschillen tussen de groep werd goed vastgesteld door ANOVA.

Weergave van celproliferatie als percentage alamarblauwe kleurstofreductie op vier tijdstippen voor SF, SF+BMP2 en 4SF+BMP2

ALP-assay

ALP-activiteit is een standaardmarker van osteo-inductieve eigenschappen van de omgeving rond de cel [13]. In ons experiment hebben we een hogere ALP-activiteit waargenomen in de SF + BMP2-constructen in vergelijking met alleen SF-constructen (Fig. 7). SF nanogestructureerde steigers waren ook in staat om alleen osteo-inductie te vertonen, maar zoals blijkt uit Fig. 7 en ANOVA, bleek SF + BMP2-steiger de beste te zijn van de steigers in kwestie. De ALP-concentratie werd in de loop van de tijd van het experiment verhoogd en de constructen met een hogere SF-concentratie vertoonden echter een lagere ALP-activiteit in vergelijking met constructen met een lagere SF-concentratie.

Vertegenwoordiging van ALP-activiteit tussen drie verschillende steigerfabricagestrategieën op verschillende tijdstippen. (a) SF (b) SF+rhBMP2 (c) 4SF+rhBMP2 steiger

In vivo ALP-activiteit

Fig. 8 toont ALP-activiteit van explantaten voor (a) SF, (b) SF+rhBMP2 en (c) 4SF+rhBMP2. Zoals verwacht induceerden explantaten van een behandeling die rhBMP2 bevatte een hogere ALP-activiteit, terwijl met rhBMP2-vrije scaffold behandelde muizen een lagere ALP-activiteit produceerden.

In vivo ALP-activiteit van de explantaten verkregen na behandeling. Naakt muismodel werd gebruikt om het osteo-inductieve potentieel van de scaffold in vivo aan te tonen

Discussies

Op scaffold gebaseerde weefselmanipulatie heeft zijn potentieel bewezen in de regeneratieve geneeskunde en is getuige geweest van indrukwekkende vooruitgang als hulpmiddel voor AHO. Eerdere studies hebben de cruciale rol vastgesteld van microarchitectuur en fysieke eigenschappen van structuren bij het vertalen van in vitro gemanipuleerde celsteigerconstructies in botweefsel [14,15,16].

Optimale mechanische eigenschappen (poriegrootte, treksterkte, enz.) en biocompatibiliteit van de constructies zijn mogelijke kenmerken waarmee rekening moet worden gehouden voor celkolonisatie en -organisatie [17]. Het gepresenteerde werk beschrijft de fabricage en karakterisering van scaffold voor botweefselengineering met behulp van een combinatie van gunstige eigenschappen van materialen die daarvoor worden voorgesteld. Terwijl SF een geschikt sterk en biocompatibel platform biedt, induceert ingebed rhBMP2 de vorming van nieuwe osteocyten. SF wordt uitgebreid bestudeerd door verschillende groepen in verschillende formuleringen voor osteoblastische celproliferatie [18] en weefselregeneratie, waaronder ligament, pees, kraakbeen, bot, lever, huid, luchtpijp, hoornvlies, zenuw, trommelvlies en blaas [19, 20].

We hebben voor onze studie waterige oplossingen van SF en SF+rBMP2 gebruikt, aangezien waterige oplossingen de voorkeur hebben boven organische oplosmiddelen voor de bereiding van SF-oplossingen, aangezien afbraak van SF ongunstig is in organische oplossingen [18]. Van Electrospun SF-vezels werd eerder gemeld dat ze een homogene structuur van vezels met uniforme diameter hebben, en het gaas is zeer poreus met onderling verbonden en kruisverbonden poriën, wat ook in nauwe overeenstemming is met onze studie [21, 22]. Er was geen waarneming van vorming van kraalachtige structuren in SF-vezels in onze steigers en de eerder gerapporteerde [21]. Eerder werd gemeld dat de diameter van de pure SF-vezel afnam met een toename van het mengsel [11, 21]; we hebben echter geen verlies in diameter waargenomen als gevolg van vermenging. Maar de uniformiteit van vezels was verstoord in gemengde vezels, mogelijk als gevolg van ongelijke associatie van rBMP2 op de SF-vezels.

Ruime mechanische sterkte is een eigenschap die essentieel is voor een weefselsteiger. Het mengen van pure SF verhoogde de flexibiliteit van nanovezel in ons experiment, en eerdere rapporten onthulden ook een vergelijkbare trend in verbetering van mechanische eigenschappen bij het mengen van SF met andere materialen om bruikbare gemengde biomaterialen op te leveren [21, 23]. Onze gefabriceerde steiger beschikt dus over de essentiële mechanische sterkte en flexibiliteit die vereist is in toepassingen voor weefselengineering.

Steigers voor tissue engineering moeten cellen erover kunnen hechten, celproliferatie en osteo-inductie vergemakkelijken en moeten het minst cytotoxisch zijn voor een betere aanvaardbaarheid. Eerdere rapporten over SF-steigers hebben de niet-cytotoxische en celproliferatieve activiteiten ervan aangetoond [21, 24], en onze onderzoeken waren in hoge mate in overeenstemming met de eerder gerapporteerde resultaten.

Vanwege zijn osteo-inductieve eigenschappen wordt rhBMP2 door verschillende groepen gebruikt bij botweefselmanipulatie [25,26,27]. Deze onderzoeken hebben aangetoond dat cellen die gekweekt zijn op BMP2-bevattende steigers een hogere ALP-activiteit bezaten, een biomarker voor osteo-inductie. Het effect van BMP2-associatie was beter gecontrasteerd naarmate de incubatietijd vorderde. Kim et al. gebruikten BMP2-geassocieerde poreuze microsferen en zagen een vergelijkbare verbetering in osteo-inductie [25].

Conclusies

We hebben met succes op SF gebaseerde vezelige steigers gefabriceerd die rhBMP2 bevatten. Deze steigers waren homogeen en bleken voldoende mechanische eigenschappen en biocompatibiliteit te hebben. Verdere rhBMP2-associatie toegeschreven aan het osteo-inductieve potentieel van de gefabriceerde steigers. De scaffolds werden verder geëvalueerd voor in vivo toepassingen en werden geschikt bevonden voor toepassingen waarbij botweefselengineering betrokken was.

Afkortingen

ALP:

Alkalische fosfatase

AHO:

Botweefseltechniek

hMSC's:

Menselijke mesenchymale stamcellen

rhBMP2:

Recombinant humaan bot morfogeen eiwit-2

SF:

Zijde fibroïne