Verbetering van de amperometrische transducerselectiviteit met behulp van fenyleendiaminefilms van nanoformaat

Resultaten en discussie

Om de redenen van afzetting van extra membraan op amperometrische transducer te bevestigen voor verbetering van de selectiviteit voor waterstofperoxide, was het noodzakelijk om de gevoeligheid en selectiviteit van deze transducer met betrekking tot mogelijke interferenties te verifiëren.

Biosensoren kunnen worden ingezet voor metingen in zowel onverdunde als verdunde monsters. De optie van verdunning hangt af van de concentratie van de te analyseren stof en de gevoeligheid van de biosensor:als de biosensor de doelstof kan identificeren in concentraties die tientallen keren lager zijn dan die in de monsters, moet deze laatste worden verdund om de gehalte aan interferenten en zo de nauwkeurigheid van de array te verbeteren. Bovendien kan het substraatvolume dat nodig is voor metingen tientallen keren worden verminderd.

Soms is de concentratie van de geanalyseerde stof te laag of is verdunning om technische redenen ongewenst. Voor een beter begrip van de functie van de amperometrische transducer werden elektroactieve materialen met drie concentraties gebruikt:(1) relevant voor bloedserum, (2) 20-voudig lager dan (1), dwz 20-voudige verdunning, en (3) 100- vouw verdunning. De biosensorreacties op elektroactieve stoffen van drie concentraties werden ontvangen met behulp van de blote transducer vóór de PPD-filmafzetting en de transducergevoeligheid werd berekend (tabel 2). Zoals te zien was, was de gevoeligheid voor dopamine en ascorbinezuur het hoogst, voor cysteïne het laagst. Ascorbinezuur en urinezuur kunnen echter als de belangrijkste interfererende stoffen worden beschouwd vanwege hun aanzienlijk hogere concentraties in biologische monsters. De respons van de transducer op deze stoffen is een orde van grootte groter dan de respons op de doelstof, waterstofperoxide. Daarom is de kale transducer ongeschikt voor metingen in biologische monsters vanwege de uitgesproken impact van interferenties. Aan de andere kant, na 100-voudige verdunning, werden de reacties op cysteïne en dopamine verwaarloosbaar, en de reactie op alle interfererende stoffen in totaal was slechts ongeveer 20% van de reactie op waterstofperoxide, wat betekent dat in sommige gevallen de sensor kan worden zelfs zonder aanvullende aanpassingen gebruikt.

Momenteel is er slechts gefragmenteerde informatie over de methoden van PPD-membraanafzetting op transducers. Daarom werd in de volgende fase van het werk geëvalueerd welke methode van de twee meest voorkomende en veelbelovende meer haalbaar is.

Bij de eerste methode werden PPD-membranen afgezet op het oppervlak van de platinaschijfelektrode via elektropolymerisatie van moleculen van monomeer fenyleendiamine met behulp van variërende potentiaal (cyclische voltammetrie). De transducers met referentie- en hulpelektroden werden in een werkcel met fenyleendiamine-oplossing geplaatst en er werden een aantal cyclische voltammogrammen verkregen [7]. Een voorbeeld van het experiment wordt getoond in Fig. 1. Tijdens het eerste cyclische voltammogram (CVA) werd een significante toename van de stroom waargenomen bij de potentiaal variërend van 0,5 tot 0,9 V vanwege de oxidatie van fenyleendiamine. Tijdens de tweede en volgende CVA's nam de stroom aanzienlijk af, wat wijst op een lagere snelheid van elektropolymerisatie. Zoals de volgende experimenten lieten zien, duurde de vorming van PPD-membraan echter gedurende alle CV's.

Cyclische voltammogrammen verkregen bij elektropolymerisatie van fenyleendiamine op het oppervlak van de transducer

De tweede methode van PPD-membraanafzetting bestaat uit fenyleendiamine-oxidatie bij een constante potentiaal van +-0,7 V gedurende een vaste tijd (40 min) [11]. Vergelijking van transducerreacties bij gebruik van beide depositiemethoden wordt weergegeven in Tabel 3. Hierna werden de reacties op de elektroactieve stoffen zonder het PPD-membraan als 100% genomen. De membranen, afgezet met beide methoden, belemmerden de interferentie vrij effectief - er werd alleen een zwakke gevoeligheid voor cysteïne waargenomen. Aan de andere kant nam de gevoeligheid van de transducer voor waterstofperoxide na voltammetrie met 2,6 keer toe. Dit kan worden verklaard door de elektro-activering van platina tijdens voltammetrie, maar niet door het effect van PPD-membraan. Een dergelijke toename in gevoeligheid voor waterstofperoxide werd ook waargenomen na het verkrijgen van cyclische voltammogrammen in fosfaatbuffer zonder fenyleendiamine. Na de afzetting op het membraan bij een constante potentiaal, werd geen elektro-activering onthuld en de reacties op waterstofperoxide veranderden niet. Zo bleek het gebruik van cyclische voltammetrie om drie redenen de voorkeur te hebben:minder tijd voor één depositie (20 versus 40 min), efficiëntere remming van cysteïne en toenemende reacties op waterstofperoxide.

Cyclische voltammetrie heeft echter één nadeel:voltammogrammen kunnen tegelijkertijd op slechts één elektrode worden verkregen (zelfs met multiplexer), terwijl membraanafzetting bij een constant potentiaal gelijktijdige aansluiting van 8-16 werkende elektroden mogelijk maakt (afhankelijk van het type multiplexer). Daarom moet verder werk worden gericht op optimalisatie van de condities van cyclische voltammogrammen om de voorbehandeling van de transducer te verkorten.

PD elektropolymerisatie door CV en constante potentiaal amperometrie wordt verondersteld plaats te vinden via verschillende wegen via een vrij gecompliceerd mechanisme [12]. CV omvat dus een hoog toegepast potentieel, wat leidt tot het genereren van minder geconjugeerde oligomeren van PD. Om deze reden wordt aangenomen dat bij PD-polymerisatie door CV de poriën groter zijn en dat de permeabiliteit van de PPD-laag hoger is in vergelijking met de polymerisatie bij een constante potentiaal [8, 13]. Zoals opgemerkt in de sectie "Achtergrond", kwamen verschillende auteurs echter tot tegenstrijdige conclusies over de voorkeursmethode voor PD-afzetting, en in veel gevallen gaf CV goede resultaten. Naar onze mening kunnen zowel CV- als constante-potentiaalamperometrie de generatie van PPD-membranen met goede permselectieve eigenschappen opleveren, en optimalisatie is noodzakelijk voor elk specifiek geval.

Het PPD-membraan was duidelijk zichtbaar op het elektrodeoppervlak als een uniforme transparante goudbruine film. Om te bevestigen dat het inderdaad PPD is, werd de PD-polymerisatie bovendien bevestigd door spectroscopie. Het UV-vis diffuse reflectiespectrum van de film (Fig. 2) vertoont intense absorptiebanden bij 222 en 315 nm, vergelijkbaar met de banden van het monomeer en gerelateerd aan de elektronenovergangen in de aromatische ringen [14], terwijl de karakterloze absorptie bij 400-800 nm, constant afnemend met de golflengte heeft betrekking op π − π * elektronenovergangen in sterk geconjugeerd aromatisch systeem van geleidend PPD-polymeer.

UV-vis diffuse reflectiespectra van m -fenyleendiamine en PPD-membraan, gevormd op de Pt-elektrode

Voor een betere interpretatie van de verkregen resultaten zou het nuttig zijn om de grootte van de poriën in de PPD-membranen die met verschillende methoden zijn geproduceerd, te schatten. Directe bepaling van de poriegrootte in PPD-membraan is echter bijna onmogelijk, omdat het membraan uit meerdere lagen PD bestaat en poriën in onderste lagen verschillende groottes kunnen hebben. Killoran en O'Neill hebben vastgesteld dat de dikte van het effectieve membraan van m -PD was 15 nm, en het dwarsdoorsnede-oppervlak van één oligomere polymeerstreng geschat door del Valle et al. was 1 nm [7, 15]. Het PPD-membraan bevat dus ongeveer 15 lagen polymeer. Aangezien het PPD-membraan hydrofobe en isolerende eigenschappen heeft, moet het membraan perforerende nanoporiën hebben die zich uitstrekken tot aan het elektrodeoppervlak en omleiding van waterstofperoxidemoleculen mogelijk maken, anders H₂ O₂ kunnen niet worden geoxideerd en een amperometrisch signaal genereren. De poriën zijn beslist niet uniform en de minimale diameter van de poriën moet kleiner zijn dan 1 nm om elektroactieve moleculen af ​​te stoten, en daarom is het vrij moeilijk om de poriën te analyseren, zelfs met elektronen- of atoomkrachtmicroscopen. Om deze technische redenen is het veel gemakkelijker om de effectiviteit van het PPD-membraan te schatten door de membraanpermeabiliteit voor verschillende moleculen te evalueren. Een dergelijke indirecte benadering is wijdverbreid en maakt vergelijking van praktische kenmerken van verschillende membranen mogelijk.

De effectiviteit van PPD-membranen afgezet met behulp van verschillende aantallen cyclische voltammogrammen werd getest (Fig. 3).

Efficiëntie van PPD-membranen afgezet met verschillende aantallen CVA's

PPD-membraan afgezet door één CVA was duidelijk onvoldoende om de invloed van interfererende stoffen te elimineren. Hier was het effect van platina-elektroactivering echter het sterkst. Bij verdere toename van het aantal voltammogrammen namen de reacties op interferenties af, maar tegelijkertijd nam ook de gevoeligheid van de transducer voor waterstofperoxide af, waarschijnlijk vanwege een te dikke PPD-laag, die de stofdiffusie belemmert. Drie CVA's waren voldoende voor het volledig verdwijnen van de reacties op dopamine en urinezuur en een significante afname van de reacties op ascorbinezuur en cysteïne. Daarom werden drie CVA's genomen voor optimaal, en werd de fenyleendiamineconcentratie verhoogd tot volledige eliminatie van de interfererende impact (Fig. 4).

Efficiëntie van PPD-membranen afgezet bij verschillende fenyleendiamineconcentraties

Met name het gebruik van 5 mM fenyleendiamine was voldoende om de reacties op storende stoffen van kleine concentraties die achterblijven na monsterverdunning te elimineren, maar onvoldoende om met onverdunde monsters te werken. Een verhoging van de fenyleendiamineconcentratie tot 20 mM en drie CVA's bleken voldoende voor volledige eliminatie van de cysteïne-impact en een verlaging van de respons op ascorbinezuur tot het laagste niveau (0,1% van de respons op ascorbinezuur zonder PPD-membraan). Het gebruik van hogere (tot 100 mM) fenyleendiamineconcentratie resulteerde in een tweevoudige afname van de transducergevoeligheid voor waterstofperoxide, waarschijnlijk vanwege een te dikke PPD-laag. Dus de afzetting van PPD-membraan met behulp van drie CVA's in 30 mM fenyleendiamine is een optimale procedure. Aangezien één voltammogram ongeveer 2 min duurde, duurde de afzetting van het membraan op één sensor 6 min.

Vervolgens werd de stabiliteit van het PPD-membraan bestudeerd. Na afzetting van de PPD-membranen werden de sensoren gedurende 2 uur in de werkbuffer geplaatst en werden reacties op waterstofperoxide, ascorbinezuur en cysteïne gemeten om de veranderingen in membraanpermselectiviteit te evalueren (Fig. 5). Het bleek dat de reacties op waterstofperoxide tijdens het werk iets toenamen, terwijl kleine reacties op interfererende stoffen nog kleiner werden. Waarschijnlijk kwam het doordat ascorbinezuur en cysteïne geleidelijk enkele grote poriën in de PPD-laag verstopten. Dit experiment toonde aan dat het PPD-membraan kan worden gebruikt zonder significant verlies in selectiviteit voor waterstofperoxide gedurende ten minste 2 uur.

Stabiliteit van het PPD-membraan gedurende 2 uur. De reacties op drie stoffen werden genormaliseerd naar de aanvankelijke respons op de overeenkomstige stof na PPD-afzetting

De opslagstabiliteit van het PPD-membraan werd onderzocht. De sensoren met afgezette PPD-membranen werden 8 dagen droog bewaard bij -18 °C; periodiek werden de sensoren ontdooid en werden reacties op waterstofperoxide, ascorbinezuur en cysteïne gemeten (Fig. 6). In deze periode is de gevoeligheid van sensoren voor waterstofperoxide 2,5 keer zo groot geworden; de gevoeligheid voor ascorbinezuur en cysteïne veranderde niet. Dit effect kan worden verklaard door langzame zwelling van het PPD-membraan dat leidde tot een verbetering van de waterstofperoxidediffusie door de PPD-laag.

Opslagstabiliteit van het PPD-membraan. De reacties werden genormaliseerd naar reactie op H₂ O₂ op de eerste dag

Ten slotte werd de effectiviteit van het PPD-membraan gevalideerd bij analyse van echte biologische monsters. De transducers zonder membranen vertoonden zwakke signalen na toevoeging van bloedserum aan de werkcel vanwege de aanwezigheid van elektroactieve verbindingen. Na afzetting van het membraan werden echter geen reacties verkregen. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met het lysaat van neuronen. Deze experimenten tonen aan dat de ontwikkelde methode van PPD-afzetting op platinaschijfelektroden effectief is en dat de gemodificeerde transducers kunnen worden gebruikt voor het werken met complexe biologische monsters.

Het is nuttig om de in dit werk ontwikkelde methode voor PPD-depositie te vergelijken met de eerder gerapporteerde methoden (tabel 4).

Zoals te zien is, is de gepresenteerde methode de snelste en zijn de blokkerende eigenschappen van het verkregen membraan beter of in ieder geval niet slechter dan die van andere PPD-membranen.