Verbeterde stabiliteit van gouden magnetische nanodeeltjes met poly(4-styreensulfonzuur-co-maleïnezuur):op maat gemaakte optische eigenschappen voor eiwitdetectie

Resultaten en discussie

Schema 1 illustreert de procedures die zijn ontwikkeld voor de oppervlaktemodificatie en functionalisering van deeltjes voor colorimetrische detectie van eiwitten. Om de adsorptie en opname van PSS-MA op de PSS-MA-GoldMag-structuren te bestuderen, werden FTIR-spectroscopische analyses, SPR-spectroscopie en TGA uitgevoerd. Afbeelding 1a toont het FTIR-spectrum voor respectievelijk pure PSS-MA, PSS-MA-GoldMag en GoldMag. De brede en sterke band bij 3000-3700 cm ⁻¹ komt overeen met het uitrekken van de –CO–OH-groepen en de hydroxylgroepen van –SO₂ –OH in polymeerketens [18]. Symmetrische trillingen van sulfonaatgroepen:(SO₃ ⁻ ) waren op 1037 en 1126 cm ⁻¹ en rektrillingen van C = C van benzeen waren 1403 en 1637 cm ⁻¹ [19]. Deze karakteristieke absorptiebanden van PSS-MA werden waargenomen in PSS-MA-GoldMag, wat aantoont dat de onbewerkte deeltjes met succes werden gecoat met PSS-MA. De verandering van chemische oppervlaktegroepen van de GoldMag werd bevestigd door een duidelijke blauwverschuiving van 11 nm van 555 naar 544 nm in de SPR-band na modificatie (figuur 1b). De positie en breedte van de SPR-piek was gerelateerd aan het oppervlak, de omgeving en de dispersiteit van de nanodeeltjes [20,21,22,23]. TGA-analyse gaf aan dat de gewichtsverhouding van organisch materiaal tot GoldMag bijna 1:4 was (figuur 1c). Bij lage temperatuur kan gewichtsverlies worden toegeschreven aan uitdroging; wanneer de temperatuur stijgt, kan gewichtsverlies worden toegeschreven aan oxidatieve afbraak van de organische moleculen op het oppervlak van de gemodificeerde deeltjes [19, 24]. Tijdens de modificatie werden CTAB-GoldMag positief geladen (+-12.2 mV) en het deeltjesoppervlak werd negatief geladen (-24.5 mV) na de PSS-MA-coating op het deeltjesoppervlak (Fig. 1d). Alle bovenstaande resultaten laten zien dat PSS-MA met succes aan het oppervlak van nanodeeltjes wordt gehecht.

een De schematische illustratie van het "algehele" proces van oppervlaktemodificatie van magnetische gouddeeltjes (GoldMag) en de moleculaire structuur van poly(4-styreensulfonzuur-co-maleïnezuur) (PSS-MA). b Schematische weergave van de interactie van D-dimeer met antilichaam 1 en 2-PSS-MA-GoldMag, evenals de interactie tussen D-dimeer en antilichaam 1-PSS-MA-GoldMag

een FTIR-spectroscopie van PSS-MA, PSS-MA-GoldMag en GoldMag. b SPR-spectroscopie van GoldMag en PSS-MA-GoldMag gesuspendeerd in water. c TGA-analyse van GoldMag en PSS-MA-GoldMag. d De verandering van zeta-potentiaal als gevolg van de wijziging

De microfoto's (Fig. 2a, b) van de GoldMag en PSS-MA-GoldMag verkregen met TEM laten zien dat deze deeltjes na modificatie mono-dispers waren. De laag polymeer op het oppervlak van de deeltjes is duidelijk zichtbaar onder het elektronenmicroscopische beeld met hoge resolutie, wat verder aangeeft dat de coating van polymeer op GoldMag succesvol was (figuur 2b). Figuur 2c laat zien dat de gemiddelde diameter van PSS-MA-GoldMag 116 nm is. De PSS-MA-GoldMag suspensie heeft een wijnrode kleur wat wijst op een goede stabiliteit van de nanodeeltjes (1 jaar in water).

een TEM-afbeeldingen van GoldMag. b TEM-afbeeldingen van PSS-MA-GoldMag. De inzet toont deeltjes per polymeerpakket. c Grootteverdeling van GoldMag en PSS-MA-GoldMag. De inzet toont de foto van de PSS-MA-GoldMag-oplossing, die een rode kleur vertoont

De stabiliteit van de optische kenmerken van GoldMag en PSS-MA-GoldMag in bufferoplossingen met verschillende pH-waarden werd geanalyseerd met SPR-spectroscopie [7]. Zoals weergegeven in figuur 3a, werd de SPR-karakteristieke piek verschoven naar de langere golflengte van 555 nm toen GoldMag werd gesuspendeerd in borax/boraatbuffer met een pH van 6,0 tot 9,0. De samenstelling van de bufferoplossing heeft ook invloed op de stabiliteit van de GoldMag-suspensie. De positie van de SPR-karakteristieke piek werd verplaatst naar hogere golflengten (558 nm) wanneer GoldMag werd gesuspendeerd in PB-buffer (pH 7,4), borax/boraatbuffer (pH 7,4) en NaCl-oplossing (10 mM) vergeleken met die in gedeïoniseerd water (550 nm) (Fig. 3c). De karakteristieke SPR-piek (545 ± 2 nm) veranderde echter niet significant wanneer PSS-MA-GoldMag werd gedispergeerd in een elektrolytoplossing of in een bufferoplossing met verschillende pH-waarden (Fig. 3b, d). Xia et al. en Storhoff et al. hebben ook gemeld dat aggregatie van nanodeeltjes het SPR-spectrum kan doen verschuiven naar langere golflengten [25, 26]. Het zeta-potentieel van GoldMag en PSS-MA-GoldMag werd ook gemeten (Fig. 3e, f). Er is gemeld dat een lage zeta-potentiaal (minder dan ± 30 mV) zal leiden tot deeltjesagglomeratie [27, 28]. Wanneer GoldMag werd gesuspendeerd in PB-buffer (pH 7,4), borax/boraatbuffer (pH 7,4) en NaCl-oplossing (10 mM), was de zeta-potentiaal van GoldMag -16,7 ± 1,1 mV, -14,3 ± 2,1 mV en -8,9 ± respectievelijk 1,5 mV. De zeta-potentiaal van GoldMag was -14,2 ± 1,7 mV, -17 ± 1,1 mV, 13,9 ± 1,7 mV en -18,1 ± 1,6 mV wanneer deeltjes werden gesuspendeerd in borax/boraatbuffer met een pH van 6,0 tot 9,0. De hechting van PSS-MA aan GoldMag vermindert echter dramatisch het zeta-potentieel in verschillende elektrolytoplossingen, evenals bij verschillende pH-waarden. In alle gevallen was de zeta-potentiaal lager dan -30 mV. Deze resultaten geven aan dat oppervlaktemodificatie van GoldMag met PSS-MA de weerstand tegen veranderingen van samenstelling en pH-waarden van bufferoplossingen aanzienlijk verbetert en zorgt voor een hoge mate van dispersiteit [29].

een De SPR-spectra van GoldMag in borax/boraatbuffer (0,02 mol/L) met verschillende pH-waarden variërend van 6,0 tot 9,0. b De SPR-spectra van PSS-MA-GoldMag in borax/boraatbuffer (0,02 mol/L) met verschillende pH-waarden variërend van 6,0 tot 9,0. c De SPR-spectra van GoldMag gesuspendeerd in borax/boraatbuffer (0,02 mol/L, pH 7,4), PB-buffer (0,2 mol/L, pH 7,4) en in een elektrolytoplossing. d De SPR-spectra van PSS-MA-GoldMag gesuspendeerd in borax/boraatbuffer (0,02 mol/L, pH 7,4), PB-buffer (0,2 mol/L, pH 7,4) en in elektrolytoplossing. e De verandering van zeta-potentiaal van GoldMag gesuspendeerd in borax/boraatbuffer (0,02 mol/L) met verschillende pH-waarden variërend van 6,0 tot 9,0. v De verandering van zeta-potentiaal van GoldMag gesuspendeerd in borax/boraatbuffer (0,02 mol/L, pH 7,4), PB-buffer (0,2 mol/L, pH 7,4) en in elektrolytoplossing

Om de interactie tussen eiwit en PSS-MA-GoldMag te onderzoeken, werden anti-D-dimeer-antilichamen geconjugeerd met PSS-MA-GoldMag door de reactie tussen eiwitaminogroepen en de carboxylgroepen van het polymeer gemedieerd door EDC. Zoals getoond in Fig. 4a, werd roodverschuiving van de SPR-piek waargenomen na de reactie van PSS-MA-GoldMag met anti-D-dimeer-antilichamen, wat wijst op de conjugatie van antilichamen op nanodeeltjes [30, 31]. De toename van de gemiddelde diameter van deeltjes van 116 naar 130 nm bevestigt de introductie van het anti-D-dimeer antilichaam in de PSS-MA-GoldMag (Fig. 4b) [24]. De invloed van antilichaammassa op de optische eigenschap van PSS-MA-GoldMag werd geëvalueerd door middel van SPR-spectroscopie na toevoeging van verschillende hoeveelheden anti-D-dimeer antilichaam (van 20 tot 200 μg) aan de PSS-MA-GoldMag-suspensie. Zoals weergegeven in figuur 4c, was de SPR-piek niet veranderd en werd deze op 548 ± 3,0 nm gehouden, onafhankelijk van de hoeveelheid toegevoegd antilichaam.

een De SPR-spectra van PSS-MA-GoldMag en anti-D-dimeer antilichaam-PSS-MA-GoldMag. b De grootteverdeling van antilichaam-PSS-MA-GoldMag en PSS-MA-GoldMag. c De SPR-piek van deeltjes veranderde niet met toenemende antilichaamconcentraties

Om de activiteit van de antilichamen na conjugatie op de PSS-MA-GoldMag te evalueren, werden probe A en probe B bereid door een paar antilichamen (antilichaam 1 en antilichaam 2) en antilichaam 1 op PSS-MA-GoldMag te immobiliseren, respectievelijk. De interactie tussen de twee typen probe en D-dimeer werd geanalyseerd met SPR-spectroscopie. De beste reactietijd werd verkregen door de verandering van het maximum van de SPR-piek gedurende 40 minuten te observeren na toevoeging van drie concentraties D-dimeer (0,6, 2 en 6 μg/ml) aan sonde A. Zoals getoond in Fig. 5a, een significante verschuiving in de oppervlakteplasmonband werd waargenomen als gevolg van de aggregatie van PSS-MA-GoldMag door middel van crosslinks tussen antigeen-antilichaam-sandwichbrug in de loop van de tijd. Bij een lage concentratie (0,6 g/ml) was er geen significante verandering in het SPR-spectrum van 20 tot 40 min, wat aangeeft dat 20 min voldoende is voor de reactie van 0,6 μg/ml of lagere concentraties D-dimeer. Bij gebruik van gemiddelde en hoge concentraties D-dimeer (2 en 6 g/ml) bleef de golflengte echter 30 minuten toenemen. Dit geeft aan dat de beste reactietijd 30 min is. Zoals getoond in Fig. 5b, onthulde het SPR-spectrum van de composietdeeltjes een duidelijke rode verschuiving in oppervlakteplasmonresonantie van λ_max =550 tot 570 nm en intensiteitsafname van karakteristieke piek naarmate de concentratie van D-dimeer toenam van 0,3 tot 6 μg/ml. Dit wordt veroorzaakt door de aggregatie van PSS-MA-GoldMag veroorzaakt door de kruisverbinding van D-dimeer met antilichaam 1 en antilichaam 2 op sonde A. De aggregatie van PSS-MA-GoldMag resulteerde in de verandering van de optische eigenschappen van het goud onderdeel van PSS-MA-GoldMag. Jiang et al. en Li et al. hebben ook gemeld dat aggregatie van nanogold het SPR-spectrum van nanodeeltjes rood kan laten verschuiven en grens [32, 33]. Er werd echter geen roodverschuiving waargenomen in figuur 5d omdat de interactie tussen D-dimeer en antilichaam 1 niet kon leiden tot de assemblage van nanodeeltjes. Bovendien werd een duidelijke roodverschuiving (5 nm) waargenomen, zelfs de hoeveelheid D-dimeer die aan probe A werd toegevoegd was slechts 0,3 μg/ml, wat aangeeft dat de detectielimiet onder de diagnostische grenswaarden ligt (0,5 μg/mL) voor deze biomarker. Een lineair verband tussen de spectrale SPR-piekpositie en de D-dimeerconcentratie werd gevonden in het bereik van 0,3–6 μg/ml (r ² = 0.9944) (Fig. 5c).

een De relatie tussen de reactietijd en het SPR-spectrum. b De roodverschuiving van SPR-spectra als gevolg van aggregatie van GoldMag-deeltjes veroorzaakt door kruisverbinding van D-dimeer met sonde A. c De curve uitgezet van de SPR-piek van composieten als functie van de D-dimeerconcentratie. d De SPR-spectroscopie van composieten na toevoeging van D-dimeer aan probe B

Zoals getoond in Fig. 6, werd er geen significante verschuiving gevonden van de SPR-karakteristieke piek van PSS-MA-GoldMag in aanwezigheid van respectievelijk triglyceriden, bilirubine en hemoglobine. Dit resultaat geeft aan dat ons eiwitdetectiesysteem geen storende reacties heeft met triglyceriden, bilirubine en hemoglobine.

De SPR-spectra van anti-D-dimeer antilichaam-PSS-MA-GoldMag na reactie met D-dimeermonsters in aanwezigheid en afwezigheid van triglyceriden, bilirubine en hemoglobine

Deze resultaten laten zien dat PSS-MA-GoldMag een veelbelovend magnetisch nanodeeltje is voor eiwitimmobilisatie en een sandwichbrug op het deeltjesoppervlak kan vormen via antilichaam 1-doelwit eiwit-antilichaam 2. Dit maakt PSS-MA-GoldMag waardevol als materiaal voor gebruik in point-of-care optische detectie van biomarkers.

In deze studie werd PSS-MA eerst gebruikt voor modificatie van GoldMag (Schema 1). De introductie van PSS-MA op het oppervlak van GoldMag verbeterde de stabiliteit in bufferoplossing aanzienlijk. Naast de sterische hinder die wordt veroorzaakt door de lange polymeerketen van PSS-MA, veroorzaken de carboxylgroepen en de sulfogroep in PSS-MA elektrostatische afstoting tussen de nanodeeltjes [29]. Dit verbetert de stabiliteit van PSS-MA-GoldMag aanzienlijk. Het hoge aantal carboxylgroepen op het deeltjesoppervlak voldoet aan de eis voor conjugatie met biomolecuul.