De potentiële lever-, hersen- en embryotoxiciteit van titaniumdioxide-nanodeeltjes op muizen

Abstract

Titaniumdioxide op nanoschaal (nano-TiO₂ ) is op grote schaal gebruikt in de industrie en de geneeskunde. De veiligheid van nano-TiO₂ blootstelling blijft onduidelijk. In deze studie evalueerden we de lever-, hersen- en embryotoxiciteit en het onderliggende mechanisme van nano-TiO₂ muismodellen gebruiken. De resultaten toonden aan dat titanium werd gedistribueerd naar en opgehoopt in het hart, de hersenen, de milt, de longen en de nieren van muizen na intraperitoneale (i.p.) nano-TiO₂ blootstelling, op een dosisafhankelijke manier. De verhoudingen van het orgaan/lichaamsgewicht van het hart, de milt en de nier waren significant verhoogd, en die van de hersenen en de longen waren verlaagd. Hoge doses nano-TiO₂ de functies van lever en nieren en het glucose- en lipidenmetabolisme aanzienlijk beschadigd, zoals bleek uit de bloedbiochemische tests. Nano-TiO₂ veroorzaakte schade in mitochondriën en apoptose van hepatocyten, vorming van reactieve zuurstofsoorten en expressiestoornissen van beschermende genen in de lever van muizen. We vonden gescheurde en gebarsten zenuwcellen en infiltratie van ontstekingscellen in de hersenen. We ontdekten ook dat de activiteiten van constitutieve stikstofoxidesynthasen (cNOS), induceerbare NOS (iNOS) en acetylcholinesterase, en de niveaus van lachgas en glutaminezuur in de hersenen waren veranderd na nano-TiO₂ blootstelling. Ex vivo muisembryomodellen vertoonden ontwikkelings- en genetische toxiciteit na hoge doses nano-TiO₂ . De grootte van nano-TiO₂ deeltjes kunnen de toxiciteit beïnvloeden, grotere deeltjes produceren een hogere toxiciteit. Samengevat, nano-TiO₂ vertoonde toxiciteit in meerdere organen bij muizen na blootstelling via i.p. injectie en sondevoeding. Onze studie kan gegevens opleveren voor de beoordeling van het risico van nano-TiO₂ blootstelling aan de menselijke gezondheid.

Achtergrond

Titaniumdioxide op nanoschaal (nano-TiO₂ ) wordt veel gebruikt in de voedingsindustrie. Het is gebruikt voor de productie van gecoat snoep, geconserveerd fruit, kauwgom, koolzuurhoudende dranken, poederdranken (in ongezoete doseringsvorm of geconcentreerd), melk en zuivelproducten en andere voedselcategorieën [1, 2]. De concentratie van nano-TiO₂ in voedsel kan oplopen tot 0,5–9 g/kg [1, 3], en veel voedingsmiddelen waarvan beweerd wordt dat ze nano-TiO2-vrij zijn, bevatten nano-TiO2 [2]. Nano-TiO₂ is ook veel gebruikt in de biogeneeskunde, de behandeling van organische verontreinigende stoffen, materiaaltechnologie en cosmetica [4,5,6]. De veiligheid van nano-TiO₂ blootstelling blijft onduidelijk.

Studies hebben aangetoond dat nano-TiO₂ kan verrijkt en toxisch worden in meerdere organen na binnenkomst in het lichaam via verschillende methoden, zoals toediening via de buikholte of inademing [7, 8]. Nano-TiO₂ kan toxisch zijn voor verschillende soorten cellen, zoals menselijke lymfoblastoïde cellen en hepatoomcellen [9, 10]. Het kan een acute stressreactie induceren in gliacellen van muizenhersenen, wat leidt tot neuronbeschadiging en disfunctie [11]. Het overlevingspercentage van neuroncellijnen die zijn blootgesteld aan nano-TiO₂ deeltjes aanzienlijk verminderd op een typische tijd- en dosisafhankelijke manier [12].

Studies hebben verschillende mechanismen onthuld waarmee deze nanodeeltjes toxiciteit veroorzaken. Nano-TiO₂ deeltjes kunnen genetische toxiciteit veroorzaken door de structuur van het moleculaire complex en de permeabiliteit van het celmembraan te veranderen [13,14,15]. Nano-TiO₂ kan oxidatieve stress veroorzaken. Tijdens oxidatieve stress worden reactieve zuurstofsoorten (ROS), zoals hydroxylradicalen, gegenereerd en veroorzaken ze DNA-oxidatie, waarbij 8-OHG wordt gegenereerd, wat leidt tot fouten en mutaties in DNA-replicatie [16, 17]. Bovendien kan ROS ontstekingen en wederzijdse feed-forward interactie tussen oxidatieve stress en ontsteking induceren, wat resulteert in DNA-schade en celapoptose [18, 19]. De uitgebreide systematische gegevens over de toxiciteit van nano-TiO₂ blijft beperkt. Ons doel was om het effect en het onderliggende mechanisme van nano-TiO₂ . te onthullen blootstelling aan de menselijke gezondheid.

In deze studie hebben we het effect en het onderliggende mechanisme van nano-TiO₂ . geëvalueerd blootstelling met behulp van muizenmodellen. Onze bevindingen toonden aan dat nano-TiO₂ kan worden verrijkt en toxiciteit veroorzaken in verschillende organen zoals de lever, nier, milt, hart, long en hersenen door het genereren van een oxidatie-reductie onbalans en stoornissen van genexpressie. Dit kan ook schade aan de embryonale ontwikkeling veroorzaken. Onze studie kan gegevens opleveren om het potentiële risico voor de menselijke gezondheid van nano-TiO₂ . te beoordelen blootstelling.

Methoden

Chemische stoffen en reagentia

Microschaal TiO₂ (micro-TiO₂ ) en 5 nm van TiO₂ in de vorm van anatase werden gekocht bij Sigma-Aldrich (Shanghai, China) en 10, 60 en 90 nm TiO₂ (anatase) werden gekocht van Run He Ltd. (Shanghai, China). Het formaldehyde, salpeterzuur, waterstofperoxide en heparine-natrium waren van reagenskwaliteit en werden gekocht bij Sigma-Aldrich (Shanghai, China). Fosfaatbuffer (PBS), penicilline en streptomycine werden gekocht bij Gibco (San Diego, VS). Totale RNA-extractiekits werden gekocht bij Takara (Dalian, China). Testkits voor reactieve zuurstofspecies werden gekocht bij Jianchen Ltd. (Nanjing, China). Voorraad TiO₂ suspensie (1%) in Hank's oplossing werd gedurende 30 minuten bij 121 ° C gesteriliseerd. De suspensie werd vlak voor gebruik gesoniceerd en verdund tot de gewenste concentratie.

Dieren en modellen

Voor de studie van lever- en hersentoxiciteit werden ICR-muizen (imprinting control region) (22 ± 3 g, half mannelijk en half vrouwelijk) gekocht bij het dierencentrum van China Medical University. Alle experimentele procedures waarbij dieren betrokken waren, waren vooraf goedgekeurd door de Institutional Ethics Committee Tianjin University of Science and Technology en werden uitgevoerd in overeenstemming met de internationale richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Voor de studie van de toxiciteit van muizenembryo's werden ICR-muizen (45 vrouwtjes, 20-35 g; 15 mannetjes, 35-40 g) gekocht bij Beijing Weitong Lihua Ltd. (Beijing, China). Alle muizen waren gezond en geslachtsrijp. Vijf dagen voor de behandeling werden de muizen in aparte kooien gefokt in een huis met goede ventilatie, een licht/donkercyclus van 12 uur, 20 ± 2 °C, 60 ± 10% relatieve vochtigheid en ad libitum toegang tot voedsel en water.

Doseringsschema 1 was bedoeld voor een algemene toxiciteits- en hersentoxiciteitstest. De muizen werden willekeurig verdeeld in zes groepen en een extra controlegroep, met 10 muizen/groep. Een nanoschaal TiO₂ (nano-TiO₂ ) suspensie werd eenmaal daags gedurende 14 dagen geïnjecteerd (intraperitoneaal (i.p.), 5, 10, 50, 100, 150 en 200 mg/kg). Zoutoplossing werd geïnjecteerd in muizen van de controlegroep. De muizen werden elke dag geobserveerd en geen enkel dier stierf tijdens het onderzoek. Op de 15e dag werden bloedmonsters verzameld uit de orbitale sinus. Alle muizen werden afzonderlijk gewogen, werden verdoofd met 2% fenobarbital (60 ml/kg, i.p.) en werden vervolgens opgeofferd door cervicale dislocatie. Alle weefselmonsters werden verzameld (hersenweefsel geïsoleerd uit cortex en hippocampus) en bewaard bij -80 ° C. Elk hart, lever, milt, long en nier werd in twee porties gesneden. Een portie werd gedrenkt in formaline (10%) oplossing bij 4 °C voor pathologisch onderzoek. Het andere deel werd bewaard bij -20 °C voor de bepaling van het titaniumgehalte.

Doseringsschema 2 is ontworpen voor de levertoxiciteitstest. Muizen werden verdeeld in drie experimentele groepen en één controlegroep. Nano-TiO₂ (5, 10, 50 mg/kg) werd gedurende 60 dagen eenmaal per dag via een sonde toegediend. De muizen in de controlegroep kregen 0,5% CMC (carboxymethylcellulose). De muizen werden elke dag geobserveerd en geen enkel dier stierf tijdens het onderzoek. Op de 60e dag werden de muizen verdoofd met 2% fenobarbital (60 ml/kg, ip) en vervolgens opgeofferd door cervicale dislocatie, de levers werden onmiddellijk verzameld en verwerkt voor onderzoek met behulp van elektronenmicroscopie, bepaling van ROS en lipide-oxidatie en analyse van genexpressie.

Bepaling van het titaniumgehalte in doelweefsels

Een stuk ingevroren weefselmonster van 0,1-0,5 g werd gesneden en ontdooid bij kamertemperatuur en vervolgens verteerd in HNO₃ (0,5 ml) en H₂ O₂ (0,5 ml) bij 160 °C. Na te zijn verdund tot 3 ml met 3% salpeterzuur, werd de concentratie van titanium in de oplossing bepaald met behulp van inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie (ICP-MS). Het titaniumgehalte in doelweefsels werd vervolgens berekend.

Bloedbiochemietests en berekening van de verhouding orgaan/lichaamsgewicht

De niveaus van de enzymen in serummonsters werden geanalyseerd door een automatische biochemische analysator (TBA-2000FR, Toshiba, Tokyo, Japan). Deze enzymen zijn biomarkers die verband houden met de functie van de lever en de nieren.

De verhouding orgaan/lichaamsgewicht werd berekend op basis van het gewicht van het orgaan en het lichaam. De lichaamsgewichten werden gemeten vóór anesthesie en opoffering. Organen werden gewogen na isolatie van verdoofde en opgeofferde muizen.

Pathologisch onderzoek en transmissie-elektronenmicroscopie

Pathologisch onderzoek van de lever of hersenweefsels gedrenkt in formaline werd uitgevoerd onder een lichtmicroscoop na hematoxylinekleuring. Voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) werden de leverweefsels ingebed in epoxyhars EPON 812 en werden ze in secties gesneden die zo dun waren als <500 μM na fixatie van glutaaraldehyde en osminezuur. De secties werden gekleurd met een verzadigde azijnzuur-uraanoplossing (pH 3,5) en loodcitraat (pH 12) gedurende 1-2 uur. De gekleurde coupes werden onderzocht met TEM.

Bepaling van de niveaus van reactieve zuurstofsoorten, de activiteiten van hun metabole enzymen en de niveaus van neurotransmitters

Voor de leverweefsels is het superoxide-anion (O₂ ^– ) niveaus werden bepaald met behulp van XTT. De activiteit van catalase (CAT) werd bepaald met behulp van OD-waarden bij 240 nm, volgens gepubliceerde procedures [20]. De niveaus van lipideperoxidatie werden bepaald door het gehalte aan malondialdehyde (MDA) volgens gepubliceerde procedures [21].

Hersenweefsels werden na isolatie gehomogeniseerd met voorgekoelde 1% polyvinylpolypyrrolidon-oplossing (50 mM in pH 7,6 PBS). Supernatanten werden verzameld na 20 minuten centrifugeren bij 15.000 tpm (Eppendorf 5418, Hamburg, Duitsland) en werden gebruikt voor daaropvolgende analyse van de activiteiten van superoxide-enzym (SOD), CAT, ascorbaatperoxidase (APX) en glutathionperoxidase (GSHPx). De SOD-activiteit werd bepaald met behulp van NBT (nitro-tetrazoliumchlorideblauw-test). Catalase-activiteit werd bepaald met behulp van een kit (CAT-assaykit, A007-2, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China). De activiteit van APX werd gemeten met behulp van een kit (APX-assaykit, A123, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China). GSHPx-activiteit werd bepaald met behulp van een kit (GSHPx-assaykit, A005, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China). De activiteiten van constitutieve stikstofoxidesynthase (cNOS), induceerbare stikstofoxidesynthase (iNOS) en acetylcholinesterase (AChe) werden bepaald met behulp van commerciële kits (AChe-assaykit, A024, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China).

De niveaus van ROS in hersenweefsel werden bepaald door 2′, 7′ dichloorfluorescinediacetaat toe te voegen tot een eindconcentratie van 10 μM in hersenweefselhomogenaat en door 30 minuten bij 37 ° C te incuberen; de weefsels werden vervolgens onderworpen aan analyse met behulp van flowcytometrie.

Bepaling van relatieve mRNA-niveaus

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit leverweefselmonsters met behulp van een commerciële kit (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, 9767, Takara, Dalian, China). Complementair DNA werd gesynthetiseerd met behulp van reverse transcriptie met willekeurige primer. De relatieve mRNA-niveaus van SOD, CAT, GSHPx, MT, HSP70, CYPA, P53, GST en TF werden bepaald met behulp van een realtime kwantitatieve PCR (qPCR)-kit (One Step SYBR® PrimeScript™ RT-PCR Kit, PR066A, Takara, Dalian, China). Alle primers (tabel 1) werden gesynthetiseerd en gekocht bij Shanghai Sangon Ltd.

Ex vivo embryotoxiciteitstest

Embryo's van 8,5 embryonale dagen werden geïsoleerd uit vrouwelijke muizen na cervicale dislocatie en werden vervolgens gekweekt in 50,0 ml Hank's-oplossing met 3 ml onmiddellijk gecentrifugeerd serum (ICS) van ratten, micro-TiO₂ , of nano-TiO₂ (0,0, 50,0, 100,0 en 200,0 μg/ml) met 3 embryo's in elke fles gedurende 48 uur.

Om het effect van micro-TiO₂ . te bepalen of nano-TiO₂ blootstellingstijd op embryo's, werden de embryo's gekweekt in 50,0 ml Hank's-oplossing met 3 ml ICS van ratten, micro-TiO₂ , of nano-TiO₂ (200,0 μg/ml) met 3 embryo's in elke fles gedurende 16, 26 en 48 uur, en vervolgens 48 uur gewassen met voorverwarmde 37 °C Hank's oplossing en gekweekt in 50,0 ml Hank's oplossing met 3 ml ICS van ratten.

Embryonale ontwikkeling werd geëvalueerd met behulp van de Maele-Fabry Van-score [22]. De diameter van de dooierzak, de lengte van de embryonale kroon-romp, de koplengte en het aantal lichaamsdelen werden onderzocht onder een dissectiemicroscoop. De mate van misvorming van zich ontwikkelende embryo's werd geëvalueerd op basis van de scores van morfologische veranderingen van de voorhersenen, middenhersenen, achterhersenen, de voorpootknop, de achterpootknop, de auditieve en visuele systemen en het hart. Meer dan 10 embryo's van 2 ICR-muizen op embryonale dag 10.5 werden geïsoleerd voor controle.

Statistische analyse

Gegevens werden geanalyseerd met behulp van SPSS 13 (IBM, Illinois, VS). Het verschil tussen de behandelingsgroep en de controlegroep werd geanalyseerd met behulp van een Dunnett's t test. Het verschil tussen groepen werd geanalyseerd met behulp van ANOVA. De vergelijking tussen twee van meerdere monsters werd geanalyseerd met behulp van de LSD- en SNK-tests. Categorische gegevens werden geanalyseerd met behulp van de chi-kwadraattest en de rangsomtest. Als P <0,05, het verschil werd als significant beschouwd.

Resultaten

Weefselverdeling van titanium in muizen na blootstelling aan titaniumdioxide op nanoschaal

We behandelden muizen met nano-TiO₂ (i.p., 5, 10, 50, 100, 150 en 200 mg/kg) gedurende 14 dagen en bepaald titaniumgehalte in de organen van muizen. Uit de resultaten bleek dat titanium zich ophoopte in de organen van muizen die werden behandeld met verschillende doses nano-TiO₂ (Figuur 1). De omvang van de accumulatie was dosisafhankelijk (Fig. 1). De lever was het orgaan waar titanium het meest was verrijkt, gevolgd door de nier. De omvang van de ophoping van titanium was ongeveer hetzelfde in de milt, long, hersenen en hart (Fig. 1). De resultaten suggereren dat nano-TiO₂ kan worden geabsorbeerd via het maagdarmkanaal en via de bloedsomloop naar weefsels worden gedistribueerd en worden afgezet in de organen lever, nier, milt, long, hersenen en hart.

Titanium werd opgehoopt in organen van muizen die waren blootgesteld aan nano-TiO₂ . Muizen werden behandeld met nano-TiO₂ suspensie of zoutoplossing zoals aangegeven via intraperitoneale injectie eenmaal per dag gedurende 14 dagen. * vergeleken met controle, P < 0.05, # vergeleken met controle, P < 0.01

Algemene toxiciteit van titaniumdioxide op nanoschaal bij muizen

We behandelden muizen met verschillende doses nano-TiO₂ gedurende 14 dagen en vonden dat er geen verschil was in lichaamsgewichtstoename tussen groepen muizen die met verschillende doses werden behandeld (gegevens niet getoond). Lage doses nano-TiO₂ (5 en 10 mg/kg) veranderde de verhouding orgaan/lichaamsgewicht van de lever, nier, milt, long, hart en hersenen bij muizen niet na i.p. blootstelling gedurende 14 dagen (Fig. 2). De hoge doses nano-TiO₂ (50, 100, 150 en 200 mg/kg) verhoogde de verhouding orgaan/lichaamsgewicht van de lever, nier, milt en hart significant en verminderde die van long en hersenen bij muizen op een dosisafhankelijke manier (Fig. 2 ).

Verhouding orgaan/lichaamsgewicht bij muizen blootgesteld aan nano-TiO₂ . Muizen werden behandeld met nano-TiO₂ suspensie of zoutoplossing zoals aangegeven via intraperitoneale injectie eenmaal per dag gedurende 14 dagen. * vergeleken met controle, P <0,05; # vergeleken met controle, P < 0.01

Lagere doses (5, 10, 50 en 100 mg/kg) nano-TiO₂ veranderde geen enkele bloedbiochemie-index (Fig. 3). Hoge doses nano-TiO₂ (150 tot 200 mg/kg) verhoogde leverfunctie-biomarkers alkalische fosfatase (ALP) en alanine-aminotransferase (ALT), albumine (ALB), leucine-aminopeptidase (LAP), butyrylcholinesterase (PChe), totaal bilirubine (TBIL) en totaal eiwit ( TP) niveaus (Fig. 3). Hoge doses verlaagden de serumurinezuur (UA) en bloedureumstikstof (BUN) niveaus, die biomarkers zijn voor de nierfunctie. Ze verhoogden de serum-aspartaataminotransferase (AST), creatinekinase (CK), lactaatdehydrogenase (LDH) en alfa-hydroxybutyraatdehydrogenase (HBDH) niveaus, die indices zijn voor myocardiale schade (Fig. 3).

Bloedbiochemie-index bij muizen blootgesteld aan nano-TiO₂ . Muizen werden behandeld met nano-TiO₂ suspensie of zoutoplossing zoals aangegeven via intraperitoneale injectie eenmaal per dag gedurende 14 dagen. * vergeleken met controle, P <0,05; # vergeleken met controle, P <0,01. een Biochemie-index voor biomarkers voor de leverfunctie. b Biochemie-index voor biomarkers voor nierfunctie. c Biochemie-index voor biomarker voor myocardiale schade

Deze resultaten suggereren dat hoge doses TiO₂ kan op dosisafhankelijke wijze ernstige schade aan de lever, nieren, hart en andere organen veroorzaken.

Levertoxiciteit van Nano-TiO₂ in muizen

We evalueerden verder de levertoxiciteit van nano-TiO₂ . Met behulp van lichtmicroscopie ontdekten we dat er geen significante verandering was in de lever van muizen die waren blootgesteld aan een lage dosis (i.p. gedurende 14 dagen, 5 mg/kg) nano-TiO₂ (Fig. 4a, b). We observeerden duidelijke vasculaire obstructie en dilatatie (Fig. 4c, 50 mg/kg), toename van basofielen (Fig. 4d, 100 mg/kg), partiële ischemie in de lever (Fig. 4e, 150 mg/kg) en obstructie van centrale aderen (Fig. 4f, 200 mg/kg) bij muizen die zijn blootgesteld aan nano-TiO₂ (i.p.).

Histologie van levers bij muizen behandeld met nano-TiO₂ blootgesteld aan nano-TiO₂ . Muizen werden behandeld met nano-TiO₂ suspensie of zoutoplossing zoals aangegeven via intraperitoneale injectie eenmaal per dag gedurende 14 dagen. een Controle. b TiO₂ , 5 mg/kg. c TiO₂ , 50 mg/kg. d TiO₂ , 100 mg/kg. e TiO₂ , 150 mg/kg. v TiO₂ , 200 mg/kg

Met behulp van TEM vonden we echter een lichte zwelling van de mitochondriën in hepatocyten en de aanwezigheid van gecondenseerde chromatine- en apoptotische cellen in de leverweefsels bij muizen die waren blootgesteld aan een lage dosis nano-TiO₂ (sonde gedurende 60 dagen, 5 mg/kg) (Fig. 5a, b). We hebben nano-TiO₂ . waargenomen in de mitochondriën van hepatocyten, zwellende mitochondriën en vacuolen in mitochondriën van de levercellen van muizen die zijn behandeld met 10 mg/kg nano-TiO₂ (sonde gedurende 60 dagen, figuur 5c). We observeerden verder instorting van de nucleolus, verspreide chromatine, duidelijke apoptose en/of apoptotische lichamen in de levercellen van muizen die werden behandeld met 50 mg/kg nano-TiO₂ (sonde gedurende 60 dagen, figuur 5d). De resultaten gaven aan dat nano-TiO₂ kan leiden tot pathologische schade in levercellen op subcellulair en cellulair niveau.

Ultramicroscopische structuur van hepatocyten bij muizen blootgesteld aan nano-TiO₂ . Muizen werden behandeld met nano-TiO₂ zoals aangegeven via sondevoeding eenmaal per dag gedurende 60 dagen. De muizen in de controlegroep kregen 0,5% CMC (carboxymethylcellulose). een Bediening (×8000). b TiO₂ (5 mg/kg) (×8000). c TiO₂ (10 mg/kg) (× 10.000). Pijlen geven mitochondriën en vacuolen in mitochondriën aan. d TiO₂ (50 mg/kg) (× 10.000)

De behandeling van muizen met 5 mg/kg nano-TiO₂ gedurende 60 dagen heeft de ROS-niveaus niet gewijzigd, zoals O²⁻ , H₂ O₂ , stikstofmonoxide (NO) en MDA (Fig. 6) of de mRNA-niveaus van SOD-, CAT-, GSHPx-, MT-, GST-, HSP70-, P53- en TF-genen in leverweefsels (Fig. 7). Behandeling van muizen met 10 of 50 mg/kg nano-TiO₂ gedurende 60 dagen resulteerden in aanzienlijke verhogingen van de niveaus van O²⁻ , H₂ O₂ , NO en MDA (Fig. 6), verlagingen van de mRNA-niveaus van SOD-, CAT-, MT-, GST-, HSP70-, P53-, TF- en GSHPx-genen, en verhogingen van de mRNA-niveaus van CYP1A-genen in de levers van muizen ( Afb. 7). De resultaten toonden aan dat hoge doses nano-TiO₂ -geïnduceerde oxidatieve stress en veranderingen in de expressie van beschermende genen in de lever van blootgestelde muizen.

ROS-productiesnelheden en lipideperoxidatieniveaus in levers van muizen die zijn blootgesteld aan nano-TiO₂ . Muizen werden behandeld met nano-TiO₂ zoals aangegeven via sondevoeding eenmaal per dag gedurende 60 dagen. De muizen in de controlegroep kregen 0,5% CMC (carboxymethylcellulose). * vergeleken met controle, P < 0,05, genormaliseerd naar totaal eiwit

Relatieve expressieniveaus van genen in levers van muizen die zijn blootgesteld aan nano-TiO₂ . Muizen werden behandeld met nano-TiO₂ zoals aangegeven via sondevoeding eenmaal per dag gedurende 60 dagen. De muizen in de controlegroep kregen 0,5% CMC (carboxymethylcellulose). * vergeleken met controle, P <0,05; # vergeleken met controle, P < 0.01, genormaliseerd naar β-actine

Hersentoxiciteit van titaniumdioxide op nanoschaal bij muizen

We hebben de hersentoxiciteit van nano-TiO₂ . verder geëvalueerd . We onderzochten eerst de verhoudingen van hersenen/lichaamsgewichten bij de muizen die waren blootgesteld aan nano-TiO₂ (i.p. gedurende 14 dagen). Lage doses (5, 10, 50 mg/kg) veranderden de verhoudingen van hersenen/lichaamsgewichten niet, en hogere doses (100, 150, 200 mg/kg) verlaagden de verhoudingen van hersenen/lichaamsgewichten significant in een dosisafhankelijke manier (Fig. 2). De concentratie van Ti in de hersenweefsels was dosisafhankelijk significant verhoogd (Fig. 1).

We onderzochten ook de histologische veranderingen in de hersenen van muizen die waren blootgesteld aan nano-TiO₂ (i.p. gedurende 14 dagen) met hematoxylinekleuring. We hebben waargenomen dat lage doses nano-TiO₂ (50 mg/kg) veranderde de histologie van hersenweefsel bij muizen niet na i.p. blootstelling gedurende 14 dagen (Fig. 8a, b). Behandeling van muizen met 100 mg/kg nano-TiO₂ resulteerde in gescheurde en gebarsten zenuwcellen in het hersenweefsel (Fig. 8c). Behandeling van muizen met 150 mg/kg nano-TiO₂ resulteerde in invasie van ontstekingscellen in het hersenweefsel (Fig. 8d). De resultaten toonden aan dat hoge doses nano-TiO₂ kan morfologische schade aan hersenweefsel veroorzaken, met als gevolg een ontstekingsreactie.

Pathologische veranderingen in hersenweefsel van muizen blootgesteld aan nano-TiO₂ . Muizen werden behandeld met nano-TiO₂ suspensie of zoutoplossing zoals aangegeven via intraperitoneale injectie eenmaal per dag gedurende 14 dagen. een Controle. b 50 mg/kg. c 150 mg/kg. d 200 mg/kg

We bepaalden de effecten van nano-TiO₂ over de redoxtoestand en signaalmoleculen in hersenweefsel van muizen die zijn blootgesteld aan nano-TiO₂ (i.p. gedurende 14 dagen). We hebben vastgesteld dat een lage dosis (5 mg/kg) nano-TiO₂ heeft O²⁻ . niet gewijzigd , H₂ O₂ en MDA-niveaus, veranderden de activiteiten van de antioxidant-enzymen APX, CAT, GSHPx en SOD niet, of de niveaus van niet-enzymatische antioxidanten ASA/DASA en GSH/GSSG. Evenmin veranderde het de activiteit van stikstofmonoxidesynthase (NOS) en de NO-niveaus in hersenweefsels (Fig. 9 en 10). Hogere doses nano-TiO₂ verhoogde O²⁻ , H₂ O₂ , en MDA-niveaus, verlaagden de activiteiten van de antioxidante enzymen APX, CAT, GSHPx en SOD, verlaagden de niveaus van de niet-enzymatische antioxidanten ASA/DASA en GSH/GSSG, verhoogden de niveaus van NO en activiteiten van NOS, en verminderden de niveaus van AchE en bloedglucose (GLU) in de hersenweefsels (Fig. 9 en 10). Deze resultaten suggereren dat nano-TiO₂ kan bij muizen schade aan de hersenen veroorzaken na i.p. blootstelling.

ASA/DASA- en GSH/GSSG-verhoudingen in de hersenen bij muizen die waren blootgesteld aan nano-TiO₂ . Muizen werden behandeld met nano-TiO₂ suspensie of zoutoplossing zoals aangegeven via intraperitoneale injectie eenmaal per dag gedurende 14 dagen

Veranderingen in de ROS, antioxidante enzymen, NO-signalering, glutamaat en AchE-activiteiten in hersenen van muizen die zijn blootgesteld aan nano-TiO₂ . Muizen werden behandeld met nano-TiO₂ suspensie of zoutoplossing zoals aangegeven via intraperitoneale injectie eenmaal per dag gedurende 14 dagen. N = 10, * vergeleken met controle, P <0,05; # vergeleken met controle, P <0,01. een Verandering van ROS (O2-, H2O2 en MDA) in hersenen van muizen die zijn blootgesteld aan nano-TiO2. b Verandering van antioxidante enzymen (SOD, CAT, APX en GSHPx) in hersenen van muizen die zijn blootgesteld aan nano-TiO2. c Verandering van NO-signaleringscomponenten (cNOS, iNOS en NO) in hersenen van muizen die zijn blootgesteld aan nano-TiO2. d Verandering van glutamaatgehalte en AchE-activiteit in hersenen van muizen die zijn blootgesteld aan nano-TiO2

Toxisch effect van Nano-TiO₂ op Ex Vivo muisembryo's

Om de ontwikkelingstoxiciteit van nano-TiO₂ . te evalueren , vergeleken we eerst de groei en ontwikkeling van in vivo embryo's en ex vivo embryo's. De resultaten toonden aan dat de groei en ontwikkeling van ex vivo embryo's vergelijkbaar was met die van in vivo embryo's (gegevens niet getoond). Daarom hebben we ex vivo embryo's gebruikt om de toxische effecten van nano-TiO₂ . te bestuderen op embryo's.

We onderzochten de effecten van verschillende doses (eindconcentraties 0,0, 50,0, 100,0 en 200,0 μg/ml) en verschillende blootstellingstijden van micro-TiO₂ /nano-TiO₂ op embryonale groei en ontwikkeling, evenals de morfologie van weefsels en organen door de embryonale VXY-diameter, kroon-romplengte, hoofdlengte en het aantal lichaamsdelen te onderzoeken. De resultaten toonden aan dat de micro-TiO₂ veranderde deze indicatoren bij geen enkele dosis (tabel 2).

Voor verschillende maten nano-TiO₂ , behandeling van embryo's van 5-10 nm, 60 nm, 90 nm met 50,0 μg/ml TiO₂ had geen effect op de embryonale VXY-diameter, kroon-romplengte, hoofdlengte en het aantal lichaamsdelen (tabel 2). Hogere doses (100,0 en 200,0 μg / ml) verminderden de VXY-diameter, kroon-romplengte, hoofdlengte en aantal lichaamsdelen, en verhoogde misvormingssnelheid (tabel 2). Voor dezelfde dosis was er geen duidelijk verschil tussen de groepen die werden behandeld met verschillende maten nano-TiO₂ , 50,0 of 100 μg/ml. Behandeling van embryo's met 200 μg/ml nano-TiO₂ significant verminderde VXY-diameter, kroon-romplengte, koplengte en het aantal lichaamsdelen van muizenembryo's met toenemende nano-TiO₂ deeltjes (tabel 2).

Behandeling van muizenembryo's met micro-TiO₂ (200,0 μg/ml) gedurende 16, 24 en 48 uur veranderde de VXY-diameter, kroon-romplengte, hoofdlengte en het aantal lichaamsdelen niet (tabel 3). Behandeling van muizenembryo's met nano-TiO₂ (5-10 nm en 60 nm, 90 nm, 200,0 μg/ml) gedurende 16 uur veranderde ook de VXY-diameter, kroon-romplengte, hoofdlengte en het aantal lichaamsdelen niet (tabel 3). De behandeling van muizenembryo's met nano-TiO₂ (5–10 nm and 60 nm, 90 nm, 200.0 μg/mL) for 24 and 48 h decreased VXY diameter, crown–rump length, head length, the number of body sections, and increased the malformation rate (Table 3). For the same exposure time, there was no difference in VXY diameter, crown–rump length, head length, the number of body sections, or malformation rate among groups of different sizes of nano-TiO₂ particles (Table 3).

In summary, these results indicate that nano-TiO₂ had toxic effects on the growth and development of mouse embryos in dose-dependent and time-dependent manners. The sizes of the nano-TiO₂ particles may affect toxicity with a trend of increasing toxicity associated with larger nano-TiO₂ particles.

Discussion

Nano-TiO₂ has been widely used in industry and medicine. However, the safety of nano-TiO₂ exposure remains unclear. In the present study, we investigated the potential toxicity of nano-TiO₂ , using mice models. We find that nano-TiO₂ accumulates in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after exposure (i.p. injection) in a dose-dependent manner. High doses of nano-TiO₂ significantly increase the organ/body weight ratios of the liver, kidney, spleen, and heart, and decrease those of the lung and brain in a dose-dependent manner. Moreover, high doses of nano-TiO₂ significantly increase the levels of ALT, ALP, LAP, PChE, TP, ALB, and TBIL, which are indices for liver function. They decrease the levels of UA and BUN, which are renal function indicators. Further, high doses significantly increase the activities of CK, LDH, AST, and HBDH, and significantly increase the levels of GLU, trigylceride, total cholesterol, and high-density lipoprotein. Low doses of nano-TiO₂ do not change these biochemical parameters. Our data support that nano-TiO₂ may be toxic and may affect the liver, kidney, heart, GLU, and lipid metabolism at high doses in a dose-dependent manner.

In the present study, we investigated the mechanism of liver toxicity of nano-TiO₂ . We find that high doses of nano-TiO₂ may cause swelling of hepatocytes with obvious vacuoles in cells, and nuclear condensation in hepatocytes, and apoptosis and necrosis of hepatocytes in liver tissues. This is consistent with previous studies [7, 23, 24]. After the treatment of mice with high doses of nano-TiO₂ , we find that the levels of CAT, GSHPx, and SOD are significantly decreased, and there is nano-TiO₂ in the mitochondria of hepatocytes, revealed by TEM. This is consistent with previous studies [7, 25,26,27,28] suggesting that nano-TiO₂ generates excess ROS and reduces the antioxidant capacity of the cells through damaging the mitochondria. This is further supported by observation that nano-TiO₂ can significantly decrease the mRNA levels of SOD, CAT, GSHPx, MT and HSP70, CYP1A1, p53, GST, and TF genes in the mouse liver. SOD, CAT, GSH PX, and MT are involved in liver cell detoxification, CYP1A1 is involved in toxic-substance metabolism and defense against invasion from harmful substances, and HSP70 and p53 are involved in repairing liver cell DNA damage [10, 29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39]. These findings support that the mechanisms for nano-TiO₂ liver toxicity are damaging mitochondria, generating ROS, and causing expression disorders of protective genes.

In the present study, we investigated the mechanism of brain neurotoxicity of nano-TiO₂ . We find that high doses of nano-TiO₂ can produce lipid peroxidation and decrease antioxidant capacity, including SOD, CAT, APX, and GSHPx activities, resulting in oxidative stress, which may damage unsaturated fatty acids and brain tissue [24, 26, 37, 40]. We observed rupture and cracking in nerve cells and the infiltration of inflammatory cells in the brain. We further found that the activities of cNOS and iNOS are increased, and NO is excessively released. Glutamic acid levels and AChe activity are decreased in the brain. This is consistent with the effect of Fe₂ O₃ nanoparticles on olfactory bulb cells [40] and the effect of nano-TiO₂ on mouse hippocampal neurons [31, 41]. Glutamate is the most abundant amino acid in excitatory neurotransmitters of the nervous system. It is critical for the brain’s development and function [42]. Acetylcholinesterase is a key enzyme for levels of acetylcholine, which is critical for the function of the peripheral and central nervous systems. Nitric oxide regulates many central nervous functions, such as synaptic plasticity, the sleep–wake cycle, and hormone secretion [43]. Therefore, nano-TiO₂ may cause oxidative stress and may disrupt orders of neurochemical metabolism in brain tissue and therefore have neurotoxicity in the central nervous system.

We find that the micro-TiO₂ and low doses of nano-TiO₂ (5–10 nm and 60 nm and 90 nm) do not exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, while high doses of nano-TiO₂ (100–200.0 μg/ml) exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, as revealed by evaluation of morphology of exposed embryos. Whole embryo culture is a useful tool to assess the developmental toxicity of chemicals [44, 45]. Previous studies show that exposure of 14-day pregnant mice to a single dose of nano-TiO₂ in the nasal cavity increase the sensitivity of inflammatory response in F1 generation [46, 47]. Nano-TiO₂ does not affect white pregnant Kunming mice but inhibits growth, increases the rate of stillbirth, and exhibits developmental toxicity [48]. These studies indicate the presence of the developmental and genetic toxicity of nano-TiO₂ . This is further supported by studies that show cleavage and oxidative damage of DNA by nano-TiO₂ , for example, in Zebra fish [16, 49, 50]. Additionally, another shows an increase in the sister chromatid exchange rates in Chinese hamster ovary cells [51]. Nano-TiO₂ may also prevent chromosome formation during metaphase in the ovary when TiO₂ concentration is high [51]. These studies consistently show that exposure to high doses of nano-TiO₂ is linked with developmental and genetic toxicity. Furthermore, our data indicated that the size of nano-TiO₂ particles may affect its toxicity, with the trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO₂ particles (Table 2).

In the current study, we found that titanium accumulates in a dose-dependent manner in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after i.p. injection of nano-TiO₂ . This is consistent with published reports that absorption and distribution of nano-TiO₂ is dependent on blood circulation. Nanoparticles can be absorbed in mesenchymal cells through being ingested by airway epithelial cells; they can then penetrate into the blood or lymph, thus gradually being distributed to the whole body [52, 53]. It is worth noting that nano-TiO₂ in the abdomen cavity can be absorbed and transported to the brain by the circulatory system, and nano-TiO₂ can enter directly into the central nervous system without crossing the blood–brain barrier. This is consistent with previous studies [41, 54]. Nanoparticles can also be absorbed by the terminal nerve cell in the respiratory tract and then be transferred to the ganglion through the axon, eventually entering central nervous cells [8, 55]. Nano-TiO₂ can be absorbed in the nasal cavity through the olfactory epithelium, and then be transported to other parts of the brain, such as the hippocampus, through the olfactory nerve [41, 54]. Therefore, the brain may be directly exposed to nano-TiO₂ . Damage in the brain may be caused directly or indirectly by nano-TiO₂ .

Conclusions

Ingested nano-TiO₂ can be distributed to and accumulated in the heart, brain, spleen, lung, and kidney. It exhibits toxicity and causes disorders of the GLU and lipid metabolism. Nano-TiO₂ causes liver and brain toxicity mainly through increasing oxidative stress, decreasing antioxidant levels, and changing the expression of the protective genes in the liver. In addition, nano-TiO₂ has adverse effects on the growth and development of mouse embryos and the morphology of the tissues and organs. The size of nano-TiO₂ particles may affect their toxicity, with a trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO₂ particles. These toxic effects are dose-dependent. Our study may provide data for the assessment of the risk of nano-TiO₂ exposure on human health.