Een zeer gevoelige elektrochemische DNA-biosensor van acryl-goud nanocomposiet voor de bepaling van het geslacht van Arowana-vissen

Resultaten en discussie

De als-gesynthetiseerde AcMP's werden waargenomen (Fig. 2) onder scanning-elektronenmicroscoop (SEM, LEO 1450VP). De grootteverdeling van miscropsheres van acryl bereid door fotopolymerisatie wordt geïllustreerd in Fig. 3.

SEM-afbeelding van microbolletjes van acrylpolymeer

Grootteverdeling van acrylmicrobolletjes bereid door fotopolymerisatie

Het effect van de verschillende scansnelheden van de koolstof SPE die AcMPs-AuNPs bevat in aanwezigheid van K₃ Fe(CN)₆ toonde aan dat de oxidatie- en reductiepiekstromen toenamen met de toename van de scansnelheid van 0,05 tot 0,30 V/s (Fig. 4). Er wordt dus verwacht dat het elektronenoverdrachtproces aan het elektrode-oppervlak omkeerbaar is [22,23,24,25].

Cyclische voltammogrammen van 1,0 mM K₃ Fe(CN)₆ in 0,05 M Na-fosfaatbuffer met een pH van 7,0 met verschillende scansnelheden (0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25 en 0,30 V/s) voor een gemodificeerde koolstof SPE met AcMP-AuNP-materiaal op het elektrodeoppervlak

Gebaseerd op de Randles-Sevcik-vergelijking,

er werd een goede lineariteit gevonden tussen de redoxpiekstroom en de vierkantswortel van de scansnelheid met een correlatiecoëfficiënt (R ² ) van 0,996 binnen het bereik van 50-300 mV/s zoals getoond door Vgl. 2 en Afb. 5a.

Plot van de oxidatiepiekstromen (ip/μA) versus vierkantswortel van scansnelheid ((mV/s) ^1/2 ) (een ) en plot van log van oxidatiepiekstromen (ip/μA) versus log van scansnelheden (log (mV/s)) (b )

Dit geeft aan dat de reactie aan het oppervlak van de gemodificeerde elektrode een diffusiegecontroleerde reactie was [22,23,24,25].

Verder werd, op basis van figuur 5b, toen de logwaarde van de oxidatiestroom werd uitgezet tegen de logwaarde van de scansnelheid, een lineaire lijn verkregen met een helling van 0,65, wat dicht bij de theoretische waarde van 0,50 lag voor een diffusiegecontroleerd proces . Daarom heeft de studie aangetoond dat de reactie aan het oppervlak van de gemodificeerde SPE grotendeels diffusiegecontroleerd is.

Voor het ideale geval van een snel, omkeerbaar en één-elektron overdrachtsproces, is ΔEp =0,059 V bij 298 K. De piekpotentiaalverschuivingen die toenam met de scansnelheid vertoonden echter grotere piekpotentiaalscheidingen van meer dan 0,059 V (Fig 4 ). Dit houdt in dat het proces van elektronenoverdracht op het elektrode-oppervlak traag is [22, 25, 26], waarschijnlijk vanwege de weerstand die wordt gecreëerd door de aanwezigheid van AcMP-materiaal dat het elektrode-oppervlak bedekt.

Figuur 6 toont de DPV-respons van arowana DNA-biosensor op basis van AcMP-, AuNP- en AcMP-AuNP-gemodificeerde koolstof-SPE's. Het significante DPV-stroomverschil dat werd waargenomen tussen experiment (a) en (c) onthult dat de arowana-DNA-sondes met succes op de AcMP's werden geënt via sterke covalente bindingen tussen de functionele succinimide-groep van AcMP en de functionele aminegroep van de geamineerde DNA-sonde, en de geïmmobiliseerde arowana DNA-probe was alleen selectief voor zijn cDNA [19, 20]. De AuNP's speelden een rol om de elektronengeleiding van de geïntercaleerde AQMS naar het gefabriceerde elektrodeoppervlak te ondersteunen. Zonder de opname van AuNP's in het composietmateriaal (f), alleen gouden nanodeeltjes (e), en de gouden nanodeeltjes en AcMP-composiet (d), kan slechts zeer weinig huidige respons worden waargenomen. De lage DPV-stromen die in experiment (b) werden verkregen, waren te wijten aan het feit dat er geen DNA-hybridisatiereactie plaatsvond met ncDNA, wat ook aangeeft dat er geen specifieke absorpties van AQMS-redox-indicator op het elektrode-oppervlak [27, 28].

Het DPV-signaal van op AcMP-AuNP gebaseerde DNA-elektrode na hybridisatie met cDNA (a ) en niet-complementair DNA (b ), de DPV-reactie van de AcMP's (f ) en AuNP-gemodificeerde SPE (e ), en AcMP-AuNP composiet gemodificeerde SPE, evenals de respons van DNA-biosensor op basis van AcMP-AuNP composiet gemodificeerde probe DNA SPE (c ) vóór reactie met cDNA in aanwezigheid van 1 mM AQMS met een scansnelheid van 0,5 V/s versus Ag/AgCl-referentie-elektrode

Voor de duur van de immobilisatie van de DNA-probe, toont Fig. 7a dat de DNA-biosensorrespons langzaam toenam gedurende de eerste 1-3 uur van de immobilisatietijd van de DNA-probe en de abrupte toename van de DNA-biosensorrespons kan worden gezien tussen 3 en 6 uur van de immobilisatieduur van de DNA-probe . Dit was omdat een langere immobilisatietijd nodig was om een ​​grotere hoeveelheid DNA-probes te bevorderen die op de AcMP-AuNP-gemodificeerde elektrode moesten worden bevestigd. Bij een verdere verlenging van de immobilisatietijd van de DNA-probe werd geen merkbare verandering in de DNA-biosensorrespons waargenomen, aangezien de bindingsplaatsen van geïmmobiliseerde AcMP's volledig zijn gebonden met DNA-probes. De respons van de arowana DNA-biosensor is ook afhankelijk van de DNA-hybridisatietijd. Het biosensorresponsprofiel geïllustreerd in Fig. 7b toont een toenemende DPV huidige responstrend met DNA-hybridisatieduur van 10 tot 60 minuten, waarna de huidige respons bijna plateau wordt. In dit stadium zijn de geïmmobiliseerde DNA-probes op de elektrode volledig gehybridiseerd met cDNA [29].

Effecten van immobilisatietijd van de DNA-probe (a ) en DNA-hybridisatietijd (b ) op de arowana DNA-biosensorrespons met behulp van 5 μM DNA-sonde en cDNA in aanwezigheid van 1 mM AQMS met een ionsterkte van 2 M

Er wordt ook opgemerkt dat de DNA-hybridisatietijd van de gefabriceerde arowana DNA-biosensor temperatuurafhankelijk was, en als een groot voordeel verkregen we binnen 30 minuten een maximale stroomrespons bij kamertemperatuur (Fig. 8). Bij lage temperatuur, d.w.z. 4 °C, was een lange tijd nodig voor een volledige DNA-hybridisatiereactie omdat de koude temperatuur de snelheid van de DNA-hybridisatiereactie vertraagde. Een snellere DNA-hybridisatietijd kon worden bereikt bij een temperatuur boven 25°C die wordt toegeschreven aan de hogere DNA-hybridisatiereactiesnelheid die optrad tussen geïmmobiliseerde DNA-probe en cDNA om het duplex-DNA bij hoge temperaturen te vormen. Hoge temperaturen kunnen echter de dubbele helixstructuur van DNA permanent vervormen en regeneratie van het DNA-molecuul is niet mogelijk, zelfs niet nadat de temperatuur opnieuw op de optimale waarde is ingesteld [28, 30].

Effect van temperatuur op de DNA-hybridisatietijd van arowana DNA-biosensor. De DPV-respons werd gemeten in 0,05 M K-fosfaatbuffer (pH 7,0) bij 4, 25, 40 en 50 °C gedurende een experimentele periode van 5-90 min

Als onderdeel van de optimalisatie van de respons van de arowana DNA-biosensor werd het effect van de pH van de oplossing op de DNA-hybridisatiereactie onderzocht. De DNA-biosensor vertoonde een verwaarloosbare stroomverandering tussen pH 5,5 en pH 6,5 als gevolg van de protonering van de fosfodiester-ruggengraat van DNA, wat de oplosbaarheid van DNA-moleculen in een waterige omgeving verminderde (Fig. 9). Verdere verhoging van de pH van het DNA-hybridisatiemedium, de respons van de arowana DNA-biosensor nam abrupt toe bij pH 7,0, waarna een scherpe daling van de DPV-stroom waarneembaar was toen de pH-omgeving veranderde in basische toestand als gevolg van de onomkeerbare denaturatie van DNA in de hogere pH bereik [23, 24, 31,32,33]. Aangezien de maximale DPV-respons werd verkregen bij een neutrale pH, werd de volgende elektrochemische evaluatie van de respons van de arowana DNA-biosensor op pH 7,0 gehouden met 0,05 M Na-fosfaatbuffer.

De DPV-respons van arowana DNA-biosensor op basis van AcMP-AuNP composiet gemodificeerde koolstof SPE tussen pH 5,5 en pH 8,0. De DPV-meting werd uitgevoerd in 0,05 M K-fosfaatbuffer (pH 7,0) bij 25 °C en een scansnelheid van 0,5 V/s versus Ag/AgCl-referentie-elektrode

Het effect van de valentie van kationen op de DNA-hybridisatiereactie werd uitgevoerd met gebruikmaking van verschillende kationen van zouten, b.v. Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ , en Fe ³⁺ ionen in de DNA-hybridisatiebuffer. De positief geladen ionen zouden elektrostatisch kunnen interageren met de negatief geladen fosfodiësterketen van het DNA-molecuul om de sterische belemmering en elektrostatische afstoting tussen de geïmmobiliseerde DNA-probe en het doel-DNA te overwinnen, waardoor het DNA-hybridisatieproces wordt vergemakkelijkt [34]. Figuur 10 laat zien dat de DNA-hybridisatiereactie gunstig was in de aanwezigheid van kationen in de orde van Na ⁺ > K ⁺ > Fe ³⁺ > Ca ²⁺ . De aanwezigheid van Ca ²⁺ en Fe ³⁺ ionen bleken een opmerkelijke afname te veroorzaken in de stroomrespons van de arowana DNA-biosensor in vergelijking met Na ⁺ en K ⁺ ionen. Deze verschijnselen werden toegeschreven aan de vorming van slecht oplosbaar calciumfosfaat en ferrum(III)fosfaatzouten in de DNA-hybridisatiebuffer [22], die het ionengehalte van de oplossing verlaagden en een hoge elektrostatische afstoting tussen de DNA-moleculen veroorzaakten. Als resultaat nam de DNA-hybridisatiesnelheid af en leidde dit tot slechte biosensorprestaties. De hoogste DNA-biosensorrespons werd verkregen toen Na ⁺ ionen werden toegevoegd aan de DNA-hybridisatiefosfaatbuffer vanwege hun kleine omvang en sterke affiniteit voor de DNA-fosfodieterbinding.

Het effect van Ca ²⁺ , Na ⁺ , K ⁺ , en Fe ³⁺ ionen in de DNA-hybridisatiebuffer (0,05 M Na-fosfaatbuffer bij pH 7,0) op de DPV-respons van arowana DNA-biosensor

De concentratie van NaCl en Na-fosfaatbuffer (pH 7,0) moet ook worden geoptimaliseerd om een ​​optimale ionsterkte voor hybridisatiebuffer te verschaffen. Figuur 11b geeft aan dat een ionsterkte van onder en boven 2 M de hoge elektrostatische afstoting tussen DNA-strengen niet kon overwinnen. Ongeveer 0,05 M Na-fosfaatbuffer (Fig. 11a) en 2 M NaCl bleken de optimale ionsterkte te bieden voor de bepaling van arowana-doelwit-DNA met maximale biosensorprestaties. Optimale hybridisatiebuffercondities in termen van pH, buffercapaciteit en ionsterkte zouden DNA-hybridisatiereactie mogelijk maken met de meest minimale sterische hinder [30].

De arowana DNA biosensor respons trends als de a Na-fosfaatbufferconcentratie en b ionsterkte van de hybridisatiebuffer varieerde van respectievelijk 0,002-0,100 M en 1,52-5,50 M

De geoptimaliseerde DNA-biosensor werd vervolgens gebruikt voor de detectie van een reeks arowana-cDNA-concentraties tussen 1,0 × 10 ⁻¹² en 1,0 × 10 ⁻² M. De DNA-biosensor vertoonde een breed lineair responsbereik van 1,0 × 10 ⁻¹⁸ tot 1,0 × 10 ⁻⁸ M (R ² =0,99). De detectielimiet (LOD) verkregen bij 1,0 × 10 ⁻¹⁸ M werd berekend op basis van driemaal de standaarddeviatie van de biosensorrespons bij de responscurve die LOD benadert gedeeld door de lineaire kalibratiehelling. De homogene AcMP-deeltjesgrootte binnen een micrometerbereik vertoonde een significante invloed op de gevoeligheid en reproduceerbaarheid van de DNA-biosensor (RSD =5,6%). Door het grote bindingsoppervlak van de geïmmobiliseerde NAS-gefunctionaliseerde AcMP's kon een groot aantal DNA-moleculen covalent aan het elektrodeoppervlak binden, waardoor de analytische prestatie van de DNA-biosensor met betrekking tot dynamisch lineair bereik en detectielimiet van de arowana DNA-biosensor werd verhoogd (Fig. 12).

The arowana DNA biosensor response curve (a ) and linear calibration range (b ) and the DPV voltammogram (c ) obtained using 1.0 × 10 ⁻¹⁸ to 1.0 × 10 ⁻² μM cDNA at pH 7.0

Determination of Arowana Fish Gender with DNA Biosensor

The developed electrochemical DNA biosensor has been validated with the standard PCR-based method to determine the gender of Asian arowana fish. With the results tabulated in Table 2, both methods provided the same result for the gender determination of arowana fish. This indicates that the proposed DNA biosensor can be used for accurate determination of arowana gender in a simple and fast way.