Hyperspectrale gemultiplexte biologische beeldvorming van nanosondes die uitzenden in het kortegolf-infraroodgebied

Methoden

Voorbereiding en karakterisering van nanoformulering

Synthese van polymere kern-shell nanodeeltjes geladen met organische fluorescerende NIR-SWIR-kleurstof

Polystyreen (PS)-poly-N -isopropylacrylamide (PNIPAM) core-shell nanodeeltjes werden gesynthetiseerd door micro-emulsiepolymerisatie, met wijziging van de eerder beschreven methode [44, 45]. Eerst werden PS-co-PNIPAM (10 wt.% of PNIPAM) kernnanodeeltjes als volgt bereid. NIPAM (0,1 g), natriumdodecylsulfaat SDS (0,1 g) en 0,005  g NaH₂ PO₄ × H₂ O werden opgelost in 45 ml H₂ O. Styreen (1 g) werd druppelsgewijs toegevoegd onder krachtig roeren toen de temperatuur werd verhoogd tot 60°C. Terwijl de volgende stap Ar gedurende 30 min in het mengsel werd geborreld, werd de temperatuur verhoogd tot 70 °C en 0,08 g K₂ S₂ O₈ opgelost in 1 ml H₂ O werd geïnjecteerd om de polymerisatie te starten. Ten tweede werd de PNIPAM-schaal gelaagd op de PS-co-PNIPAM-kern. Voor dit doel werd aan de reactor een waterige oplossing van monomeer NIPAM (1,8 g) en crosslinker N toegevoegd. ,N ′-methyleenbisacrylamide (BIS) (0,18  g) in 4  ml H₂ O met behulp van een spuit. De reactie werd 4 uur bij 70°C voortgezet. Het mengsel werd afgekoeld tot kamertemperatuur en gedurende 74 uur gedialyseerd met behulp van cellulosemembraan met MWCO 3500 Da. Als resultaat werd een suspensie van de PS-PNIPAM-nanodeeltjes gefabriceerd; een kern-schilstructuur van de nanodeeltjes wordt duidelijk onthuld door de transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) -beelden (figuur 3a). Om NIR-SWIR fluorescerende PNP's te verkrijgen, 2-butyl-6-[5-(2-butyl-1,3-dimethylcyclo-hepta[c]pyrrol-6(2H)-ylideen)penta-1,3-dien -1-yl]-1,3-dimethylcyclohepta[c]pyrroliumtetra-fluoroboraat (gelabeld als JB9-08) fluorescerende kleurstof [46] werd achteraf geladen [47] naar PS-PNIPAM-nanodeeltjes. Acht microliter 1 mM JB9-08 kleurstofoplossing in DMF werd toegevoegd aan 2 ml 0,25 wt% PNPs watersuspensie en 24 u bewaard voor gebruik.

Synthese van Core-Shell RENP's

RENP's werden gesynthetiseerd volgens het gewijzigde protocol dat elders is gerapporteerd [48]. Ten eerste, de α-NaYF₄ :10%Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ kern nanodeeltjes werden bereid via ontleding van het metaal trifluoracetaat bij hoge temperatuur. In een typische procedure, 0,05 mmol Yb₂ O₃ , 0,15 mmol Nd₂ O_3, en 0,25 mmol Y₂ O₃ werden geladen in een kolf van 250 ml die 5 ml gedeïoniseerd water en 5 ml TFA bevat en gedurende 1  uur tot 90 °C verwarmd om een ​​heldere oplossing op te leveren. De resulterende heldere oplossing werd verdampt bij deze temperatuur onder argonspoeling om modderig poedervormig RE(TFA)₃ te krijgen . Vervolgens werden 8 ml OA, 8 ml OM, 12 ml ODE en 2 mmol NaTFA aan de kolf toegevoegd. De oplossing werd verwarmd tot 120 °C en gedurende 30 min op die temperatuur gehouden, gevolgd door 30 min op te warmen tot 300 °C alvorens op natuurlijke wijze af te koelen tot kamertemperatuur. Tijdens het hele syntheseproces werd een argonomgeving toegepast. De resulterende nanodeeltjes werden geprecipiteerd door 20 mL ethanol toe te voegen aan de gekoelde reactiekolf. Na drie keer centrifugaal wassen met ethanol, werd het verzamelde witte poeder uiteindelijk gedispergeerd in 10  ml hexaan voor verder gebruik.

Ten tweede, de α-NaYF₄ :10%Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ @CaF₂ core-shell RENP's werden bereid via een zaadgemedieerd epitaxiaal groeiproces, waarbij gebruik werd gemaakt van α-NaYF₄ :10% Yb ³⁺ , x% Nd ³⁺ kern als het zaad en de overeenkomstige groei in de shell-precursoroplossing. Om de shell-precursor te bereiden, werd eerst 2 mmol CaO met 5 ml gedeïoniseerd water en 5 ml TFA toegevoegd aan een kolf van 250 ml en gedurende 1 uur verwarmd tot 90 °C om een ​​heldere oplossing te produceren. Deze oplossing werd vervolgens bij deze temperatuur ingedampt om de schaalvoorloper van calciumtrifluoracetaat (Ca(TFA)₂ te verkrijgen. ). Vervolgens 0,5 mmol NaYF₄ :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ kern nanodeeltjes, 7 ml OA en 7 ml ODE werden allemaal aan de kolf toegevoegd. De oplossing werd vervolgens gedurende 30 min. verwarmd tot 120°C, gevolgd door 60 min. opwarmen tot 300°C voordat het op natuurlijke wijze werd afgekoeld. Het hele proces werd uitgevoerd onder een argonomgeving. De resulterende core-shell nanodeeltjes werden geprecipiteerd door 20 mL ethanol toe te voegen aan de gekoelde reactiekolf. Na drie keer centrifugaal wassen met ethanol, werden de verzamelde kern-schil NP's uiteindelijk gedispergeerd in 10  ml hexaan voor verder gebruik. Voor de bereiding van de waterige dispersie wordt het bereide α-NaYF₄ :10%Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ @CaF₂ core-shell RENP's (5 mL hexaandispersie) werden eerst gemengd met 5 mL N ,N -Dimethylformamide (DMF) oplossing van nitrosoniumtetrafluoroboraat (NOBF₄ ) (0,1 M) bij kamertemperatuur. Het mengsel werd voorzichtig geschud tot een waarneming van RENP-precipitatie. Vervolgens werden tolueen en hexaan (1:1, volume) aan het mengsel toegevoegd, dat vervolgens 10 min werd gecentrifugeerd bij 10.000 tpm. Het precipitaat werd verzameld en gedispergeerd in 5  mL DMF. Ten tweede werd 250 mg poly(acrylzuur) (PAA, MW = 18.000) toegevoegd aan de 5 mL DMF-oplossing van NOBF₄ -behandelde RENP's, die werden verwarmd tot 80 ° C en gedurende 30 minuten onder krachtig roeren op deze temperatuur gehouden. Daarna werden de NP's geprecipiteerd door aceton toe te voegen, gewassen met ethanol en uiteindelijk gedispergeerd in gedestilleerd water.

Transmissie-elektronenmicroscopie

De morfologieën van PNP's en RENP's werden beoordeeld met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Om te worden afgebeeld met TEM, werd 10  μL nanodeeltjessuspensie op de koolstofdragerfilms gedruppeld die met formvar waren gestabiliseerd. Om de kern-schilstructuur van PNP's te visualiseren, werden ze negatief gekleurd met 1% waterige oplossing van fosfowolfraamzuur voordat ze op de dragerfilms vielen. De koolstofdragerfilms werden aan de lucht gedroogd en gewassen met 5 L zuiver water. De beelden zijn verkregen door te werken bij een versnellingsspanning van 100 kV op TEM (JEM-1230, JEOL).

Fotoluminescentiespectroscopie

PL-spectra voor beide soorten nanodeeltjes werden gemeten in NIR- en SWIR-bereiken met behulp van een Fluorolog-3-spectrofluorometer uitgerust met iHR320-spectrometer voor NIR-SWIR-bereik (Horiba); een vezelgekoppelde laserdiode die emitteert bij 808 nm (QSP-808-4, QPhotonics) werd gebruikt om PL van PNP's en RENP's te exciteren.

Hyperspectraal beeldvormingssysteem

Zelfgebouwd SWIR HSI-systeem maakt gebruik van band-sequentiële acquisitiemethode (Fig. 2) en omvat NIR-camera (Xeva-1.7-320, Xenics, België), focusoptiek (TEC-M55MPW, Computar, VS) en afstembaar vloeibaar kristalfilter (Varispec LNIR 20-HC-20, PerkinElmer, VS) als dispersief element. Het systeem heeft een resolutie van 340 × 258 pixels en werkt in een spectraalbereik van 900-1700 nm. Verlichtingsbronnen in het systeem zijn onder meer een gloeilamp (voor beelduitlijning, scherpstelling en helderveldbeeldvorming) en 808 nm vezelgekoppelde laserdiode (QSP-808-4, QPhotonics, VS), aangedreven door een laserstroombron (Laser Source 4308 , Arroyo Instruments, VS), voor PL-excitatie in PL-beeldvorming. De acquisitie van spectrale gegevenskubussen werd uitgevoerd door sequentiële afstemming van LCTF-transmissie van 20 nm spectrale breedte in het bereik van 900 tot 1200 nm met een stap van 10 nm en het vastleggen van overeenkomstige afbeeldingen. De belichtingstijd van de NIR-camera tijdens HSI-acquisitie was ingesteld op 200 ms. Laservermogensdichtheid op het monster was vastgesteld op ~ 100 mW/cm ² . Voor acquisitie van PL-beelden in het hele NIR-SWIR-bereik werd LCTF vervangen door een 850 nm lang doorlaatfilter (Edmund Optics, VS).

Schematisch diagram van het NIR-SWIR hyperspectrale beeldvormingssysteem

Spectral Unmixing-software

Voor analyse van de verkregen spectrale datakubus hebben we een spectrale ontmengingsalgoritme ontwikkeld met behulp van de MATLAB-omgeving. Het spectrum van elke pixel wordt beschouwd als een lineair mengsel van bekende eindelementen:\( F\left(\lambda \right)=\sum \limits_i{a}_i{G}_i\left(\lambda \right) \), waar F (λ )—pixelspectrum, G _ik — endmembers spectra, en a _ik zijn overvloed aan eindleden. Het doel van de ontmengingssoftware is om de abundanties van bekende eindleden te schatten door het oplossen van het lineaire spectrale mengselanalyse (LSMA) probleem in elke pixel van de verworven spectrale gegevenskubus. Stel, L is het aantal spectrale banden, en p is het aantal eindleden dat in een mengsel aanwezig is. Dan kan het LSMA-probleem worden uitgedrukt als F = Ga + n , waar F is L × 1 vector van pixelintensiteiten, G is L × p matrix die alle vectoren van eindleden bevat, a is p × 1 vector van onbekende abundanties, en n is L × 1 foutvector. Een op de kleinste kwadratenfout (LSE) gebaseerde methode om het LSMA-probleem op te lossen, kan worden gevormd als de volgende optimalisatietaak:min_a {(F − Ga ) ^T (F − Ga )}, en de klassieke oplossing is a (r ) = (G ^T G ) ⁻¹ G ^T F . Een dergelijke oplossing kan echter negatieve waarden bevatten voor abundanties, die geen fysieke betekenis hebben. Om dit obstakel op te lossen, moet de LSE-optimalisatietaak worden gewijzigd:min_a {(F − Ga ) ^T (F − Ga )}, onderhevig aan een Om deze taak op te lossen, gebruiken we een iteratief algoritme, gebaseerd op niet-negativiteit-beperkte lineaire spectrale mengselanalyse (NC-LSMA) die in detail wordt beschreven in [49, 50]. Na berekening van de abundanties voor elk onderdeel, worden ze in kaart gebracht als 2D-kleurenkaartgrafieken. Ten slotte levert het ontmengen van software intensiteitsbeelden op van de corresponderende componenten, gebaseerd op verkregen abundanties:\( {I}_i\left(x,y\right)={a}_i\left(x,y\right)\sum \limits_ {\lambda }{G}_i\left(\lambda \right) \), waarbij I _ik (x , j )—integrale intensiteit van i -de eindlid in pixel, en a _ik (x , j )—ik -de overvloed.

Dierexperimenten

De naakte BALB/c-muizen (Bron:The Jackson Laboratory, VS) werden onder donkere en aseptische omstandigheden gefokt in een faciliteit voor kleine dieren. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de criteria van de nationale verordening van China voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Voorafgaand aan de beeldvorming werden mannelijke naakte muizen (6  weken oud, 20 ± 2 g) verdoofd met 5% chloraalhydraat (0,06 ml per gram muisgewicht) door middel van intraperitoneale injectie. Voor SWIR PL-beeldvorming in vivo werden nanodeeltjes gesuspendeerd in 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 100  μL van elke PBS-suspensie van PNP's, RENP's of hun mengsel werd subcutaan in de muizen geïnjecteerd.

Resultaten en discussie

Er werden twee soorten SWIR-fotoluminescente NP's voorbereid voor gebruik in HSI:(1) PNP's die achteraf zijn geladen met JB9-08-kleurstof, die vrijwel niet-fluorescerend is in waterige oplossingen [46] maar, zoals door ons [51] wordt aangetoond, herstelt zijn fluorescentie in water door post-loading in polymere matrix van PNP's (Fig. 3a en b) en (2) PAA-gecoat NaYF₄ :10%Yb ³⁺ ,30%Nd ³⁺ @CaF₂ core-shell zeldzame-aarde ion-gedoteerde nanodeeltjes (RENP's, Fig. 3c en d). Nd ³⁺ ionen in de kern van RENP's kunnen worden aangeslagen met ~ 808 nm licht ( ⁴ Ik_9/2 →  ⁴ F_5/2 transitie) en energie overbrengen naar Yb ³⁺ ionen, die uitzenden in een bereik van 950–1100 nm met een piek bij ~ 975 nm ( ² F_5/2 →  ² F_7/2 overgang). RENPs-kern was gecoat met inert CaF₂ shell om niet-stralingsverliezen door oppervlaktedefecten en interactie met de omgeving te verminderen [48]. Beide nanoformuleringen vertonen fotoluminescentie in het bereik van 900-1200 onder 808 nm-excitatie (Fig. 3e).

Karakterisering van PNP's en RENP's. TEM-afbeelding (a ) en schematische structuur (b ) van PNP's geladen met JB9-08-kleurstof. TEM-afbeelding (c ) en schematische structuur (d ) van RENP's. e Genormaliseerde PL-emissiespectra van PNPs-JB9-08 en RENPs-suspensies onder 808 nm-excitatie. Schaalbalken, 100 nm

Opgemerkt moet worden dat PL-emissiespectra van de nanodeeltjes verkregen met spectrofluorometer om twee redenen niet kunnen worden gebruikt als eindleden in spectrale ontmengingssoftware. Ten eerste is de gevoeligheid van het HSI-systeem niet spectraal gecorrigeerd, in tegenstelling tot conventionele spectrofluorometers, dus het verkregen spectrale emissieprofiel is verschillend voor twee acquisitiemethoden. Ten tweede worden HSI-frames verzameld met een stap van 10 nm, hoewel de spectrale bandbreedte van LCTF 20 nm is. Dat resulteert in een overlap van het signaal in aangrenzende frames, waardoor het verkregen spectrale profiel wordt vervormd in vergelijking met dat gemeten met een spectrofluorometer. Om deze obstakels te overwinnen, werden eindleden (spectrale profielen van PNP's en RENP's-monsters) verkregen met het HSI-systeem. Met dit doel werden beide soorten nanosondes gesuspendeerd in PBS en werden hun PBS-suspensies in microcentrifugebuizen geplaatst (figuur 4a). Het is nauwelijks mogelijk om twee monsters te differentiëren met conventionele PL-beeldvorming, omdat hun PL-emissiespectra elkaar overlappen (figuren 4b en 3e). Met behulp van het HSI-systeem werden 31 PL-beelden verzameld in een spectraal bereik van 900 tot 1200 nm met een stap van 10 nm (Fig. 4c). Spectrale profielen van PNP's, RENP's en achtergrond (BG) werden berekend door middel van de spectrale dimensie van de spectrale gegevenskubus door het middelen van het signaal in gebieden die zijn gemarkeerd door rode, blauwe en groene vierkanten, dienovereenkomstig (Fig. 4b). De verkregen spectrale profielen voor PNP's en RENP's (Fig. 4d) bleken vergelijkbaar te zijn met die gemeten met spectrofluorometer en werden later gebruikt als eindleden voor de spectrale ontmenging. Daarna worden, met PNP's, RENP's en BG-spectrale profielen als eindleden, overeenkomstige componentabundanties berekend en in kaart gebracht als 2D-kleurenkaartplots (Fig. 4e). Abundanties werden berekend voor elke ruimtelijke pixel van de hypercube en werden weergegeven als een waarde van 0 tot 1, waarbij 0 en 1 respectievelijk de volledige afwezigheid en volledige abundantie van de component aangeven. De som van de hoeveelheden van alle componenten in elke pixel is gelijk aan 1. Opgemerkt moet worden dat ontmengingssoftware drempelwaarde op basis van de intensiteit van het signaal gebruikte om fouten veroorzaakt door pixels met lage intensiteit te elimineren. Als de maximale intensiteit van een pixel langs de spectrale dimensie minder was dan 5% van het maximum van de hele hyperkubus, werd een dergelijke pixel beschouwd als volledig overvloedig met een ruiscomponent. Verder werden integrale intensiteitsbeelden van PNP's en RENP's berekend, rekening houdend met overeenkomstige abundanties en het elimineren van achtergrondcomponent (figuur 4f). Zoals verwacht, tonen zowel het in kaart brengen van de overvloed als de integrale intensiteitsbeelden de volledige overvloed aan PNP's in de rechterbuis en RENP's in de linkerbuis, met een kleine fout veroorzaakt door de PL-emissieverstrooiing en imperfectie van het ontmengingsalgoritme.

HSI van microcentrifugebuizen die RENP's en PNP's bevatten. een Helderveldbeeld van microcentrifugebuizen met PNP's en RENP's gesuspendeerd in PBS. b PL-beeld van PNP's en RENPs-monsters die zijn geëxciteerd met 808 nm (850 nm lang doorlaatfilter werd gebruikt voor beeldacquisitie). c Schema ter illustratie van hypercube samengesteld uit HSI-frames. d Spectrale profielen van PNP's, RENP's en achtergrond (BG) gemiddeld van ROI weergegeven in b als rode, blauwe en groene vierkanten, dienovereenkomstig. e Kleurenkaarten van de overvloed aan componenten. v Gereconstrueerde intensiteitsbeelden van de PL-componenten en PL/bright field samengevoegde afbeelding

Spectrale ontmenging is ook in staat om het mengsel van PNP's, RENP's, te onderscheiden. Om dit aan te tonen, werden drie microcentrifugebuizen gevuld met oplossingen van PNP's, RENP's en hun mengsel. Na acquisitie van hypercube en spectrale ontmengingsprocedure, geeft het in kaart brengen van de overvloed de volledige aanwezigheid van PNP's in de eerste microcentrifugebuis, RENP's in de tweede en een mengsel van de twee in de derde aan (figuur 5a). Reconstructie van intensiteitsbeelden werd verder uitgevoerd om de intensiteitsverdeling van de PNP's en RENP's PL-signalen in het monster te onthullen (Fig. 5b).

HSI van microcentrifugebuizen met (van links naar rechts) RENP's, PNP's en een mengsel van beide. een Overvloed aan PNP's, RENP's en achtergrond (BG). b Gereconstrueerde PL-intensiteitsbeelden en PL/bright field samengevoegd beeld

We hebben verder de toepasbaarheid aangetoond van onze HIS-methode om de spectraal overlappende nanosondes in SWIR PL-beeldvorming in vivo te multiplexen. Naaktmuis werd verdoofd en subcutaan geïnjecteerd met PNP's, RENP's en een mengsel van beide. NIR-beeldvorming met een 850 nm lang doorlaatfilter toont drie niet te onderscheiden fotoluminescente vlekken (figuur 6a). Na het uitvoeren van HSI en analyse, toont het in kaart brengen van abundanties volledige abundanties van PNP's en RENP's op respectievelijk de bovenste en onderste injectieplaatsen, terwijl een mengsel van twee werd geïdentificeerd op de linker injectieplaats (Fig. 6b). Om de PL-intensiteitsverdeling te verkrijgen, werd bovendien intensiteitsreconstructie uitgevoerd (figuur 6c). Door de drempelwaarde in de unmixing-software aan te passen tot 15% (empirisch geschat), werd het mogelijk om ruis te verwijderen in gebieden grenzend aan emissieplekken (Fig. 6d). Dergelijke resultaten geven aan dat, in tegenstelling tot de conventionele PL-beeldvormingsmodaliteit, die lange of banddoorlaat optische filters gebruikt, HSI niet alleen in staat is om de intensiteitsverdeling in het monster in kaart te brengen, maar ook de componenten in het mengsel kan multiplexen door het spectrale profiel van intensiteit in elke pixel van de afbeelding.

HSI van muis subcutaan geïnjecteerd met PNP's (rechtsboven injectieplaats), RENP's (rechtsonder) en RENP's/PNP's mengsel (links). een Helderveld (SWIR), SWIR PL en samengevoegde beelden verkregen met een 850 nm lange doorlaatemissiefilter. b Overvloed aan PNP's, RENP's en achtergrond (BG). c Overeenkomstige gereconstrueerde intensiteitsbeelden. d PL-intensiteitsbeelden gereconstrueerd uit abundanties met een drempelniveau van 15% en PL/bright field samengevoegd beeld.

Dus de combinatie van HSI-acquisitie en spectrale ontmengingsverwerking werd in dit werk toegepast om een ​​multiplex-beeldvorming van de spectraal overlappende SWIR PL-nanosondes te verkrijgen. Met betrekking tot de toepasbaarheid van de HSI-modaliteit moeten echter enkele zaken in overweging worden genomen. First, due to the spectrally narrow acquisition, every HSI frame deals with relatively low signal intensity (especially in the case of the spectrally broad PL emission form the organic moieties). In addition, an increase in the PL exciting laser power in biological imaging is limited by danger of tissue damage (or phototoxicity). This results in higher requirements for the brightness of the PL probes and their photostability, as HSI can require order of magnitude longer acquisition time in comparison with conventional PL imaging. It should also be noted that the linear mixture analysis and spectral unmixing algorithm can work satisfactorily for multiplexed PL imaging of biological tissues in the spectral range where tissue transmittance does not change much. In contrast, if tissue transmittance has distinctive features in the spectral range of HSI, linear spectral mixture model may be hardly applicable (especially in case of deeper tissues) and nonlinear models can be considered.

Conclusies

In conclusion, we developed a hyperspectral SWIR bioimaging technique and applied it for multiplexing of nanoparticles emitting in SWIR spectral range. Two types of nanoparticles with overlapping PL spectra, which are undistinguishable in conventional imaging, were successfully multiplexed by their PL spectral profiles using hyperspectral acquisition along with the linear spectral mixture analysis algorithm. The developed method was successfully employed for multiplexed imaging of SWIR PL nanoparticles both in sample suspensions and injected in small animals. With SWIR bioimaging having superior resolution at higher imaging depth, SWIR HSI approach holds a great potential for use in various applications requiring multiplexed imaging with NIR-SWIR PL nanoprobes. Furthermore, as SWIR bioimaging is at a very early stage, there is plenty of room for the development of biomedical applications of PL probes in a combination with HSI.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Alle gegevens die tijdens dit onderzoek zijn gegenereerd of geanalyseerd, zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel.

Afkortingen

BG:

Background

HSI:

Hyperspectral imaging

LCTF:

Liquid crystal tunable filter

NIR:

Nabij-infrarood

NP's:

Nanodeeltjes

PL:

Fotoluminescentie

PNIPAM:

Poly-N -isopropylacrylamide

PNPs:

Polymeric nanoparticles

PS:

Polystyreen

RENPs:

Rare-earth doped fluoride nanoparticles

SWIR:

Short-wave infrared

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscopie