Geavanceerde hyperspectrale imaging voor gemultiplekste detectie van kortgolf-infrarood nanoprobes in biologische systemen

Samenvatting

Optische bio-imaging met exogene luminoforen die emitteren in het kortgolf-infrarood spectrale gebied (SWIR, ~1000–1700 nm) is een snel ontwikkelend veld, en de ontwikkeling van meerdere SWIR-fotoluminescente nanoprobes is onlangs gerapporteerd. In dit kader is hyperspectrale imaging (HSI), gecombineerd met ontmengingsalgoritmen, een veelbelovend instrument dat efficiënte multiplexing van SWIR-emitterende nano-agenten mogelijk maakt op basis van hun fotoluminescentie (FL) spectrale profielen. De hier gerapporteerde SWIR HSI-techniek is ontwikkeld om twee typen nanoprobes te multiplexen: polymere nanopartikels gedopt met organische kleurstof (PNPs) en zeldzame-aard-element gedopte fluoridenanopartikels (RENPs). Beide typen nanoprobes vertonen FL in hetzelfde spectrale bereik (~900–1200 nm), wat spectrale scheiding met optische filters bemoeilijkt en de mogelijkheden voor hun gemultiplekste imaging in biologische weefsels beperkt. Door SWIR HSI toe te passen, werden verschillen in de FL spectrale profielen benut om spectraal selectieve en gevoelige imaging van het FL signaal van elk type nanopartikels te bereiken. Ontmenging van de verkregen data maakte multiplexing van de spectraal overlappende nanoprobes mogelijk op basis van hun FL profiel. Zowel kwantitatieve als ruimtelijke distributie voor elk type nanopartikels werden verkregen uit hun gemengde suspensies. Tenslotte werd de SWIR HSI-techniek met ontmengingsprotocol toegepast op in vivo imaging van muizen die subcutaan geïnjecteerd waren met PNPs en RENPs. De toepasbaarheid van hyperspectrale technieken om nanoprobes in in vivo imaging te multiplexen, werd met succes gedemonstreerd.

Inleiding

Biomedische imagingtechnologieën hebben in de afgelopen decennia een snelle ontwikkeling doorgemaakt, wat vroege detectie en beoordeling van diverse ziekten en pathologieën mogelijk maakt. Onder de verschillende imagingmodaliteiten inneemt optische imaging een unieke positie in vanwege zijn hoge ruimtelijke en temporele resolutie en relatief lage kosten. Meerdere optische imagingbenaderingen gebaseerd op fotoluminescentie (of meer specifiek, fluorescentie) zijn in ontwikkeling en worden klinisch vertaald. Bijvoorbeeld, lymfeystelsel-imaging en peroperatieve fluorescentie-gegeleide chirurgie hebben veelbelovende resultaten getoond om de gezondheidszorg te verbeteren [1, 2]. Aan de andere kant worden exogene fotoluminescente probes die specifieke interessegebieden (bijv. tumoren) targeten, actief ontwikkeld voor in vivo en ex vivo imaging. Naast de gebruikelijke eisen aan FL-probes (hoge absorbantie, emissie quantum yield, en fotostabiliteit), zijn ook de spectrale positie en vorm van de FL-emissie cruciale parameters. Aangezien de verzwakking van licht door biologische weefsels lager is in het nabij-infrarood (NIR) spectrale bereik (~700–950 nm) dan in het zichtbare bereik, is het bestaan van een NIR-transparantievenster voor biologische weefsels (~700–950 nm) geïntroduceerd en wordt veel onderzoek gewijd aan de ontwikkeling en toepassing van NIR-emitterende probes [3,4,5,6]. Bovendien hebben recente vooruitgang geleid tot de introductie van het tweede en derde NIR-venster (NIR-II en NIR-III) in het spectrale bereik van ~1000–1700 nm, wat vaak wordt aangeduid als kortgolf-infrarood (SWIR), met name door fabricanten in het snel ontwikkelende veld van infrarood imaging [7,8,9]. Ondanks hogere waterabsorptie in het SWIR-bereik in vergelijking met het conventionele NIR-venster, laten lagere autofluorescentie en verstrooiing van biologische weefsels superieure imagingresolutie en grotere imagingdiepte in SWIR FL bio-imaging toe [10,11,12]. Bijvoorbeeld, bij SWIR FL imaging van lymfatische en hersen vasculatuur, met het nieuwe SWIR fluorescente kleurstof CH1055-PEG, bleken resolutie en signaal-ruisverhouding superieur ten opzichte van conventionele NIR FL imaging met het NIR-I fluorescente kleurstof, indocyaan groen [13]. Bovendien maakte het gebruik van SWIR-emitterende nanoprobes (eenzijdige koolstofnanobuizen) en een SWIR imaging camera door Dai's groep het visualiseren van sub-10 μm vaten op een diepte van >2 mm mogelijk bij non-invasieve (zonder craniotomie) imaging van de cerebrovasculatuur van muizen, wat onbereikbaar is voor FL imaging in het zichtbare of NIR-I bereik [8].

Organische kleurstoffen en kleurstofcomplexen met intense absorptie in het eerste NIR-venster en fluorescentie in het NIR-II venster kunnen veelbelovende NIR-SWIR probes zijn; ze bleken te dienen als uitzonderlijke contrastmiddelen voor vasculatuur en lymfeknoop imaging, tumor demarcatie, en beeld-gegeleide chirurgie [13,14,15,16]. Het is opmerkelijk dat het organische kleurstof indocyaan groen (ICG) het enige NIR fluorescentie contrastmiddel is dat momenteel goedgekeurd is door de Amerikaanse Food and Drugs Administration voor gebruik in mensen [17]. Tegelijkertijd hebben moleculaire imaging probes (d.w.z. kleurstoffen of kleurstofcomplexen) beperkingen geassocieerd met de noodzaak om hun moleculaire structuur te wijzigen om hun bioprobe eigenschappen te veranderen (bijv. wateroplosbaarheid, celpermeabiliteit, etc.) of ze te voorzien van andere imaging of targeteringsmodaliteiten. In tegenstelling daarmee kunnen nanopartikels (NPs) die FL centra omvatten, hun oppervlak covalente modificeren met verschillende groepen voor verbeterde waterdispersie en stabiliteit, gecontroleerd oppervlaklading, of targeteringsdoeleinden. Daarnaast stelt de introductie van NIR-SWIR FL nanoplatformen combinatie van FL imaging met andere imaging, diagnostische, of therapeutische modaliteiten toe. Recente studies rapporteren diepe weefsel, heel lichaam, tumor, of transcraniële imaging met SWIR-emitterende nanoformuleringen gebruikt voor monitoring van diverse processen in vivo [14, 18,19,20,21]. Onder de diverse gerapporteerde NIR-SWIR-emitterende nanoprobes voor in vivo imaging, kunnen twee typen worden onderscheiden: met NIR-SWIR fluorescentie afkomstig van organische moieties (bijv. geconjugeerd polymere) of keramische (bijv. fluoriden) nanokristallen gedopt met zeldzame-aard-ionen. Polymere-gebaseerde nanopartikels (PNPs) zijn onder de meest succesvolle nanogeneesmiddelen in klinische vertalingen, vanwege de relatieve gemak in synthetische en chemische functionalisatie, alsook superieure biocompatibiliteit en biologisch afbreekbaarheid [22]. Wanneer geladen met NIR-SWIR fluoroforen, kunnen PNPs veelbelovende imaging probes of beeld-gegeleide medicijnleveringsvoertuigen dienen [23, 24]. Aan de andere kant zijn zeldzame-aard-ion gedopte nanopartikels (RENPs) een bekende klasse nanoprobes, die unieke fotoluminescentie eigenschappen bezitten die toegankelijk zijn via zowel upconversie (anti-Stokes verschuiving) als down-conversie (Stokes verschuiving) processen [25,26,27,28,29,30]. Recent zijn RENPs vertaald voor gebruik in NIR-SWIR imaging. In tegenstelling tot organische moieties gebaseerde NIR-SWIR probes, bezitten ze hoge quantum yield, uitzonderlijke fotostabiliteit, en smalle emissiebanden in het hele NIR-SWIR spectrale gebied, wat afgestemd kan worden door doping met diverse ionen [20, 31, 32]. RENPs werden toegepast voor kleine dier vasculatuur en organen imaging, tumor detectie, gemultiplekste, en multispectrale imaging [3, 19, 20, 33,34,35].

Met de opkomende ontwikkeling van FL bio-imaging, kan de mogelijkheid om gelijktijdig meerdere FL moieties in vivo te volgen, vereist zijn voor verschillende doeleinden (bijv. getargete imaging van geselecteerde cellen of organen samen met beeld-gegeleide medicijnlevering). Om deze uitdaging aan te gaan, zijn gemultiplekste imaging methoden ontwikkeld. Gemultiplekste imaging verwijst naar de complementariteit van anatomische en functionele informatie in het geïmageerde biologische systeem; de toepassing ervan kan combinatie van imaging biomarkers, contrasten, en modaliteiten toestaan om de nut van imaging in onderzoek en klinische toepassingen te vergroten [36]. Gemultiplekste FL imaging kan de theranostische dimensie van nanogeneeskunde verbeteren, door de mogelijkheid te bieden om meerdere FL imaging contrasten samen met therapeutische modaliteit te introduceren. Meest gebruikte gemultiplekste imaging methoden onderscheiden FL probes op basis van de spectrale positie van hun FL emissie, met behulp van geschikte optische filters [37,38,39]. Echter, correct multiplexen in zo'n benadering vereist gebruik van nanoprobes met spectraal smalle, niet-overlappende FL spectra. In dit opzicht is hyperspectrale imaging (HSI) gecombineerd met spectrale mengsel analyse algoritmen een veelbelovend instrument voor FL multiplexing. Echter, biomedische toepassingen van FL HSI zijn meestal beperkt tot fluorescentiemicroscopie, voor multiplexing van verschillende typen nanoprobes en elimineren van achtergrond en autofluorescentie [40, 41]. Wat in vivo HSI betreft, wordt het meest frequenter gebruikt in reflectie-imaging modus door acquisitie en sequentiële analyse van de weefsel reflectie spectren [42], hoewel HSI imaging in vivo (ook wel multispectrale imaging genoemd) ook gerapporteerd is voor FL in zichtbare en NIR bereiken [3, 5]. Echter, geen rapporten over HSI van SWIR-emitterende nanoprobes konden in de literatuur worden gevonden.

Onlangs hebben we de ontwikkeling van een band-sequentiële HSI systeem gecombineerd met spectrale ontmenging software voor SWIR FL imaging gerapporteerd [43]. De band-sequentiële HSI procedure was gebaseerd op opeenvolgende acquisitie van 2D beelden door een element met spectraal variabele transmissie (d.w.z. vloeistofkristal afstembaar filter, LCTF). De SWIR FL data verkregen van RENPs suspensies werden gepresenteerd als driedimensionale spectrale data kubus (hyperkubus) bestaande uit twee ruimtelijke en één spectrale dimensie. Verdere toepassing van spectrale ontmengingsprocedure op elke ruimtelijke pixel van de verkregen hyperkubus maakte berekening van abundanties in een FL mengsel component mogelijk. Hier passen we HSI toe om multiplexing van nanoprobes voor in vivo SWIR FL bio-imaging aan te pakken. We gebruikten twee typen SWIR-emitterende nanopartikels met emissies die spectraal overlappen en niet eenvoudig te onderscheiden zijn in conventionele FL imaging met optische filters, ondanks hun verschillende spectrale profiel. Figuur 1 illustreert het probleem van het spectrale mengsel van FL van deze nanopartikels en de manier om het te overwinnen met band-sequentiële ontmenging met HSI.

Schema illustrerende toepassing van HSI voor multiplexing van fotoluminescente nanoprobes

De HSI werd toegepast om spectraal selectieve en gevoelige FL imaging voor beide typen nanopartikels te verkrijgen. Om de SWIR FL spectrale profielen te ontmengen, werd een ontmengingsprotocol ontwikkeld, wat ons toeliet om kwantitatieve en ruimtelijke kaartvorming van componenten in het mengsel te verkrijgen, met bepaling van intensiteitsdistributies naast abundanties. De SWIR HSI technieken en het ontwikkelde ontmengingsprotocol werden verder toegepast op in vivo imaging van muizen subcutaan geïnjecteerd met nanopartikels om de toepasbaarheid van HSI te demonstreren voor multiplexing van SWIR FL nanoprobes in in vivo imaging.

Methoden

Nanoformulatie Bereiding en Karakterisering

Synthese van Polymere Kern-Schil Nanopartikels Geladen met Organisch Fluorescent NIR-SWIR Kleurstof

Polystyreen (PS)-poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAM) kern-schil nanopartikels werden gesynthetiseerd door microemulsie polymerisatie, met modificatie van de eerder beschreven methode [44, 45]. Eerst werden PS-co-PNIPAM (10 gew.% PNIPAM) kern nanopartikels bereid als volgt. NIPAM (0,1 g), natrium dodecyl sulfaat SDS (0,1 g), en 0,005 g NaH₂PO₄ × H₂O werden opgelost in 45 ml H₂O. Styreen (1 g) werd druppelgewijs toegevoegd bij vigoreus roeren toen de temperatuur werd verhoogd tot 60 °C. Als volgende stap werd Ar 30 min door het mengsel gebubbeld, de temperatuur werd verhoogd tot 70 °C, en 0,08 g K₂S₂O₈ opgelost in 1 ml H₂O geïnjecteerd om de polymerisatie te initiëren. Ten tweede werd PNIPAM schil gelaagd op de PS-co-PNIPAM kern. Hiervoor werd aan de reactor waterige oplossing van monomeer NIPAM (1,8 g) en vernetter N,N′-methylenebisacrylamide (BIS) (0,18 g) in 4 ml H₂O toegevoegd met een spuit. De reactie werd 4 uur bij 70 °C voortgezet. Het mengsel werd afgekoeld tot kamertemperatuur en 74 uur gedialyseerd met cellulase membraan met MWCO 3500 Da. Als resultaat werd suspensie van de PS-PNIPAM nanopartikels geproduceerd; een kern-schil structuur van de nanopartikels wordt duidelijk onthuld door transmissie elektronen microscopie (TEM) beelden (Fig. 3a). Om NIR-SWIR fluorescente PNPs te verkrijgen, werd 2-butyl-6-[5-(2-butyl-1,3-dimethylcyclo-hepta[c]pyrrol-6(2H)-ylidene)penta-1,3-dien-1-yl]-1,3-dimethylcyclohepta[c]pyrrolium tetra-fluoroboraat (gelabeld als JB9-08) fluorescente kleurstof [46] post-geladen [47] in PS-PNIPAM nanopartikels. Acht microliter van 1 mM JB9-08 kleurstof oplossing in DMF werd toegevoegd aan 2 mL van 0,25 gew.% PNPs water suspensie en 24 uur bewaard voor gebruik.

Synthese van Kern-Schil RENPs

RENPs werden gesynthetiseerd volgens het gemodificeerde protocol elders gerapporteerd [48]. Eerst werden de α-NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30% Nd³⁺ kern nanopartikels bereid via decompositie van het metaal trifluoroacetaat bij hoge temperatuur. In een typische procedure, werden 0,05 mmol Yb₂O₃, 0,15 mmol Nd₂O₃, en 0,25 mmol Y₂O₃ geladen in een 250 ml kolba met 5 ml gedemineraliseerd water en 5 ml TFA en 1 uur bij 90 °C verhit om een heldere oplossing te geven. De resulterende heldere oplossing werd bij deze temperatuur onder argon stroom verdampt om modderig poederachtig RE(TFA)₃ te krijgen. Vervolgens werden 8 ml OA, 8 ml OM, 12 ml ODE, en 2 mmol NaTFA aan de kolba toegevoegd. De oplossing werd verhit tot 120 °C en 30 min op die temperatuur gehouden, gevolgd door opwarmen tot 300 °C voor 30 min voor natuurlijke afkoeling tot kamertemperatuur. Een argon omgeving werd tijdens het gehele syntheseproces toegepast. De resulterende nanopartikels werden geprecipiteerd door 20 mL ethanol toe te voegen aan de afgekoelde reactiekolba. Na centrifugaal wassen met ethanol drie keer, werd het verzamelde witte poeder eindelijk gedispergeerd in 10 ml hexaan voor verder gebruik.

Ten tweede werden de α-NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30% Nd³⁺@CaF₂ kern-schil RENPs bereid via een zaad-gemediëerde epitaxiale groeiprocedure, met behulp van α-NaYF₄: 10% Yb³⁺, x% Nd³⁺ kern nanopartikels als zaad en de corresponderende groei in de schil precursor oplossing. Om de schil precursor te bereiden, werden eerst 2 mmol CaO met 5 ml gedemineraliseerd water en 5 ml TFA aan een 250-ml kolba toegevoegd en 1 uur bij 90 °C verhit om een heldere oplossing te produceren. Deze oplossing werd vervolgens bij deze temperatuur verdampt om de schil precursor van calcium trifluoroacetaat (Ca(TFA)₂) te geven. Vervolgens werden 0,5 mmol NaYF₄: 10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺ kern nanopartikels, 7 ml OA, en 7 ml ODE allemaal aan de kolba toegevoegd. De oplossing werd vervolgens verhit tot 120 °C voor 30 min, gevolgd door opwarmen tot 300 °C voor 60 min voor natuurlijke afkoeling. Het gehele proces werd onder een argon omgeving uitgevoerd. De resulterende kern-schil nanopartikels werden geprecipiteerd door 20 mL ethanol toe te voegen aan de afgekoelde reactiekolba. Na centrifugaal wassen met ethanol drie keer, werden de verzamelde kern-schil NPs eindelijk gedispergeerd in 10 ml hexaan voor verder gebruik. Voor bereiding van de waterige dispersie, werden de bereide α-NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30% Nd³⁺@CaF₂ kern-schil RENPs (5 ml hexaan dispersie) eerst gemengd met 5 ml N,N-Dimethylformamide (DMF) oplossing van nitrosonium tetra-fluoroboraat (NOBF₄) (0,1 M) bij kamertemperatuur. Een zacht schudden werd toegepast op het mengsel tot observatie van RENP precipitatie. Vervolgens werden tolueen en hexaan (1:1, volume) aan het mengsel toegevoegd, dat vervolgens 10 min gecentrifugeerd werd op 10000 toer/min. Het neerslag werd verzameld en gedispergeerd in 5 ml DMF. Ten tweede werden 250 mg poly(acrylzuur) (PAA, MG = 18.000) toegevoegd aan de 5 ml DMF oplossing van NOBF₄-behandelde RENPs, welke verhit werd tot 80 °C en 30 min op deze temperatuur gehouden onder vigoreus roeren. Daarna werden de NPs geprecipiteerd door acetoon toe te voegen, met ethanol gewassen, en eindelijk gedispergeerd in gedistilleerd water.

Transmissie Elektronen Microscopie

De morfologieën van PNPs en RENPs werden beoordeeld met transmissie elektronen microscopie (TEM). Om met TEM te imageren, werd 10 μL van nanopartikelsuspensie op de koolstof ondersteuningsfilms gestabiliseerd met formvar gedruppeld. Om de kern-schil structuur van PNPs te visualiseren, werden ze negatief gekleurd met 1% waterige oplossing van fosfowolframaat voor het druppelen op de ondersteuningsfilms. De koolstof ondersteuningsfilms werden op de lucht gedroogd en gewassen met 5 μL zuiver water. De beelden werden verkregen door te opereren bij een versnellingsspanning van 100 kV op TEM (JEM-1230, JEOL).

Fotoluminescentie Spectroscopie

FL spectra voor beide typen nanopartikels werden gemeten in NIR en SWIR bereiken met een Fluorolog-3 spectrofluorometer uitgerust met iHR320 spectrometer voor NIR-SWIR bereik (Horiba); een vezelgekoppelde laser diode emittend bij 808 nm (QSP-808-4, QPhotonics) werd gebruikt om FL van PNPs en RENPs te exciteren.

Hyperspectraal Imaging Systeem

Het zelfgebouwde SWIR HSI systeem benut band-sequentiële acquisitie methode (Fig. 2) en omvat NIR camera (Xeva-1.7-320, Xenics, België), focusoptiek (TEC-M55MPW, Computar, VS), en vloeistofkristal afstembaar filter (Varispec LNIR 20-HC-20, PerkinElmer, VS) als dispersief element. Het systeem heeft 340 × 258 pixel resolutie en werkt in 900–1700 nm spectrale bereik. Verlichtingsbronnen in het systeem omvatten gloeilamp (voor beelduitlijning, focussering, en helder veld imaging) en 808-nm vezelgekoppelde laser diode (QSP-808-4, QPhotonics, VS), aangedreven met laser stroomvoorziening (Laser Source 4308, Arroyo Instruments, VS), voor FL excitatie in FL imaging. Spectrale data kubus acquisitie werd uitgevoerd door sequentiële afstemming van LCTF transmissie van 20-nm spectrale breedte in het bereik van 900 tot 1200 nm met 10-nm stap en vastleggen van corresponderende beelden. Belichtingstijd van NIR camera tijdens HSI acquisitie was ingesteld op 200 ms. Laservermogen dichtheid op het monster was vastgezet op ~100 mW/cm². Voor acquisitie van FL beelden in heel NIR-SWIR bereik, werd LCTF vervangen door 850-nm-lang doorlaat filter (Edmund Optics, VS).

Schematisch diagram van het NIR-SWIR hyperspectrale imaging systeem

Spectrale Ontmengings Software

Voor analyse van verkregen spectrale data kubus, ontwikkelden we spectraal ontmengingsalgoritme met behulp van de MATLAB omgeving. Het spectrum van elke pixel wordt beschouwd als een lineaire mengsel van bekende eindleden: F(λ) = Σ a_i G_i(λ), waar F(λ)—pixel spectrum, G_i—eindleden spectra, en a_i abundanties van eindleden. Het doel van de ontmengingssoftware is om de abundanties van bekende eindleden te schatten door het lineaire spectrale mengsel analyse (LSMA) probleem op te lossen in elke pixel van de verkregen spectrale data kubus. Stel, L is aantal spectrale banden, en p is aantal eindleden aanwezig in een mengsel. Dan kan LSMA probleem worden gesteld als F = Ga + n, waar F is L × 1 vector van pixel intensiteiten, G is L × p matrix met alle eindleden vectoren, a is p × 1 vector van onbekende abundanties, en n is L × 1 foutvector. Kleinste kwadraten fout (LSE)-gebaseerde methode om LSMA probleem op te lossen kan worden gevormd als volgende optimalisatietaak: min_a{(F − Ga)^T(F − Ga)}, en de klassieke oplossing is a(r) = (G^TG)⁻¹G^TF. Echter, zo'n oplossing kan negatieve waarden voor abundanties bevatten, die geen fysieke betekenis hebben. Om dit obstakel op te lossen, moet LSE optimalisatietaak worden gemodificeerd: min_a{(F − Ga)^T(F − Ga)}, onder voorwaarde a ≥ 0. Om deze taak op te lossen, benutten we iteratief algoritme, gebaseerd op non-negativiteit geconstraineerde lineaire spectrale mengsel analyse (NC-LSMA) die in detail beschreven is in [49, 50]. Na berekening van abundanties voor elke component, worden ze als 2D kleurenkaart grafieken gemapt. Uiteindelijk levert ontmengingssoftware intensiteitsbeelden van de corresponderende componenten, gebaseerd op verkregen abundanties: I_i(x, y) = a_i(x, y) Σ_λ G_i(λ), waar I_i(x, y)—integrale intensiteit van i-de eindlid in pixel, en a_i(x, y)—i-de abundantie.

Dierproeven

BALB/c naakte muizen (Bron: The Jackson Laboratory, VS) werden gekweekt onder donkere en aseptische omstandigheden in een klein dierenfaciliteit. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de criteria van de Nationale Regeling van China voor Zorg en Gebruik van Laboratoriumdieren. Voor imaging, werden mannelijke naakte muizen (6 weken oud, 20 ± 2 g) geanesthetiseerd met 5% chlooraalhydraat (0,06 ml per gram muisgewicht) door intraperitoneale injectie. Voor SWIR FL imaging in vivo, werden nanopartikels opgelost in 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 100 μL van elke PBS suspensie van PNPs, RENPs, of hun mengsel subcutaan in de muizen geïnjecteerd.

Resultaten en Discussie

Twee typen SWIR-fotoluminescente NPs werden bereid voor gebruik in HSI: (1) PNPs post-geladen met JB9-08 kleurstof, die vrijwel niet-fluorescerend is in waterige oplossingen [46] maar, zoals door ons getoond [51], zijn fluorescentie in water herstelt door post-laden in polymere matrix van PNPs (Fig. 3a en b) en (2) PAA-gecoate NaYF₄:10%Yb³⁺,30%Nd³⁺@CaF₂ kern-schil zeldzame-aard-ion gedopte nanopartikels (RENPs, Fig. 3c en d). Nd³⁺ ionen in de kern van RENPs kunnen geëxciteerd worden met ~808 nm licht (⁴I_9/2 → ⁴F_5/2 overgang) en energie overdragen aan Yb³⁺ ionen, die emitteren in 950–1100 nm bereik met piek bij ~975 nm (²F_5/2 → ²F_7/2 overgang). RENPs kern was gecoateerd met inerte CaF₂ schil om niet-radiatieve verliezen door oppervlakte defecten en interactie met omringende omgeving te reduceren [48]. Beide nanoformuleringen vertonen fotoluminescentie in 900–1200 bereik onder 808 nm excitatie (Fig. 3e).

Karakterisering van PNPs en RENPs. TEM beeld (a) en schematische structuur (b) van PNPs geladen met JB9-08 kleurstof. TEM beeld (c) en schematische structuur (d) van RENPs. e Genormaliseerde FL emissie spectren van PNPs-JB9-08 en RENPs suspensies onder 808 nm excitatie. Schaalbalken, 100 nm

Het moet worden opgemerkt dat FL emissie spectren van de nanopartikels verkregen met spectrofluorometer niet gebruikt kunnen worden als eindleden in spectrale ontmengingssoftware vanwege twee redenen. Eerst, de gevoeligheid van HSI systeem is niet spectraal gecorrigeerd, in tegenstelling tot conventionele spectrofluorometer, dus de verkregen emissie spectrale profiel is verschillend voor de twee acquisitie methoden. Ten tweede, HSI frames worden verzameld met 10 nm stap, hoewel de spectrale bandbreedte van LCTF 20 nm is. Dat resulteert in signaaloverlapping in buren frames, wat vervorming van verkregen spectrale profiel veroorzaakt in vergelijking met de gemeten met spectrofluorometer. Om deze obstakels te overwinnen, werden eindleden (spectrale profielen van PNPs en RENPs monsters) verkregen met HSI systeem. Met dit doel, werden beide typen nanoprobes in PBS opgelost en hun PBS suspensies in microcentrifugetjes geplaatst (Fig. 4a). Het is nauwelijks mogelijk om twee monsters te differentiëren met conventionele FL imaging, aangezien hun FL emissie spectren overlappen (Figs. 4b en 3e). Met HSI systeem werden 31 FL beelden verzameld in een spectraal bereik van 900 tot 1200 nm met 10-nm stap (Fig. 4c). Spectrale profielen van PNPs, RENPs, en achtergrond (BG) werden berekend door de spectrale dimensie van de spectrale data kubus door gemiddelde signaal in gebieden gemarkeerd door rode, blauwe, en groene vierkanten, respectievelijk (Fig. 4b). De verkregen spectrale profielen voor PNPs en RENPs (Fig. 4d) bleken vergelijkbaar met die gemeten door spectrofluorometer en werden later gebruikt als eindleden voor de spectrale ontmenging. Daarna, met PNPs, RENPs, en BG spectrale profielen als eindleden, worden corresponderende component abundanties berekend en als 2D kleurenkaart plots gemapt (Fig. 4e). Abundanties werden berekend voor elke ruimtelijke pixel van de hyperkubus en voorgesteld als waarde van 0 tot 1, met 0 en 1 indicerende volledige afwezigheid en volledige abundantie van de component, respectievelijk. Som van abundanties van alle componenten in elke pixel is gelijk aan 1. Het moet worden opgemerkt dat ontmengingssoftware drempelwaarde gebruikt door intensiteit van het signaal om fouten veroorzaakt door lage-intensiteit pixels te elimineren. Als maximaal intensiteit van een pixel langs spectrale dimensie minder was dan 5% van het maximum van de gehele hyperkubus, werd zo'n pixel beschouwd als volledig abundant met ruiscomponent. Verder werden integrale intensiteitsbeelden van PNPs en RENPs berekend rekening houdend met corresponderende abundanties en achtergrondcomponent eliminerend (Fig. 4f). Zoals verwacht, tonen zowel abundantie mapping als integrale intensiteitsbeelden volledige abundantie van PNPs in rechter buisje en RENPs in linker buisje, met lichte fout veroorzaakt door FL emissie verstrooiing en onvolkomenheid van het ontmengingsalgoritme.

HSI van microcentrifugetjes bevattende RENPs en PNPs. a Helder veld beeld van microcentrifugetjes met PNPs en RENPs opgelost in PBS. b FL beeld van PNPs en RENPs monsters geëxciteerd met 808 nm (850-nm-lang doorlaat filter werd gebruikt voor beeldacquisitie). c Schema illustrerende hyperkubus samengesteld uit HSI frames. d Spectrale profielen van PNPs, RENPs, en achtergrond (BG) gemiddeld uit ROI getoond in b als rode, blauwe, en groene vierkanten, respectievelijk. e Kleurenkaarten van component abundanties. f Gereconstrueerde intensiteitsbeelden van de FL componenten en FL/helder veld samengevoegd beeld

Spectrale ontmenging kan ook het mengsel van PNPs, RENPs onderscheiden. Om dit te demonstreren, werden drie microcentrifugetjes gevuld met oplossingen van PNPs, RENPs, en hun mengsel. Na acquisitie van hyperkubus en spectrale ontmengingsprocedure, wijst abundantie mapping volledige aanwezigheid van PNPs in het eerste microcentrifugetje, RENPs in het tweede, en een mengsel van de twee in het derde aan (Fig. 5a). Reconstructie van intensiteitsbeelden werd verder uitgevoerd om intensiteitsdistributie van de PNPs en RENPs FL signalen in het monster te onthullen (Fig. 5b).

HSI van microcentrifugetjes bevattende (links naar rechts) RENPs, PNPs, en mengsel van beide. a Abundanties van PNPs, RENPs, en achtergrond (BG). b Gereconstrueerde FL intensiteitsbeelden en FL/helder veld samengevoegd beeld

We hebben verder de toepasbaarheid van onze HIS methode gedemonstreerd om de spectraal overlappende nanoprobes in SWIR FL imaging in vivo te multiplexen. Naakte muis werd geanesthetiseerd en subcutaan geïnjecteerd met PNPs, RENPs, en een mengsel van de twee. NIR imaging met 850-nm-lang doorlaat filter toont drie ononderscheidbare fotoluminescente vlekken (Fig. 6a). Na uitvoering van HSI en analyse, toont abundanties mapping volledige abundanties van PNPs en RENPs in de bovenste en onderste injectieplaatsen, respectievelijk, terwijl mengsel van twee geïdentificeerd werd in de linker injectieplaats (Fig. 6b). Daarnaast, om de FL intensiteitsdistributie te verkrijgen, werd intensiteitsreconstructie uitgevoerd (Fig. 6c). Door drempelwaarde in de ontmengingssoftware aan te passen naar 15% (empirisch geschat), werd het mogelijk om ruis in gebieden angrenzend aan emissievlekken te verwijderen (Fig. 6d). Dergelijke resultaten wijzen erop dat in tegenstelling tot de conventionele FL imaging modaliteit, die lange of banddoorlaat optische filters gebruikt, HSI niet alleen in staat is om intensiteitsdistributie in het monster te kartografieren, maar ook de componenten in het mengsel kan multiplexen door het spectrale profiel van intensiteit in elke pixel van het beeld te identificeren.

HSI van muis subcutaan geïnjecteerd met PNPs (bovenste rechter injectieplaats), RENPs (onderste rechter), en RENPs/PNPs mengsel (links). a Helder veld (SWIR), SWIR FL, en samengevoegde beelden verkregen met 850-nm-lang doorlaat emissiefilter. b Abundanties van PNPs, RENPs, en achtergrond (BG). c Corresponderende gereconstrueerde intensiteitsbeelden. d FL intensiteitsbeelden gereconstrueerd van abundanties met drempelniveau van 15% en FL/helder veld samengevoegd beeld.

Dus, de combinatie van HSI acquisitie en spectrale ontmengingsverwerking werd in dit werk toegepast om een gemultiplekste imaging van de spectraal overlappende SWIR FL nanoprobes te verkrijgen. Een paar kwesties moeten echter overwogen worden met betrekking tot de toepasbaarheid van HSI modaliteit. Eerst, door de spectraal smalle acquisitie, heeft elk HSI frame te maken met relatief lage signaalintensiteit (vooral in het geval van de spectraal brede FL emissie van de organische moieties). Daarnaast is een toename van het FL exciterende laservermogen in biologische imaging beperkt door gevaar van weefselschade (of fototoxiciteit). Dit resulteert in hogere eisen aan de helderheid van de FL probes en hun fotostabiliteit, aangezien HSI orde van grootte langere acquisitietijd kan vereisen in vergelijking met conventionele FL imaging. Het moet ook worden opgemerkt dat de lineaire mengsel analyse en spectraal ontmengingsalgoritme bevredigend kunnen werken voor gemultiplekste FL imaging van biologische weefsels in het spectrale bereik waar weefseltransmissie niet veel verandert. In tegenstelling, als weefseltransmissie kenmerkende eigenschappen heeft in het spectrale bereik van HSI, kan lineair spectraal mengselmodel nauwelijks toepasbaar zijn (vooral in geval van diepere weefsels) en niet-lineaire modellen kunnen overwogen worden.

Conclusies

Concluderend, hebben we een hyperspectrale SWIR bio-imaging techniek ontwikkeld en toegepast voor multiplexing van nanopartikels emittend in SWIR spectrale bereik. Twee typen nanopartikels met overlappende FL spectren, die ononderscheidbaar zijn in conventionele imaging, werden met succes gemultiplekst door hun FL spectrale profielen met behulp van hyperspectrale acquisitie samen met het lineaire spectrale mengsel analyse algoritme. De ontwikkelde methode werd met succes ingezet voor gemultiplekste imaging van SWIR FL nanopartikels zowel in monster suspensies als geïnjecteerd in kleine dieren. Met SWIR bio-imaging bezittend superieure resolutie bij grotere imagingdiepte, bezit SWIR HSI benadering groot potentieel voor gebruik in diverse toepassingen die gemultiplekste imaging met NIR-SWIR FL nanoprobes vereisen. Bovendien, aangezien SWIR bio-imaging in een zeer vroege stadium is, is er veel ruimte voor de ontwikkeling van biomedische toepassingen van FL probes in combinatie met HSI.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

Alle data gegenereerd of geanalyseerd tijdens deze studie zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel.

Afkortingen

BG:

Achtergrond

HSI:

Hyperspectrale imaging

LCTF:

Vloeistofkristal afstembaar filter

NIR:

Nabij-infrarood

NPs:

Nanopartikels

FL:

Fotoluminescentie

PNIPAM:

Poly-N-isopropylacrylamide

PNPs:

Polymere nanopartikels

PS:

Polystyreen

RENPs:

Zeldzame-aard-element gedopte fluoridenanopartikels

SWIR:

Kortgolf-infrarood

TEM:

Transmissie elektronen microscopie