Magnetische grafene veld-effect-transistor biosensor voor ultra-gevoelige enkelstreng DNA-detectie

Samenvatting

In dit werk presenteren we een magnetische grafene veld-effect-transistor (MGFET) biosensor gefabriceerd door een chemical-vapor-deposition (CVD) grafene film over te dragen op een glassubstraat om de geleidende kanaal en sensoringlaag te vormen. Het grafeneoppervlak wordt gefunctionaliseerd met 1-pyreenbutaanzuur succinimidylester (PBASE), wat fungeert als moleculaire anker voor het immobiliseren van een probe-aptamer. Magnetisch gelabeld complementair enkelstreng DNA (cDNA) wordt gevangen via hybridisatie met de aptamer, en de interactie wordt getransduceerd in een meetbare impedantieverandering. Onder een periodiek gemoduleerd magneetveld vertoont de MGFET-impedantie oscillaties wiens amplitude direct evenredig is met de cDNA-concentratie. Met dit principe detecteert de sensor enkelstreng DNA met een detectielimiet van 1 pM. Het waargenomen gedrag wordt gerationaliseerd door een model waarin de magnetische kracht het DNA-kralencomplex buigt, waardoor de dubbellaagcapaciteit van het grafene-kanaal gemoduleerd wordt. Door een periodiek magneetveld toe te passen, kan de impedantie herhaald gesampled worden, wat signaal-ruis-verhouding (SNR) verbetering toestaat via integratie over meerdere periodes. Deze studie demonstreert een hooggevoelige DNA-biosensor en suggereert de potentiële toepasbaarheid op andere biomoleculen en cellulaire assays.

Inleiding

De detectie van DNA is cruciaal voor moleculaire biologie-onderzoek en de diagnose van genetische aandoeningen. Het afgelopen decennium zijn biosensoren gebaseerd op fluorescentie, electrochemie en veld-effect-transistoren (FET) ontwikkeld voor dit doel, met FET-type sensoren die bijzondere aandacht genieten vanwege hun inherent gevoeligheid en specificiteit. Kaisti et al. introduceerden een peptide-nucleïnezuur-gefunctonaliseerde FET voor ongelabeld enkelstreng DNA-detectie, terwijl Kim et al. een complementary-metal-oxide-semiconductor (CMOS)-gebaseerde DNA-ladingsensor fabriceerden. Grafene, met zijn uitzonderlijke oppervlakte, elektrische geleidbaarheid en drager-mobiliteit, heeft zich ontwikkeld als een ideaal platform voor het construeren van FET-biosensoren. Cai en collega's rapporteerden een grafene FET (GFET) capabel van ultra-gevoelige DNA-detectie via peptide-nucleïnezuur-hybridisatie, en onze groep demonstreerde eerder een multi-kanaal GFET voor het bestuderen van DNA-bindingskinetiek en basenparen mismatches. In conventionele GFETs genereert een externe gate-elektrode een elektrisch veld dat een dubbellaag aan de grafene-elektrolyt interface vestigt, waardoor de apparaatgeleidbaarheid gemoduleerd wordt. Recent onderzoek heeft femtomolaire detectielimieten bereikt met GFETs; echter, deze hoge gevoeligheden vertrouwen op dure semiconductor-analyzers en Ag/AgCl referentielektroden, wat praktische implementatie beperkt. Om deze uitdagingen te overwinnen, ontwikkelden we een magnetische grafene FET (MGFET) die een magneetveld, in plaats van een elektrische gate, gebruikt om het grafene-kanaal te moduleren. De MGFET bevat een CVD-grafene-film overgedragen op een glassubstraat geflankeerd door indium-tin-oxide (ITO) elektroden. Het grafene wordt gefunctionaliseerd met PBASE, wat covalente hechting van een probe-aptamer mogelijk maakt die magnetisch gelabeld cDNA vangt. Onderworpen aan een periodiek magneetveld, oscilleert de MGFET-impedantie op een manier die correleert met cDNA-concentratie. Deze magnetische benadering elimineert directe elektrodecontact, wat integratie vereenvoudigt en toepasbaarheid verbreedt. De volgende secties detaileren de fabricatie, detectiesysteem en onderliggend detectiemechanisme van deze nieuwe MGFET-biosensor.

Methoden

Materialen en Instrumenten

Een glassubstraat met ITO-elektroden werd verkregen van Hua Nan Xiang Cheng Ltd. (China). De probe-aptamer, cDNA en mismatched DNA werden gekocht van Sangon Biotech Inc. (Shanghai, China). De aptamer-sequentie is (5'‑NH₂‑TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC‑FAM‑3'); de complementaire DNA (cDNA) sequentie is (5'‑NH₂‑GAA AAG GAG GCG TTA TGA GGG GGT CCA‑3'); de volledig mismatched DNA is (5'‑NH₂‑TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC‑3'); en de enkel-base mismatched DNA is (5'‑NH₂‑GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA‑3'). PBASE en dimethylsulfoxide (DMSO) werden verkregen van Sigma-Aldrich (Shanghai, China). Magnetische nanokralen (MBs) met carboxyl-functionaliserie (10 mg mL⁻¹) werden verkregen van Xianfeng Nano Material Technology Co., Ltd. (Nanjing, China). 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, N-hydroxysuccinimide, sodium dodecylbenzeensulfonate (SDS), en fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) werden gekocht van Sigma-Aldrich (Shanghai, China).

Een Raman-spectrometer (SPEX-1403, SPEX) karakteriseerde grafene-kwaliteit en bevestigde PBASE-functionaliserie. Fluorescentie-fotometrie (LS55, PerkinElmer) kwantificeerde de koppeling van magnetische nanopartikelen aan cDNA. Een aangepast data-verzamelingssysteem registreerde real-time MGFET-impedantie.

Koppeling van cDNA aan MBs

Na 20 min ultrasound, werd 20 µL van 4 mg mL⁻¹ MB-suspensie gemengd met 200 µL van 2 mg mL⁻¹ EDC en 200 µL van 2 mg mL⁻¹ NHS gedurende 15 min om de MBs te activeren. Vervolgens werd 20 µL cDNA toegevoegd en 2 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Een magneetveld verrijkde de MB/cDNA-conjugaten, die driemaal gewassen werden met PBS en heropgelost voor downstream gebruik.

Fabricatie van MGFETs

De MGFETs werden gefabriceerd in een drie-stappen proces: (1) een CVD-grafene-film werd overgedragen op een glasplaat dienende als het geleidende kanaal tussen de twee ITO-elektroden (Fig. 1a). (2) Een 10 mM PBASE-oplossing in DMSO werd 12 uur bij kamertemperatuur op het grafene geïncubeerd, wat π–π stapeling met het grafene-rooster toeliet (Fig. 1b). Overmatig PBASE werd verwijderd door afspoelen met DMSO en PBS. (3) Een 2 µM probe-aptamer oplossing werd geïntroduceerd en 4 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd, wat covalente koppeling via de NHS-ester van PBASE mogelijk maakte (Fig. 1c). Ten slotte werd ongebonden aptamer weggewaasd met 0,2% SDS driemaal.

Resultaten en Discussie

Karakterisering van MGFETs

De CVD-grafene-film werd met succes overgedragen op het glassubstraat, bevestigd door het Ramanspectrum (Fig. 2). De aanwezigheid van de G, D en 2D pieken duidt op hoogwaardig grafene; de I_2D/I_G ratio bevestigt een meerlagige film, terwijl de lage I_D/I_G ratio minimale defecten bewijst.

Directe heching van aptamers aan pristijn grafene is uitdagend door gebrek aan functionele groepen; daarom dient PBASE als π–π geankerde linker. De succinimide-groep van PBASE reageert met de 5'‑NH₂ van de aptamer via NHS-chemie (Fig. 1c). Succesvolle aptamer-immobilisatie werd bevestigd door de fluorescentie-intensiteit van het 3'‑eind FAM-label (Fig. 3). Fluorescentie nam toe met aptamer-concentratie tot plateau bereikt werd bij ~2 µM, wat oppervlakteverzadiging aanduidde. Daarom werd in volgende experimenten een 2 µM aptamer-concentratie gebruikt.

Karakterisering van MB/cDNA

Transmissie-elektronenmicroscopie onthulde dat de MBs ~7 nm in diameter zijn (Fig. 4a,b). Om de vangstefficiëntie te maximaliseren, werd een 4 mg mL⁻¹ MB-concentratie gebruikt voor activering. Kapselefficiëntie werd gemonitord door de afname in FAM-fluorescentie in het supernatant te meten (Fig. 4d). Complete verrijking van 10 nM cDNA werd bereikt, bewijzen door het fluorescentieniveau van het supernatant terugkerend tot dat van PBS.

Analyse van magneetveldinstengheid

Na een 10-min incubatie van MB/cDNA met de MGFETs, werden ongebonden MBs verwijderd door PBS-wassen, waardoor alleen MB/cDNA op de sensor bleef (Fig. 1d). Een permanente magneet gemonteerd op een rotatiemotor pasteerde een periodiek magneetveld toe (Fig. 1e). De impedantie van de MGFET werd geregistreerd met een aangepaste detectieapparatuur.

De relatie tussen magneetveldinstengheid en MGFET-impedantie werd onderzocht om de optimale veldparameters te identificeren (Fig. 5). In MGFETs buigt de magnetische kracht het MB/cDNA-complex, wat de afstand tussen het complex en het grafene-oppervlak verandert, wat op zijn beurt de dubbellaagcapaciteit moduleert. Drie regimes werden waargenomen: (1) <100 mT, waar de magnetische kracht onvoldoende is om het DNA te buigen, wat verwaarloosbare impedantieverandering oplevert; (2) 100–200 mT, waar buiging snel plaatsvindt, wat een duidelijke impedantierespons produceert; en (3) >220 mT, waar de DNA-staf zijn buiglimiet bereikt, en de impedantie stabiliseert (Fig. 5b). Dit elastische-staf-model stemt overeen met eerdere rapporten over DNA-mechanica.

Detectie van cDNA

Met een vast magneetveld van 240 mT, werden impedantieveranderingen geregistreerd over een reeks MB/cDNA-concentraties (Fig. 6a). De toepassing van het periodieke magneetveld induceerde een duidelijke impedantie-oscillatie. Om ruis te onderdrukken, werd een sample-integratie algoritme (SIA) gebruikt: (1) datapunten verzameld tijdens de niet-magnetische periode (T₀) genormaliseerd naar nul; (2) punten tijdens elke magnetische periode (T_M) gesampled en gemiddeld; na vier cycli werd de periodieke impedantieverandering geëxtraheerd (Fig. 6b). Deze benadering verhoogt de SNR effectief door herhaalde sampling te benutten.

De impedantieverandering vertoonde een lineair verband met cDNA-concentratie (Fig. 7). De hoge gevoeligheid voortvloeit uit (1) de mechanische buiging van het MB/cDNA-complex, wat de modulatie van de grafene-dubbellaag versterkt, en (2) het periodieke magneetveld dat SIA-gebaseerde ruisonderdrukking toestaat. Door het aantal magnetische periodes te verhogen, kan de SNR van het systeem verder verbeterd worden.

Selectiviteit van de MGFETs

Selectiviteit werd geëvalueerd met een volledig mismatched DNA en een enkel-base mismatched DNA, elk gekoppeld aan MBs. Na 10 min incubatie met de MGFETs en PBS-wassen, werd het volledig mismatched MB/DNA-complex grotendeels verwijderd, wat resulteerde in verwaarloosbare impedantieverandering (Fig. 8a), wat hoge selectiviteit bevestigt. Het enkel-base mismatched DNA produceerde een impedantieverandering iets lager dan de volledig complementaire streng maar hoger dan de niet-complementaire controle, wat aantoont dat de sensor enkel-base mismatches kan discrimineren (Fig. 8b). Terwijl de intrinsieke specificiteit van de aptamer de selectiviteit beheerst, draagt de MGFET-architectuur bij aan de algehele gevoeligheid.

Conclusies

We hebben een magnetische grafene FET biosensor ontwikkeld die magnetisch gelabeld DNA en een periodiek magneetveld benut om bindingsgebeurtenissen te transduceren in impedantie-oscillaties. De magnetische kracht buigt het MB/cDNA-complex mechanisch, wat de grafene-dubbellaag moduleert en een detectielimiet van 1 pM voor enkelstreng DNA oplevert. Het periodieke magneetveld maakt signaal-integratie-gebaseerde ruisonderdrukking mogelijk, wat de gevoeligheid verder verbetert. Naast DNA-detectie biedt dit platform een veelzijdig framework voor het meten van mechanische eigenschappen van nucleïnezuren en voor het detecteren van andere biomoleculen of cellen.

Beschikbaarheid van data en materialen

Alle data gegenereerd of geanalyseerd tijdens deze studie zijn opgenomen in het artikel.

Afkortingen

cDNA:

Complementair magnetisch gelabeld enkelstreng DNA

CVD:

Chemische dampdepositie

DMSO:

Dimethylsulfoxide

FET:

Veld-effect-transistor

GFET:

Grafene veld-effect-transistor

MBs:

Magnetische nanokralen

MGFET:

Magnetische grafene veld-effect-transistor

NHS:

N-Hydroxysuccinimide

PBASE:

1-Pyreenbutaanzuur succinimidylester

PBS:

Natrium dodecylsulfaat fosfaat-gebufferde zoutoplossing

SDS:

Natrium dodecylbenzeensulfonate

SIA:

Sample integratie algoritme

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscopie

ITO:

Indium-tin-oxide