Magnetische grafeen-veldeffecttransistorbiosensor voor enkelstrengs DNA-detectie

Resultaten en discussie

Karakterisering van MGFET's

Grafeenfilm geproduceerd door de CVD-methode werd overgebracht op een glassubstraat als een geleidend kanaal tussen twee ITO-elektroden (figuur 1a). De overgebrachte grafeenfilm werd gekarakteriseerd met Raman-spectrum (Fig. 2). Het verschijnen van de drie karakteristieke pieken van het grafeen demonstreerde de succesvolle overdracht van de grafeenfilm op het glassubstraat [24, 25]. De intensiteitsverhouding tussen de 2D-band en de G-band (I_2D /I_G ) gaf aan dat het overgebrachte grafeen een meerlagige film was [26]. Verder is de intensiteitsverhouding tussen de D-band en de G-band (I_D /I_G ) was klein, wat wijst op een zeer lage defectdichtheid.

Raman-spectrum

Vanwege het gebrek aan functionele groepen waren de aptamerketens moeilijk aan te passen op de CVD-grafeenfilm. Daarom werd PBASE, op basis van zijn aromatische pyrenylgroep, gemodificeerd op de grafeenfilms via π–π-stapeling als een linker. Aan de andere kant van PBASE kan het succinimidegedeelte van PBASE worden gekoppeld aan de 5'-NH₂ -gelabelde probe-aptameer op basis van de N-hydroxysuccinimide (NHS) verknopingsreactie (figuur 1c). Om de binding van de probe-aptameer op grafeenfilm te beoordelen, werd het 3'-uiteinde van de probe-aptameer gelabeld met behulp van de FAM-fluorofoor (sequentie:5'-NH₂ -TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC-FAM-3′). Onmiddellijk na de introductie van aptamer was de fluorescentie-intensiteit duidelijk verbeterd, wat wijst op de succesvolle modificatie op het grafeenoppervlak (Fig. 3). Het verhogen van de aptameerconcentratie van de sonde leidde tot een toename van de fluorescentie-intensiteit, waardoor een constante waarde werd bereikt en daarom de verzadiging van de sonde-aptamer op de MGFET's bij ongeveer 2 M werd aangegeven. Daarom werden daaropvolgende experimenten uitgevoerd bij een probe-aptameerconcentratie van 2 M.

Karakterisering van MGFET's-modificatie door sonde-aptameer. Foutbalk vertegenwoordigt de standaarddeviatie van 5 onafhankelijke analyses

Karakterisatie van MB/cDNA

De morfologie van de MB's en MB / cDNA-conjugaten werd gekenmerkt door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) (Fig. 4a, b). De deeltjesgrootteverdeling van MB's vertoonde een gemiddelde deeltjesgrootte van ongeveer 7 nm (figuur 4c). Om gevoeligheid en nauwkeurigheid in de biosensing voor cDNA te garanderen, moeten MB's buitensporig zijn voor cDNA om cDNA volledig te vangen. MB's met een concentratie van 4  mg / ml werden geactiveerd om te zorgen voor binding aan de cDNA-monsters die hierin worden gebruikt. Door middel van labeling van cDNA door FAM werd de fluorescentie-intensiteit benut om de koppelingsefficiëntie te karakteriseren en de cDNA-concentratie te optimaliseren (figuur 4d). De fluorescentie-intensiteit van het supernatant nam inderdaad duidelijk af na de introductie van MB's in de cDNA-oplossingen, wat aangeeft dat cDNA werd opgevangen en verrijkt door de MB's. De succesvolle vangst van cDNA door MB's werd bevestigd door de waarneming dat, bij een cDNA-concentratie van 10 nM, de fluorescentie-intensiteit van het supernatant gelijk was aan die van PBS, wat aangeeft dat al het cDNA was gevangen en verrijkt met MB's (Fig. 4d ).

Karakterisering van MB/cDNA-koppeling. een TEM van MB's. b TEM van MB/cDNA-conjugaten. c Deeltjesgrootteverdeling van MB's. d Karakterisering van MB/cDNA (FAM) koppeling. Foutbalk vertegenwoordigt de standaarddeviatie van 5 onafhankelijke analyses

Analyse van de intensiteit van het magnetische veld

MB/cDNA-conjugaten werden gedurende 10 min aan de MGFET's toegevoegd om volledige cDNA-hybridisatie met het probe-aptameer mogelijk te maken. Omdat de probe-aptameer niet kon koppelen met MB's zonder de gemodificeerde aminogroepen, konden de overtollige MB's worden verwijderd door de MGFET's driemaal met PBS te wassen. Daarom bleven alleen de MB / cDNA-conjugaten op de MGFET's achter (figuur 1d). Een permanente magneet werd op een roterende motor gemonteerd om een ​​periodiek magnetisch veld op de MGFET's aan te leggen (figuur 1e). Er werd een in het laboratorium gemaakt detectieapparaat gebruikt om de impedantiefluctuatie van de MGFET's te registreren.

Omdat de impedantie van MGFET's werd gemoduleerd door een magnetisch veld als de achterpoort, werd de correlatie tussen de intensiteit van het magnetische veld en de impedantie van MGFET's onderzocht om de parameters van de magnetische veldintensiteit te optimaliseren (figuur 5). Algemeen wordt aangenomen dat de dubbele geleidende laag gevormd tussen het grafeen en de elektrolyt wordt gemoduleerd door het externe elektrische veld, waardoor de geleidbaarheid van GFET's wordt gemoduleerd [19, 27, 28]. In MGFET's werd door de magnetische kracht tussen de MB's en het magnetische veld de afstand tussen MB/cDNA-conjugaten en de grafeenfilm mechanisch gecontroleerd, waardoor de dubbele geleidende laag van MGFET's werd gemoduleerd [29, 30]. De impedantie van MGFET-biosensoren varieerde met de toenemende intensiteit van het magnetische veld in drie fasen, wat kan worden verklaard door de MB/cDNA-keten als een elastische dunne staaf te nemen [31]. De eerste fase vond plaats bij een magnetische veldintensiteit van minder dan 100 mT in dit werk. Gebaseerd op het elastische dunne staafmodel van DNA-ketens, omdat de magnetische veldkracht minder is dan de radiale steunkracht van de DNA-streng, is de magnetische veldkracht moeilijk om de DNA-streng te laten buigen; daarom zijn de MGFET's niet gevoelig voor het magnetische veld. In de tweede fase met een magnetische veldsterkte van 100 tot 200 mT, is de magnetische veldsterkte voldoende om de radiale steunkracht van de DNA-elastische dunne staaf te overwinnen, wat resulteert in een snelle buiging van het MB/cDNA en vervolgens een gevoelige respons van de MGFET's naar het magnetische veld. Ten slotte, in de derde fase met een magnetische veldintensiteit van meer dan 220 mT, bereikt de buiging van de elastische DNA-staaf zijn limiet; daarom zullen de MGFET's niet reageren op de verandering van het magnetische veld, wat resulteert in een stabiele impedantie van de MGFET's zoals weergegeven in figuur 5b.

Invloed van magnetische veldintensiteit op impedantie van MGFET's. een Impedantie van MGFET's onder een variërende magnetische veldintensiteit in het tijdsdomein. b Relatie tussen impedantie van MGFET's en intensiteit van het magnetische veld. Foutbalk vertegenwoordigt de standaarddeviatie van 5 onafhankelijke analyses

Detectie van cDNA

De veranderingen in MGFET-impedantie met variërende MB/cDNA-conjugaatconcentraties werden gemeten onder een vaste magnetische veldsterkte van 240 mT om de haalbaarheid en gevoeligheid voor cDNA-detectie te bepalen.

De MGFET-impedantie bij elke cDNA-concentratie werd in realtime geregistreerd (figuur 6a). Wanneer een permanente magneet op de achterkant van de MGFET's werd geladen, nam de impedantie snel toe. Omgekeerd, wanneer een periodiek magnetisch veld werd aangelegd, werd een periodieke verandering in impedantie waargenomen. Op basis van deze impedantieperiodiciteit werd een voorbeeldintegratiealgoritme (SIA) gebruikt om de signaal-ruisverhouding van de MGFET's te verhogen. Gezien de periode zonder het aanleggen van een magnetisch veld was T₀ en de periode met het aanleggen van een magnetisch veld was T_M (Fig. 6a), zou de SIA beschreven kunnen worden met de volgende stappen:(1) tijdens T₀ , alle datapunten, geproduceerd door ruis, werden genormaliseerd naar nul, (2) de datapunten verkregen tijdens elke T_M periode werden op volgorde genomen en gemiddeld. Na SIA-verwerking gedurende vier cycli, werd de periodieke impedantieverandering in MGFET's verkregen zoals getoond in figuur 6b. In theorie zou de signaal-ruisverhouding van de MGFET's effectief kunnen worden verbeterd met voldoende lange bemonsteringstijden.

een Tijdsdomein van impedantiefluctuaties met verschillende cDNA-concentraties. b Impedantieveranderingen van MGFET's volgens cDNA-concentratie

De impedantieveranderingen in MGFET's hadden een positieve correlatie met de cDNA-concentratie (figuur 6b). De correlatie tussen de impedantieverandering van MGFET's en de cDNA-concentratie werd beoordeeld (figuur 7). De hoge gevoeligheid van de MGFET-biosensoren in dit werk is voornamelijk gebaseerd op de volgende twee aspecten:ten eerste zou de mechanische beweging van MB/cDNA-conjugaten het modulatie-effect op de dubbele geleidende laag kunnen versterken in vergelijking met het geval van alleen DNA, en ten tweede, aangezien een periodiek magnetisch veld kan worden toegepast om periodieke impedantieveranderingen van MGFET's te produceren, gebaseerd op het bemonsteringsintegratieprincipe, werd alleen de MGFET-impedantie met het magnetische veld bemonsterd en geïntegreerd om de ruis te verminderen. Daarom zou de signaal-ruisverhouding van het systeem sterk kunnen worden geoptimaliseerd door het aantal perioden van het externe magnetische veld te vergroten.

Verband tussen impedantie van MGFET's en concentratie van doel-DNA. Foutbalk vertegenwoordigt de standaarddeviatie van 5 onafhankelijke analyses

Selectiviteit van de MGFET's

De specificiteit van de MGFET's werd geëvalueerd door het detecteren van twee verschillende doel-DNA-sequenties, waaronder volledig niet-overeenkomende DNA-ketens en enkelvoudige niet-overeenkomende DNA-ketens. Vergelijkbaar met de hierboven beschreven procedure, een volledig niet-overeenkomend DNA (sequentie:5′-NH₂ -TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC-3′) en single-base niet-overeenkomend DNA (sequentie:5′-NH₂ -GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA-3′) werden respectievelijk gekoppeld aan MB's. Het niet-overeenkomende MB / DNA opgelost in PBS-oplossing werd gedurende 10  min aan de MGFET-biosensoren toegevoegd om voldoende met het aptameer te reageren. De MGFET's werden driemaal gewassen met PBS om het niet-overeenkomende DNA te verwijderen. Voor volledig niet-overeenkomende DNA-ketens, omdat het conjugaat van MB/DNA niet kon hybridiseren met aptamer, werden bijna alle MB/DNA-conjugaten verwijderd. Daarom heeft de toevoeging van volledig niet-overeenkomend MB / DNA bijna geen effect op de geleidbaarheid van grafeen, zoals weergegeven in figuur 8, wat wijst op een hoge selectiviteit van de biosensor. Verder hebben we ook de selectiviteit van de biosensoren onderzocht door middel van niet-overeenkomende DNA-ketens met een enkele base, zoals weergegeven in Fig. 7. Het kan worden gevonden dat de MGFET-impedantieverandering met niet-overeenkomende ketens met een enkele base iets lager was dan de complementaire strengen en hoger dan de niet-complementaire doelstreng op elke bepaalde concentratie. Daarom zou de niet-overeenkomende streng met een enkele base detecteerbaar kunnen zijn in dit werk. Hoewel de aptamer en de complementaire DNA-ketens allemaal commerciële producten zijn die voornamelijk de selectiviteit van de biosensoren bepaalden, hebben de MGFET's en hun detectiesysteem ook bijgedragen aan de hoge gevoeligheid voor DNA-detectie.

Verband tussen impedantie van MGFET's en concentratie van volledig niet-overeenkomend DNA. Foutbalk vertegenwoordigt de standaarddeviatie van 5 onafhankelijke analyses