Rollen van ROS en stopzetting van de celcyclus in de genotoxiciteit veroorzaakt door gouden nanostaafkern/zilveren schaal nanostructuur

Materialen en methoden

Celcultuur en behandeling

In deze studie werd menselijke hepatoomcellijn HepaRG (Thermo Fisher Scientific) gebruikt. Cellen werden gekweekt in RPMI 1640 met 10% foetaal runderserum (FBS, Australia Origin, Gibco) en 1% penicilline-streptomycine-glutamine-oplossing (Gibco) in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO₂ bij 37 °C. De cellen werden respectievelijk 24 uur of 72 uur behandeld met toenemende concentraties Au@Ag NR en de concentraties werden bepaald in overeenstemming met IC₅₀ geschat door cellevensvatbaarheidsassay. Om de rol van ROS in de genotoxiciteit te onderzoeken, 1 mM N -Acetyl-l-cysteïne (NAC, Sigma-Aldrich) werd 1 uur vóór de behandeling met Au@Ag NR aangebracht.

ATP-celgroei/levensvatbaarheidstest

De cellen werden gezaaid in een plaat met 96 putjes met een dichtheid van 5 × 10 ³ /goed. Na 24 uur incubatie werd het medium opgezogen en werden de cellen respectievelijk 24 uur of 48 uur blootgesteld aan verschillende concentraties Au@Ag NR. Er werd een breed spectrum aan concentraties bereid en er werden vier putjes per behandeling uitgevoerd in één behandelingsperiode. De cytotoxiciteit van Au@Ag NR werd onderzocht met een adenosinetrifosfaat (ATP)-assay (CellTiter-Glo® 2.0-assay, Promega), die de cellulaire metabolische activiteit meet door de hoeveelheid ATP, een belangrijke metabolismeparameter in levensvatbare cellen, te kwantificeren. De luminescente signalen, die de hoeveelheden levensvatbare cellen weerspiegelen, werden gedetecteerd met VICTOR Multilabel Plate Reader (2030-0050, PerkinElmer) en IC₅₀ waarden werden geschat als de concentratie van Au @ Ag NR voor halfmaximale levensvatbaarheid door Prism 7 (GraphPad Prism 7, CA, VS). De levensvatbaarheidsratio wordt berekend met behulp van de volgende vergelijking:

waarbij RLU de relatieve lichteenheid is die wordt weergegeven als de gemiddelde waarde van vier putten, RLU_voertuig vertegenwoordigde cellen die niet zijn behandeld met nanostaafjes, en RLU_monster vertegenwoordigde cellen die werden behandeld met verschillende concentraties Au@Ag NR.

Concentratiebepaling van zilver en goud in cellen

De celmonsters werden gedigereerd in salpeterzuur met behulp van het microgolfdigestiesysteem. Na de digestie werden de monsters bereid met een mengsel dat 1% salpeterzuur en zoutzuur bevatte. De hoeveelheden Ag en Au in de oplossingen werden bepaald door ICP-MS (NexION300X, PerkinElmer). TEM-analyse werd gebruikt om de aanwezigheid van Au NR en Au@Ag NR in de cel te bepalen. De celmonsters werden gedurende 2 uur bij 4 ° C gefixeerd in een mengsel van 2,5% glutaaraldehyde en 2% paraformaldehyde. De celpellets werden drie keer gefixeerd en gespoeld in fosfaatbuffer (pH 7,4) en daarna gefixeerd in 1% osmiumtetroxide gedurende 2 uur bij 4 ° C. De monsters werden vervolgens drie keer in gedestilleerd water gespoeld en 15 minuten achter elkaar in verschillende concentraties ethanol (respectievelijk 50%, 70%, 90% en 100% ethanol) gedehydrateerd. Vervolgens werd propyleenoxide in verdunningen van 1:1 en 1:3 gedurende 2 uur bij 20-26 ° C op de hars aangebracht. Polymerisatie werd uitgevoerd door geleidelijke verwarming bij 35 ° C gedurende 16 uur, 45 ° C gedurende 8 uur, 55 ° C gedurende 14 uur en 65 ° C gedurende 48 uur. Ultradunne coupes werden 25 minuten gekleurd met uranylacetaat en loodcitraat en geanalyseerd met een transmissie-elektronenmicroscoop (H-7650, HITACHI, Japan).

Conventionele en gemodificeerde komeettest

De cellen werden gezaaid in platen met 12 putjes met een dichtheid van 2 × 10 ⁵ /well of 3 × 10 ⁵ /well voor respectievelijk een behandeling van 24 of 72 uur. Waterstofperoxide (H₂ O₂ ) in een concentratie van 200 μmol werd gedurende een uur als positieve controle aan de cellen blootgesteld. Voor elk monster werden twee putjes geprepareerd voor zowel de conventionele behandeling als de formamidopyrimidine glycosylase (Fpg) behandeling. Conventionele kometentest werd uitgevoerd in alkalische omstandigheden (pH > 13) zoals eerder beschreven [21]. Voor de met Fpg behandelde putjes werd een extra Fpg-behandeling toegepast vóór de DNA-afwikkelingsprocedure en werden de objectglaasjes ondergedompeld in een enzymbuffer (0,1 M KCl, 0,5 mM EDTA, 40 mM HEPES, 0,2 mg.mL ⁻¹ BSA) drie keer gedurende 5 minuten elk. De Fpg (New England Biolabs, Inc., VK) werd 1:50.000 verdund met enzymbuffer. Porties van honderd milliliter van het verdunde enzym werden aan elke gel op de objectglaasjes toegevoegd en gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een vochtige kamer geïncubeerd. De overige stappen waren hetzelfde als bij de conventionele behandeling. De komeetassays werden in drievoud uitgevoerd. Ten minste 50 cellen per monster werden onafhankelijk gescoord met behulp van de Nikon Eclipse 80i fluorescentiemicroscoop (Nikon, Tokyo, Japan), terwijl Komet 6.0 (Andor Technology, Belfast, VK) werd gebruikt om de gemiddelde waarde van het percentage DNA in staart en olijfstaart te analyseren moment (OTM) van elk monster.

Kwalificatie van γ-H2AX-foci door flowcytometrie en screening met hoge inhoud

Voor de kwantificering met behulp van flowcytometrie werden cellen gezaaid in platen met 12 putjes met een dichtheid van 2 × 10 ⁵ /well of 3 × 10 ⁵ /putje voor respectievelijk een behandeling van 24 of 72 uur, terwijl voor de screeningsassay met hoog gehalte cellen werden gezaaid in platen met 96 putjes met een dichtheid van 6 × 10 ³ /well of 1 × 10 ⁴ /well voor respectievelijk een behandeling van 24 of 72 uur. Als positieve controle werd 2 μM methylmethaansulfonaat (MMS, Sigma-Aldrich) gedurende een uur parallel met de cellen aangebracht. De cellen werden gespoeld in tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur gefixeerd met 4% paraformaldehyde. Na wassen met TBS werden de cellen gedurende 30 minuten bij -20 ° C geïncubeerd met 50 μL ijskoude methanol. De cellen werden driemaal verder gespoeld in TBS en het blokkerende reagens (TBS met 0,3% Triton X-100 en 10% geitenserum) werd gedurende 1 uur aangebracht. Het primaire antilichaam (muis-anti-fosfo-H2AX Ser139, Millipore) werd verdund tot 1:200 met blokkerend reagens en overnacht bij 4 ° C met de cellen geïncubeerd. De plaat werd vervolgens opnieuw driemaal gespoeld met TBS en het secundaire antilichaam (Alexa Fluor 488 geit-anti-muis, Life Technologies), verdund met het blokkerende reagens in een verhouding van 1:20, werd vervolgens toegevoegd. De monsters werden 1 uur in het donker bij kamertemperatuur bewaard en 2 μg mL ⁻¹ (20 μL/putje) DAPI (Invitrogen) werd aan elk putje toegevoegd. De fluorescentie werd gemeten met behulp van een flowcytometrie (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, VS) of High Content Analysis System (Operetta CLS, PerkinElmer). Voor de flowcytometrie-assay werden gegevens van ten minste 10.000 cellen per groep geanalyseerd en werden de experimenten in drievoud uitgevoerd; voor analyse met een hoog gehalte werden 20 visuele velden in elk putje en ten minste vijf putjes in elke groep geanalyseerd.

Cytokinese-blok micronucleus cytome (CBMN-cyt) assay

CBMN-cyt werd uitgevoerd volgens de procedure beschreven door Fenech et al. [22]. Cellen werden gezaaid in platen met 12 putjes met een dichtheid van 2 × 10 ⁵ /well of 3 × 10 ⁵ /well voor respectievelijk een behandeling van 24 of 72 uur. 0,2 μg mL ⁻¹ Mitomycine C (MMC, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Japan) werd gedurende 24 uur als positieve controle aan de cellen blootgesteld. 3 μg mL ⁻¹ cytochalasine B werd aangebracht na een behandeling van 24 of 72 uur om het cytokineseproces te blokkeren en de cellen werden na 40 uur geoogst. De monsters werden gekleurd met 5% Giemsa na hypotoniciteit met voorverwarmde 0,075 mol L ⁻¹ KCl en fixatie met een 3:1 mengsel van methanol en azijnzuur. Er werden drievoudige putjes per groep bereid en er werden ten minste 1000 tweekernige cellen per putje onderzocht.

Meting van MDA, totale GSH- en SOD-inhoud

De cellen werden gekweekt in platen met 12 putjes met een dichtheid van 5 × 10 ⁵ /well of 3 × 10 ⁵ /well voor respectievelijk een behandeling van 24 of 72 uur. Vervolgens werden de cellen geoogst en driemaal gespoeld met fosfaatbufferzout (PBS). De hoeveelheden malondialdehyde (MDA) in de celhomogenaten werden bepaald met behulp van een op thiobarbituurzuur gebaseerde methode (Nanjing Jiancheng Bio-engineering Institute, Nanjing, China). De hoeveelheden totaal glutathion (GSH) en superoxide dismutase (SOD) werden bepaald met behulp van respectievelijk de totale glutathion-kwantificering en SOD-assaykits (Dojindo Molecular Technologies, Inc. Kumamoto, Japan). Optische dichtheden (O.D) van elk putje werden gemeten met VICTOR Multilabel Plate Reader (2030-0050, PerkinElmer).

Flowcytometrische analyse voor celcyclus

De cellen werden gekweekt in platen met 6 putjes met een dichtheid van 1 × 10 ⁶ /well of 5 × 10 ⁵ /putje voor respectievelijk een behandeling van 24 of 72 uur en werden vervolgens 's nachts gefixeerd met 70% ethanol bij 4 ° C. De monsters werden driemaal gespoeld met PBS en gekleurd met PI/Rnase-kleuringsbuffer (BD Biosciences) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Celpopulaties onder de GO/G1-, S- en G2/M-fase onder 20.000 cellen werden bepaald door gebruik te maken van regio's met FL2-oppervlak versus FL2-breedte. Analyse werd uitgevoerd door flowcytometrie (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, VS) en FlowJo (BD Bioscience), en de experimenten werden in drievoud uitgevoerd.

Flowcytometrische analyse van celapoptose

De cellen werden gekweekt in platen met 6 putjes met een dichtheid van 1 × 10 ⁶ /well of 5 × 10 ⁵ /well voor respectievelijk een behandeling van 24 of 72 uur. Ze werden vervolgens tweemaal gespoeld met PBS en verdund met 500 μL 1 × bindingsbuffer (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I, BD Bioscience) om de suspensie in te stellen op ongeveer 1 × 10 ⁶ cellen / ml, en vervolgens werd 100 L verdunning gemengd met 5 µL FITC Annexin V en 5 µL PI. De monsters werden gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur gekleurd en ten minste 10.000 cellen werden geanalyseerd om de celpopulatie onder vroege en late apoptose te bepalen door regio's met FL1H versus FL2H te gebruiken met behulp van flowcytometrie (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, VS) en FlowJo (BD Biowetenschappen). De experimenten werden in drievoud uitgevoerd.

Western-blot-analyse

De cellen werden gekweekt in een ² kolf met een dichtheid van 1 × 10 ⁷ /well en 6 × 10 ⁶ /well voor respectievelijk een behandeling van 24 en 72 uur. De cellen werden gelyseerd met RIPA-lysisbuffer die proteaseremmer (PMSF) bevat, en de concentratie van eiwitten werd bepaald met behulp van een BCA-eiwitkwantificatiekit (Beyotime Biotechnology, China). De concentraties van de monsters werden aangepast met behulp van RIPA-lysisbuffer voorafgaand aan denaturatie door 3 minuten op 95 ° C te verwarmen. De eiwitmonsters werden gescheiden door elektroforese op 12% SDS-polyacrylamidegels en overgebracht naar nitrocellulosemembranen (Millipore). De membranen werden gedurende 30 minuten geblokkeerd met 5% magere melk en geïncubeerd met primaire p53 (SC-137174, Santa Cruz), p21 (SC-6246, Santa Cruz) en β-actine (sc-47778, Santa Cruz) en secundaire antilichamen geit anti-muis IgG(H+L)-HRP(SE131, solabio), respectievelijk. De expressieniveaus van de doeleiwitten in de monsters werden gevisualiseerd met behulp van een verbeterde chemiluminescentie (ECL) -methode en geanalyseerd door het ImageJ-systeem (National Institutes of Health).

Statistische analyses

De gegevens werden gepresenteerd als het gemiddelde   ±  SEM. Eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) werd gebruikt om de statistische significantie van verschillen tussen negatieve controle en behandelde groepen te testen, gevolgd door de Dunnett meervoudige vergelijkingstest met SPSS (versie 22, IBM, Armonk, NY, VS), en de gegevens werden overwogen statistisch significant bij P < 0.05. De cijfers zijn gemaakt met GraphPad Prism 7 voor Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, VS).

Resultaten

Karakterisering van Au NR en Au@Ag NR

Gouden nanostaafjes (Au NR's), gouden nanostaafjes en zilveren omhulsel-nanostructuren (Au@Ag NR) werden ontworpen, bereid en gekarakteriseerd zoals eerder beschreven [21]. In het kort, de gemiddelde diameters en lengtes zijn 15,0 ± 2,5 nm, 66,7 ± 2,5 nm voor Au NR's en 26,2 ± 3,0 nm, 72,7 ± 8,9 nm voor Au@Ag NR's. De dikte van de Ag-schaal is ongeveer 5 nm. De zeta-potentialen van met PDDAC gecoate Au NR's en Au@Ag NR's gedispergeerd in water waren respectievelijk 37,7 ±-1,6 mV en 52,5 ±-1,4 mV. De Ag/Au-gewichtsverhouding van bereid Au@Ag NR werd geschat op 2,3. De karakteriseringsresultaten worden getoond in Fig. 1.

Karakterisering van Au NR en Au@Ag NR. een Structuurschema van Au NR en Au@Ag NR; b UV-Vis-NIR-extinctiespectra van Au NR en Au@Ag NR gedispergeerd in water; c representatieve TEM-beelden van Au NR; d representatieve TEM-beelden van Au @Ag NR

Levensvatbaarheid van de cel

De cytotoxiciteit van Au@Ag NR voor HepaRG-cellen werd onderzocht door middel van een ATP-levensvatbaarheidstest (tabel 1) en de cellen werden 24 of 48 uur blootgesteld aan Au@Ag NR in concentraties variërend van 0,125 tot 160 μg ml ^-1 . Au@Ag NR veroorzaakte significante cytotoxische effecten op zowel tijd- als dosisafhankelijke manieren na blootstelling van 24 en 48 uur, met % levensvatbaarheid IC₅₀ bij 20 µg mL ⁻¹ en 6 µg mL ⁻¹ , respectievelijk gemonteerd door de software GraphPad Prism 7.0. Gezien de algehele cytotoxiciteit werden de behandelingsperioden aangepast tot 24 uur en 72 uur, terwijl de toegepaste concentraties 0,8 µg ml ⁻¹ waren. , 4 µg mL ⁻¹ en 20 µg mL ⁻¹ . Bovendien werd Au NR opgenomen als een inerte controle en was het Au-gehalte in de AuNR-groep hetzelfde als 20 µg mL ⁻¹ Au@Ag NR, dat is 16 µg mL ⁻¹ . Daarentegen werd 1 mM NAC-voorbehandeling toegepast in de Au@Ag NR + NAC-groep als controle voor oxidatieve stressrespons (de concentratie van Au@Ag NR is 20 µg ml ⁻¹ ).

Celverdeling van Au NR en Au@Ag NR

De verdeling van het Au- en Ag-gehalte in de HepaRG-cellen werd geanalyseerd door ICP-MS. Zoals getoond in Tabellen 2 en 3, nam het Ag-gehalte op een dosisafhankelijke manier toe. Echter, de antioxidant N Acetyl-l-cysteïne (NAC) als vrije radicalenvanger kan de cellulaire opname van nanodeeltjes beperken, aangezien er een lager Ag-gehalte werd waargenomen, hoewel dezelfde concentratie Au@Ag NR (20 µg ml ⁻¹ ) werd toegepast in deze groep. De daling van de Ag/Au-verhouding van 24 tot 72 h duidde op een continue afgifte van Ag ⁺ uit de schil van Au@Ag NR. Ook is de cellulaire opname van Ag veel meer dan Au (Tabel 4). Verder toonden TEM-gegevens aan dat de meeste Au NR en Au@Ag NR als agglomeraten in de cellen werden vastgehouden. De structuren van nanostaafjes waren duidelijk te zien in de cellen die werden blootgesteld aan Au NR of Au@Ag NR zonder de kern binnen te gaan (Fig. 2).

Au NR en Au@Ag NR internalisatie:HepaRG door TEM bij 80 kV na 24 uur blootstelling aan 16 μg mL ⁻¹ Au NR en 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR. een Voertuig controle; b Au NR; c Au@Ag NR

DNA-schade

De DNA-schade veroorzaakt door Au@Ag NR werd geëvalueerd door zowel de comet-assay als de γH2AX-assay (Fig. 3). Uit de komeettest werd waargenomen dat 0,8 tot 20 µg mL ⁻¹ Au@Ag NR kan aanzienlijke DNA-schade veroorzaken. Na een blootstelling van 24 of 72 uur aan Au@Ag NR, namen zowel het % staart-DNA als het OTM van cellen toe op zowel tijd- als concentratieafhankelijke manieren. Bovendien werd DNA-schade geassocieerd met oxidatieve stress-inductie waargenomen in de cellen die werden behandeld met 20 µg mL ⁻¹ Au @ Ag NR door de Fgp-enzym-gemodificeerde komeettest (Fig. 3a, b). Voor het evalueren van de mate van dubbelstrengs breuk die een hogere correlatie met het ontstaan ​​van kanker vertegenwoordigt, werden zowel γ-H2AX-positieve cellen als gemiddelde fluorescentie-intensiteiten in γ-H2AX-positieve cellen geanalyseerd. Na een blootstelling van 24 uur aan Au@Ag NR werd er geen verschil gevonden tussen groepen in γ-H2AX-positieve cellen. Echter, 4 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR-groep veroorzaakte een significante toename na een behandeling van 72 uur. Aanzienlijke verhogingen van de fluorescentie-intensiteiten werden waargenomen in alle Au@Ag NR-groepen na 72 uur vergeleken met de voertuigcontrole (Fig. 3c-e, P < 0.05).

DNA-schade geïnduceerd door Au@Ag NR. HepaGR-cellen werden blootgesteld aan Au@Ag NR in verschillende concentraties (0,8 tot 20 μg mL ⁻¹ ) gedurende respectievelijk 24 uur en 72 uur. een Gemiddeld % staart-DNA na blootstelling aan Au@Ag NR gedurende 24 uur; b gemiddeld % staart-DNA na 72 uur blootstelling aan Au@Ag NR; c percentage positieve cellen met γ-H2AX-foci geschat met behulp van flowcytometrie; d gemiddelde fluorescentie-intensiteiten in cellen met γ-H2AX-foci geschat met behulp van immunofluorescentiekleuring. ^* P < 0,05 versus voertuigcontrole; ^een P < 0,05 versus Au NR. 2 μM mL ⁻¹ MMS werd gebruikt als positieve controle

Chromosomale schade

De vorming van micronuclei is een belangrijke biomarker voor het identificeren van chromosomale schade, wat een meer kritische schade aan het genetisch materiaal is dan DNA-breuk. De verhouding van tweekernige cellen die micronucleus bevatten, werd gescoord zoals weergegeven in figuur 4c. Au@Ag NR verhoogde de micronucleusvorming in een concentratieafhankelijk patroon. Na een blootstelling van 24 uur werden de verhoudingen van micronucleus waargenomen in cellen die werden behandeld met 4 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR en 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR waren respectievelijk 1,133 ± 0,145% en 1,567 ± 0,318%, die beide significant hoger waren dan die in de voertuigcontrolegroep. Na een blootstelling van 72 uur is de verhouding van micronucleus in cellen die zijn behandeld met 4 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR was 1,767 ± 0,233%, wat significant hoger was dan de vehikelcontrolegroep; de verhouding van micronucleus in cellen die zijn behandeld met 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR was 2,167 ± 0,252%, wat significant hoger was dan die waargenomen in zowel de voertuigcontrolegroep als 16 μg mL ⁻¹ Au NR-groep (0.700 ± 0.153%). Er werd daarentegen geen verschil gevonden tussen cellen die werden behandeld met 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR + NAC en voertuigcontrole, wat de deelname van ROS in de chromosoombreuk veroorzaakt door Au@Ag NR suggereert.

Chromosoomschade veroorzaakt door Au@Ag NR. HepaGR-cellen werden blootgesteld aan Au@Ag NR in verschillende concentraties van 0,8 μg mL ⁻¹ tot 20 μg mL ⁻¹ voor 24 uur en 72 uur. een , b Representatieve afbeeldingen van micronucleus (rode pijl); c micronucleus frequentie (%). ^* P < 0,05 versus voertuigcontrole; ^een P < 0,05 versus Au NR. 0,2 μg mL ⁻¹ mitomycine C werd gebruikt als een positieve controle

Effecten van Au@Ag NR op de ROS-formatie

Om de rol van ROS-vorming in Au@Ag NR-geïnduceerde DNA- en chromosoombeschadigingen verder te onderzoeken, werden MDA-, GSH- en SOD-niveaus geschat. Een significante toename in MDA-vorming (P < 0.05) werd waargenomen na blootstelling aan 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR voor zowel 24 als 72 uur (Fig. 5a). Verder vertoonden de GSH- en SOD-niveaus in cellen die waren blootgesteld aan Au@Ag NR een significante verlaging (P < 0,05) op een tijd- en concentratieafhankelijke manier. Deze resultaten suggereerden een disbalans tussen oxidatie en anti-oxidatie, veroorzaakt door de blootstelling aan Au@Ag NR (Fig. 5b, c).

Effecten van Au@Ag NR op de ROS-formatie. HepaGR-cellen werden blootgesteld aan Au@Ag NR in verschillende concentraties van 0,8 μg mL ⁻¹ tot 20 μg mL ⁻¹ voor 24 uur en 72 uur. een MDA-niveau; b GSH-niveau; c SOD-niveau. ^* P < 0,05 versus voertuigcontrole; ^een P < 0.05 versus Au NR

Effecten van Au@Ag NR op de celcyclus en apoptose

Na 72 uur blootstelling aan Au@Ag NR werd de toename van het aantal cellen in fase G2/M waargenomen in 4 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR, 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR en Au@Ag NR + NAC-groep, met verhoudingen van respectievelijk 32,63% ± 1.77%, 32.267% ± 2.17% en 32.967% ± 4.25% (Fig. 6a, b), die significant groter waren dan die in de voertuigcontrolegroep (22,37% ±   0,92%). Ondertussen kon celapoptose, geïnduceerd door Au@Ag NR, worden waargenomen na een blootstelling van 72 uur, en het late apoptosepercentage van cellen die werden behandeld met 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR en 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR + NAC was respectievelijk 78,90 ±-1,19% en 70,20 ±-4,50% (Fig. 6c, d). Au@Ag NR induceerde meer late apoptose dan vroege apoptose, en de behandeling van NAC zou de celsnelheid van late apoptose veroorzaakt door Au@Ag NR kunnen verminderen.

Effecten van Au@Ag NR op de celcyclus en apoptose. Effecten van Au@Ag NR op celcyclus (a , b ) en apoptose (c , d ) na respectievelijk 24 uur en 72 uur blootgesteld te zijn; de representatieve gegevens van expressieniveaus van p53 en p21 in HepaRG-cellen van verschillende groepen (e , v Baan 1:voertuigcontrole; Baan 2:Au NR; Baan 3:Au@Ag NR + NAC; Baan 4:Au@Ag NR 20 μg mL ⁻¹ ; Baan 5:Au@Ag NR 4 μg mL ⁻¹ ; Baan 6:Au@Ag NR 0,8 μg mL ⁻¹ ); het gemiddelde relatieve expressieniveau van p53 en p21 tot β-actine in verschillende groepen werd samengevat in (g , v ). ^* P < 0,05 versus voertuigcontrole; ^een P < 0.05 versus Au NR

De expressieniveaus van p21 en p53 werden gedetecteerd door Western-blots en een vergelijkbaar patroon werd waargenomen. De expressieniveaus van p53 en p21 in cellen die zijn behandeld met 4 μg mL ⁻¹ en 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR waren aanzienlijk verhoogd (P < 0.05) en waren significant verlaagd in cellen die werden behandeld met beide 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR en NAC (P < 0,05, vergeleken met 20 μg mL ⁻¹ Au@Ag NR-groep, Fig. 6e–h). Het is bekend dat p53-eiwit een kernmolecuul is dat G2/M-controlepuntactivering medieert als reactie op DNA-schade, en p21 wordt herkend als een p53-afhankelijke celcyclusremmer. De Au@Ag NR zou dus de DNA-replicatie kunnen verstoren en het DNA-herstel kunnen belemmeren door het stoppen van de celcyclus.

Discussie

Op dit moment zijn de rollen van de vrijgegeven Ag ⁺ en AgNP's bij het genereren van genotoxiciteit zijn verre van duidelijk. Eerdere studies van onze groep [21] en anderen [13] hebben aangetoond dat, terwijl Ag ⁺ de belangrijkste bron is voor het introduceren van toxiciteiten, kunnen nanodeeltjes ook zeer giftig zijn. AgNP's zouden bijvoorbeeld kunnen bijdragen aan de genotoxiciteit door de vorming van hydroxylradicalen te induceren [13]. Verder werden ernstigere chromosoombeschadiging, oxidatieve stress en apoptose geïntroduceerd door AgNP in vergelijking met Ag ⁺ alleen [23], wat suggereert dat er verschillende routes bij betrokken kunnen zijn. We gebruikten Au@Ag NR als modelmateriaal om de vormen en distributies van AgNP's in cellen te begrijpen, en de hoeveelheden intracellulair Ag en Au werden bepaald door ICP-MS. De Ag/Au-gewichtsverhouding van bereid Au@Ag NR werd geschat op 2,3. Na een blootstelling van 24 uur nam het echter sterk toe tot 16,5 in de cellen die waren behandeld met Au@Ag NR, wat suggereert dat er in die periode een grote hoeveelheid Ag uit de schaal van Au@Ag NR was vrijgekomen. When the exposure period of Au@Ag NR was extended to 72 h, the Au/Ag weight ratio was decreased to 1.7, indicating that the Ag ⁺ was released from the cell and the nanorod was the major form of Au@Ag NR in the cell at that stage. Therefore, it could be deduced that once the Au@Ag NR entered the cell, Ag ⁺ rapidly dissolved from its shell within 24 h and gradually released to the extracellular environment, while the Au@Ag NR itself retained in the cell for a longer period.

Oxidative stress is deemed as one of the most important toxicological mechanisms of nanoparticles [24]. N-acetylcysteine (NAC) is a thiol, a mucolytic agent and precursor of l-cysteine which reduced glutathione. NAC is also a source of sulfhydryl groups in cells and exerts the ROS scavenger activity by interacting with OH ^· en H₂ O₂ [25]. In this study, the GSH and SOD levels were significantly decreased after exposure to Au@Ag NR, while the MDA level increased in a concentration- and time-dependent manner, indicating that the Au@Ag NR introduced the oxidative stress in the cells.

The potentials of Ag and Au@Ag NR in interfering with the genetic materials were further investigated by a series of genotoxicity assays. It is noteworthy that co-culturing the NAC with Au@Ag NR could ameliorate the ROS formation, which in turn supports the participation of oxidative stress in the genotoxicity triggered by Au@Ag NR. In this study, comet and γ-H2AX assays were performed to confirm that Au@Ag NR could interact with DNA and induce certain DNA damage, and the repair endonuclease Fpg was included in the comet assay to identify the oxidative DNA damage [26]. The Fgp could recognize oxidized pyrimidines and remove oxidized purines, e.g., 8-hydroguanine, so as to create apurinic or apyrimidinic sites that could introduce gaps in the DNA strands. The oxidative stress-induced DNA breakage could be determined subsequently by another comet assay [27]. The further DNA breakage detected by the additional Fgp in the comet assay suggested that the Au@Ag NR could cause DNA damage. Mei et al. [28] observed that 5-nm-sized AgNPs induced oxidative lesion-specific DNA damage by employing the hOGG1, EndoIII and Fpg endonucleases in the comet assay. Li et al. [29] also suggested that both PVP- and silica-coated AgNPs (15–100 nm and 10–80 nm, respectively) could lead to a significant increase in DNA breakage in mice hepatocytes in the presence of hOGG1and EndoIII. The formation of γ-H2AX foci, which represents an early cellular response to genotoxic stress, is the most sensitive and specific biomarker for detecting DSBs [30]. As demonstrated in this study, γ-H2AX foci in cells exposed to Au@Ag NR were markedly increased after 24 h, and a further increase could be observed after 72 h. The reduction in the 20 µg mL ⁻¹ group might be due to the cytotoxicity to the HepaRG cells at higher concentration. Similar results were observed for AgNPs with different coatings [31, 32]. Further, our results suggest that Au@Ag NR could induce chromosome damage in HepaRG cells, as the micronucleus rates were significantly increased. This is consistent with previous studies, where AgNPs-induced increased micronucleus rate was reported in HaCaT and TK6 cells [33]. In contrast, the addition of oxidative radical scavenger NAC could inhibit the formation of micronucleus induced by Au@Ag NR. Taken together, these data suggest the participation of oxidative stress in AgNP-introduced clastogenicity risk in vitro.

Previous studies have investigated the cell cycle arrest and cytotoxicity induced by AgNPs [33,34,35]. With prolonging the exposure time, the impact of AgNPs on cell cycle and apoptosis might be enhanced and in turn aggravate the cytotoxicity and genotoxicity. Usually, the cell cycle checkpoints (e.g., G2/M) were initiated by cells when experiencing DNA damage, and this mechanism serves to prevent the cell from entering mitosis (M phase). The G2/M cell cycle arrest indicates that an increasing percentage of cells is hindered in G2 phase for DNA repairing. Cells experiencing successful DNA repairing would further proceed to mitosis; however, for those with fatal damages, irreversible G2/M cell cycle arrest and cells apoptosis would take place [36]. We observed that Au@Ag NR could arrest the majority of HepaRG cells in G2/M phase, induce late cell apoptosis and increase the expression levels of p53 and p21, which are important proteins associated with the regulation of cell cycles [37]. As p53 could also induce apoptosis, when the DNA cannot be repaired properly [38], the p21 might indirectly participate in cell apoptosis by cell cycle arrest in a p53-dependent pathway via down-regulating the nuclear protein ICBP90 for DNA replication and cell cycle regulation [39]. Furthermore, apoptosis and a G2/M arrest induced by activation of the p53/p21 system have been reported in HepG2 cells following the administration of garlic extracts [40]. Thus, it could be inferred that the oxidative stress-triggered DNA/chromosome damages might facilitate the expression of p53 and p21, which subsequently induces cell cycle arrest. Extending the exposure period of Au@Ag NRs to the DNA/chromosome during replication may further aggravate the genotoxicity or apoptosis.

Conclusion

Genotoxicity induced by AgNPs may be attributed to the oxidative stress induced by the nanoparticles as well as the released ions [41]. This study employed Au@Ag NR as a model to determine the distribution and release behavior of Ag after the nanoparticles enter into the cells. Considering the disparate forms of Au@Ag NR in the cell, after its exposure the Ag ⁺ was rapidly dissolved from the silver shell. Ag ⁺ and Au@Ag NR could introduce cytotoxicity and genotoxicity (clastogenicity) in the cells, and the Au@Ag NR retained in the nucleus may further release Ag ⁺ to aggravate the damage, which are mainly caused by cell cycle arrest and ROS formation (summarized in Fig. 7). Collectively, these data reveal the correlation between the intracellular accumulation, Ag ⁺ release as well as the potential genotoxicity of AgNPs.

Schematic diagram of the possible mechanism of genotoxicity introduced by AgNP in vitro

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Alle gegevens en materialen zijn onbeperkt beschikbaar.