Beheersing van DNA-translocatie via vaste-stof nanoporiën

Tijdelijke oplossing

De DNA-translocatiesnelheid door een nanoporie in vaste toestand is erg snel, tot 0,01–1 μs/base [30], wat leidt tot zeer weinig effectieve gegevens die worden verzameld door commerciële patchklemmen. Als zodanig is het niet mogelijk om elke basis te onderscheiden op basis van het blokkadestroomsignaal. De DNA-translocatiesnelheden van solid-state nanoporiën van 2D-materialen, zoals grafeen, MoS₂ , WS₂ , en h-BN, worden getoond in Fig. 1. Idealiter zou de DNA-translocatiesnelheid in een nanoporie 1-100  bp / ms moeten zijn om een ​​bevredigende opname van het signaal van elk nucleotide mogelijk te maken [32].

DNA-translocatiesnelheid van 2D-nanoporie in vaste toestand [18, 20,21,22,23, 25, 27, 31]. De gestippelde rode lijn geeft een DNA-translocatiesnelheid van 100 bp/ms aan

Tegen deze achtergrond is het vertragen van de translocatiesnelheid van DNA een belangrijk doel dat door veel onderzoekers wordt nagestreefd. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om DNA-translocatie te vertragen om de temporele resolutie van detectie van nanoporiën in vaste toestand te verbeteren. De gebruikelijke methode is om de invloed van experimentele factoren zoals temperatuur [33], elektrolytviscositeit [27], stuurspanning [34], ionenconcentratie [35] en oppervlakteladingsdichtheid van een nanoporie [36] te veranderen door het DNA te veranderen. translocatie er doorheen. Wanunu et al. [33] concentreerde zich op het vertragen van dsDNA-translocatie door nanoporiën in vaste toestand door de temperatuur, spanning en DNA-lengte te veranderen. Bovendien, Feng et al. [27] toonde aan dat een viscositeitsgradiëntsysteem, gebaseerd op ionische vloeistoffen op kamertemperatuur, kan worden gebruikt om de dynamiek van DNA-translocatie te regelen via MoS₂ nanoporiën, en toonde aan dat de hoge viscositeit van ionische vloeistoffen op kamertemperatuur zorgt voor optimale translocatiesnelheden van één nucleotide van 373 bp/ms.

Hoewel veel benaderingen het potentieel hebben om de DNA-translocatiesnelheid te verlagen en ionische stroomdetectie te vergemakkelijken, kunnen ze nog steeds niet voldoen aan de vereisten voor DNA-sequencing. Daarom is het nodig om radicalere methoden te ontwikkelen om de passage van DNA door nanoporiën te controleren. Hier bespreken we de methoden voor het beheersen van de nanoporiestructuur en kwantitatieve DNA-beweging om de temporele resolutie te verbeteren.

Twee nanoporiën-systeem

Onderzoekers hebben systemen met twee nanoporiën gebruikt om translocaties van DNA-moleculen te manipuleren, die hetzelfde molecuul vele malen controleerbaar kunnen detecteren. Twee gestapelde nanoporiën, gescheiden door een holtecompartiment ter grootte van een micrometer [37] (Fig. 2a), kunnen DNA-moleculen gedurende een bepaalde tijd vangen en gecontroleerd vrijgeven. De dynamiek van DNA-moleculen kan worden afgeleid uit signalen van de twee poriën door middel van correlatieanalyse, wat direct elektrisch bewijs levert voor translocatie. Bovendien kan, vanwege de entropiebarrières van het tweelaagse nanoporiënsysteem, de Brownse beweging van DNA-moleculen worden beperkt, wat de nauwkeurigheid van de DNA-sequentiebepaling met nanoporiën kan verbeteren. Vergeleken met detectietechnieken met één molecuul, kunnen DNA-moleculen meerdere keren worden gemeten in tweelaagse nanoporiënsystemen door meerdere poriën serieel te rangschikken in plaats van ze heen en weer te leiden door een enkele porie [39].

een Schema van een tweelaags nanoporiënsysteem dat wordt gebruikt voor DNA-detectie met nanoporiën [37]. b Schema van dubbel-nanoporiesysteem dat wordt gebruikt voor DNA-detectie met nanoporiën [38]

Dubbele nanoporeuze systemen bieden een andere methode om moleculair transport te regelen en moleculen efficiënt tussen twee poriën te overbruggen; ze zijn een labelvrije mechanistische benadering voor DNA-manipulatie [40]. In een systeem met dubbele nanoporiën zijn er twee onafhankelijk adresseerbare en aangrenzende nanoporiën binnen hetzelfde vastestofmembraan. Tijdens de elektroforetisch aangedreven passage van een DNA-molecuul door een van de nanoporiën, kan een enkel DNA-molecuul in beide poriën worden gevangen, wat leidt tot een "touwtrekken" tussen de twee nanoporiën [38] (Fig. 2b). Daarom worden er krachten uitgeoefend op de verschillende uiteinden van een DNA-molecuul, dat zijn beweging vertraagt ​​en zelfs volledig stopt. Het systeem met dubbele nanoporiën opent een nieuwe weg naar de mechanische vangst van DNA in nanoporiën in vaste toestand, en het is een veelbelovende techniek om een ​​breed scala aan biomoleculen te meten met de voordelen dat ze labelvrij zijn en een hoge signaalsterkte hebben. ruisverhouding en lage kosten. Het kan de DNA-moleculen efficiënt opsluiten en opsluiten om DNA-translocatie te vertragen en kan ook worden gebruikt om de fysica van dit touwtrekken op nanoschaal op DNA te bestuderen [41].

Optische val nanopore

Met optische trap-nanoporiën kunnen optische pincetten deeltjes van minder dan tientallen nanometers opvangen. Het maakt het optisch vangen van eiwitten [42], DNA-fragmenten [43] en andere biomoleculen [44], evenals kleine virussen [45] mogelijk. De basistheorie achter optische val nanoporiën is een zelf-geïnduceerde back-action optische val [46]. De laserstraal gefocust op het gebied van de nanoporiën-array zal een lokaal lichtveld met hoge vermogensdichtheid vormen aan de rand van de metaallaag in het gat. Als een deeltje tussen het lokale lichtveld beweegt, kan het een grote verandering in de lokale optische transmissie veroorzaken, wat op zijn beurt een grote optische en diëlektrische kracht op het deeltje zal produceren. Een dubbele nanogatstructuur wordt gebruikt om de groottebottleneck van gevangen deeltjes te doorbreken. Mohammed et al. [47] demonstreerde het potentiële gebruik van optische val-nanoporiën met 20-nm silica en Au-nanodeeltjes. De haltervorm van het dubbele nanogat werd in de Au-film gefreesd en een 25-nm nanoporie werd door de zwevende Si_x geboord. N_j membraan in het midden van het dubbele nanogat, zoals weergegeven in figuur 3a. Elektroforetische kracht die nanodeeltjes door de nanoporie drijft, bij het passeren van de rand van het gat, de zelf-geïnduceerde terugwerkende plasmonische kracht die bestaat tussen de uiteinden van het dubbele nanogat, verzette zich tegen de elektroforetische kracht, waardoor de snelheid van de nanodeeltjes werd verminderd. De resultaten toonden aan dat de optische trapping de elektroforetische translocatietijd met vier ordes van grootte verlengde. Kim et al. [43] realiseerde de optische vangst van plasmide-DNA en lambda-DNA door gebruik te maken van de nanoplasmonische structuren van enkele nanoporiën. De technologie heeft potentiële toepassingen voor DNA-detectie en er kunnen meerdere lokale lichtvelden worden opgezet om parallelle detectie te realiseren. Hoogfrequente ionenstroomoscillatie kan echter de huidige detectieresultaten van DNA beïnvloeden. Dit kan te wijten zijn aan de concurrentie tussen elektroforetische en zelf-geïnduceerde terugwerkende krachten waardoor de nanodeeltjes op en neer drijven door de mond van de nanoporie.

een Schema van de optische val nanopore-chip [47]. b Schema van het zelf-geïnduceerde back-action systeem

Optisch pincet

Optische pincetten kunnen worden gebruikt om moleculaire translocatie door nanoporiën te regelen en zijn de afgelopen jaren veel gebruikt. In 2006 hebben Keyser et al. [48] ​​demonstreerde voor het eerst een moleculair touwtrekken tussen elektroforetische en mechanische krachten door een optische pincet toe te passen om DNA-translocatie door SiN_x te regelen nanoporiën. Dit systeem werkt als een eenvoudige Hooke-veer en de spankracht op de hiel kan worden berekend op basis van de wet van Hooke:F _niet =k _val Z , waar F _niet is de optische kracht, k _val is de valstijfheid langs de verplaatsingsrichting, en Z is de lineaire vervorming van de hiel [48]. De optische pincetmethode, die een DNA-gebonden polystyreenkraal opsluit in de cross-over van een gefocusseerde laserstraal, kan de DNA-gebonden polystyreenkraal in drie dimensies manipuleren en heeft een pico-newton-bereik van krachtgevoeligheid, zoals weergegeven in Fig. 4a . Om het translocatie-DNA in de nanoporie te vangen, werd de spankracht afgestemd om de elektrische veldkracht in evenwicht te brengen (F _el ) op het DNA. Daarom kan de spanning worden gebruikt om zowel de snelheid van DNA-translocatie te verminderen als het DNA-molecuul uit een nanoporie te trekken [52]. Dit systeem maakt gelijktijdige ruimtelijke bemonstering en krachtmetingen met hoge resolutie van nucleïnezuren en eiwitten mogelijk, wat aanzienlijke vooruitgang heeft geboekt in de DNA-sequencing. De techniek van het optische pincet lijdt echter aan verschillende fundamentele problemen. Ten eerste is het moeilijk om op te schalen naar een groot aantal nanoporiën. Ten tweede heeft de verwarming die wordt veroorzaakt door de laser in optische pincetten een sterke invloed op de ionenstroom door een nanoporie en het geluidsniveau, waardoor de optisch opgesloten kraal enkele micrometers verwijderd moet zijn van de nanopore [53].

een Schema van optisch pincet dat wordt gebruikt voor DNA-detectie met nanoporiën [48]. Wanneer het optische pincetsysteem in evenwicht is, zal de optische kracht (F_ot ) is gelijk aan de elektrische veldkracht (F_el ). b Schema van magnetisch pincet dat wordt gebruikt voor DNA-detectie met nanoporiën [49]. Wanneer het magnetische pincetsysteem in evenwicht is, zal de magnetische kracht (F_Mt ) is gelijk aan de elektrische veldkracht (F_el ). c Schema van AFM gebruikt voor DNA-detectie met nanoporiën [50]. d Schema van TFFS gebruikt voor DNA-detectie met nanoporiën [51]

Magnetisch pincet

Magnetische pincetten bieden een andere manier om DNA-translocatie te regelen door middel van trekkracht, en het is aangetoond dat de magnetische pincettechniek effectief is in het vertragen van DNA-translocatie [49]. In dit systeem, zoals getoond in Fig. 4b, kunnen DNA-moleculen worden bevestigd aan een magnetische kraal ter grootte van een micrometer met behulp van sterke goud-thiol [54] of streptavidine-biotine [49] interactie. Vervolgens kan het vrije uiteinde van het DNA in de nanoporie worden gevangen door een aangelegd elektrisch veld. Vervolgens kunnen twee magneten met een kleine opening worden gebruikt om een ​​magnetische veldgradiënt te creëren. Deze techniek kan de elektrische kracht op het ingesloten DNA in evenwicht brengen om translocatiesnelheden en zelfs omgekeerde elektroforese te verminderen. Vergeleken met optische pincetten zijn magnetische pincetten een veelbelovende kandidaat voor massale parallelle krachtspectroscopie. In dit systeem kunnen honderden kralen en dus DNA-moleculen tegelijkertijd worden bestuurd binnen honderden nanoporiën, wat gemakkelijk schaalbaar is tot veel adresseerbare nanoporiën. Dit kan het analytische proces met ordes van grootte versnellen. In vergelijking met optische pincetten is een duidelijk nadeel van de magnetische pincetbenadering echter het gebrek aan driedimensionale controle van de moleculen [55].

Force Sensing-sonde

Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij het regelen van de DNA-translocatiesnelheid door optische pincetten en magnetische pincetten, hebben de methoden voor het vangen van kralen een probleem met Brownse beweging die het moeilijk maakt om de beweging van de kraal te regelen met een resolutie van minder dan 10 nm [51] . Om dit te verhelpen, is AFM gebruikt om de snelheid van DNA-translocatie te regelen [50], en het kan ook tegelijkertijd de kracht en de blokkadestroom meten. In een onderzoek waarbij dit systeem werd gebruikt, zoals weergegeven in figuur 4c, werd DNA vastgemaakt aan de punt van een AFM-sonde en vervolgens in de sondehouder geklemd. Door de beweging van de sonde te regelen, kon de DNA-translocatie worden gecontroleerd om de snelheid te verminderen en zelfs elektroforese om te keren. Bovendien kunnen de metingen worden herhaald door de punt terug te trekken tot een hoogte boven het oppervlak die overeenkomt met de lengte van het molecuul. Met AFM-hulp is DNA-detectie in praktijk en theorie vooruitgegaan omdat de detectieresolutie sterk kan worden verbeterd door de gecombineerde signalen van blokkadestroom en AFM-krachtmetingen [56]. Er is echter nog steeds een obstakel bij de toepassing van nanoporiëntechnieken bij DNA-detectie, namelijk het intermitterend optreden van regelmatige fluctuaties in de kracht (en de stroom) elke 0,35–0,72 nm wanneer een DNA-molecuul op een relatief wrijvingsloze manier door een nanoporie. Deze fluctuaties worden toegeschreven aan individuele nucleotiden die zich door de nanoporie vertalen in een tourniquet-achtige beweging [50].

Studies hebben aangetoond dat een stemvork, die kan worden gebruikt als een krachtdetectiesensor, DNA kan besturen om door een nanoporie te gaan met een snelheid van minder dan nanometer [51, 57]. In een onderzoek waarbij gebruik werd gemaakt van dit geïntegreerde apparaat, zoals weergegeven in figuur 4d, werd een DNA-molecuul bevestigd aan een sondepunt die was vastgelijmd aan een uitsteeksel van een stemvork. Om de stemvork vast te houden [51] werd een nano-positioneringssysteem gebruikt met een nauwkeurigheid tot op de nanometer. De positie van de sondepunt kan worden gedetecteerd door de op een stemvork gebaseerde feedbackkrachtsensor en gecontroleerd door het nanometerpositioneringssysteem te manipuleren. Deze bewegingssnelheid is 10 keer langzamer dan die van DNA dat wordt gemanipuleerd met een optische pincet en 1000 keer langzamer dan DNA dat vrij door nanoporiën in vaste toestand gaat [57]. In vergelijking met conventionele AFM kan een stemvork snellere scanbewegingen bieden en een hoge krachtgevoeligheid hebben wanneer deze in de vloeistof wordt ondergedompeld. Door TFFS met een nanoporie op te nemen, kunnen de ionenstroom door een nanoporie, de puntpositie en de trillingsamplitude van de punt gelijktijdig worden gemeten tijdens de passage van een DNA-molecuul door de nanoporie.

Si-sonde

Alle bovenstaande methoden, namelijk magnetische pincetten, optische pincetten, AFM en TFFS, moeten de positie van de nanoporiën scannen. Ze moeten de nanoporie lokaliseren binnen de effectieve lengte van het DNA om ervoor te zorgen dat het DNA door de nanoporie kan. Adressering van nanoporiën is een belangrijk onderdeel van deze methoden, maar is moeilijk [32] verbonden DNA met een groot oppervlak van een siliciumsonde (Fig. 5), groter dan het gebied van de chip, wat betekende dat ze het geïmmobiliseerde DNA gemakkelijk in een nanoporie zonder te scannen naar de locatie van de nanoporie in het membraan. De haalbaarheid van het gebruik van een DNA-geïmmobiliseerde Si-sonde en positiecontroller om de beweging van DNA in en uit nanoporiën te regelen, is aangetoond. De moeilijkheid van deze methode is dat de Si-sonde in de oplossing wordt ondergedompeld en door de peptidekoppeling met het DNA wordt verbonden. De dichtheid van DNA op het oppervlak van de sonde is moeilijk te controleren, dus het is waarschijnlijk dat meerdere DNA's tegelijkertijd door een nanoporie gaan, wat de detectiestroom beïnvloedt.

Schema van het DNA-geïmmobiliseerde Si-probesysteem dat wordt gebruikt voor DNA-detectie met nanoporiën [32]

Optische pincetten, magnetische pincetten, atomic force microscopie (AFM) en tuning fork-based force sensing (TFFS) kunnen de werkelijke krachten en positie van het molecuul in de nanopore detecteren, wat veelbelovend is om de DNA-passage door nanoporiën met de juiste snelheid te regelen. De moeilijkheid om nanoporiën aan te pakken wordt vermeden door een Si-sonde te gebruiken. Bovendien is het gebruik van een systeem met twee nanoporiën een haalbare methode om de DNA-passage door nanoporiën te controleren en te vertragen. Bovendien heeft een optische val-nanoporie potentieel voor DNA-detectie in de toekomst. Hier hebben we de DNA-translocatiesnelheid van een solid-state nanoporie samengevat die is geïntegreerd met enkele DNA-controlemethoden, zoals een twee-nanoporiesysteem, optische val nanoporie, optische pincet, magnetische pincet, AFM, TFFS en Si-sonde (tabel 1) .