Krachtige anti-tumor immunostimulerende biocompatibele nanohydrogel gemaakt van DNA
Abstract
Niet-gemethyleerde CpG-oligodeoxynucleotiden zijn krachtige immunostimulerende motieven bij het activeren van zowel het aangeboren als het verworven immuunsysteem door het induceren van Th1-type antigeenspecifieke T-celreacties, maar hun instabiliteit in serum heeft een grote invloed op hun immunostimulerende efficiëntie. Hier hebben we een nieuwe immuno-DNA-nanohydrogels geconstrueerd die bestaat uit tandem-herhalingssequenties van CpG-eenheden genaamd CpG-MCA nanohydrogels door middel van multi-primed ketenamplificatie. Van CpG-MCA nanohydrogels is bewezen dat ze weerstand bieden aan degradatie en de proliferatie en migratie van murine macrofaag-achtige RAW264.7-cellen verhogen. Bovendien induceerden CpG-MCA-nanohydrogels effectief hoge expressie van tumornecrosefactor-α en interleukine-6, en remden opmerkelijk de proliferatie van U251-cellen, wat suggereert dat CpG-MCA-nanohydrogels naar verwachting zullen worden gebruikt als het krachtige antikanker-immunostimulant. /P>
Bacterieel DNA dat niet-gemethyleerde CpG-motieven bevat, zijn zeer veelbelovende vaccinadjuvantia, anti-allergenen en immuunbeschermende en kankerbestrijdende middelen [1]; het kan worden herkend door receptoren op endosomale cellen van het immuunsysteem, zoals dendritische cellen (DC), macrofagen, T-cellen, natural killer (NK)-cellen en NKT-cellen [2]. Deze aangeboren immuuncellen kunnen reageren op niet-gemethyleerde CpG-motieven door de herkenning van pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) voor pathogeen-specifieke moleculen in het pathogene micro-organisme. Er was bevestigd dat CpG-oligonucleotide (CpG-ODN) herkend kon worden door Toll-like receptor 9 (TLR9) [3] en een Th1-type immuunrespons induceerde via Myd88-afhankelijke signaalroute [4]. Deze nadelen van CpG-ODN belemmerden echter de klinische toepassing ervan vanwege de prematuratie door eiwitadsorptie, vertering door endonucleasen in serum [5] en instabiliteit in vivo. Deze problemen zullen naar verwachting worden opgelost door enkelstrengs (ss) nucleïnezuur in te kapselen in een afgiftedrager of het zelf-assemblerend te maken tot een nanostructuur die de stabiliteit in vivo verbetert, evenals een efficiëntere internalisatieverhouding voor aangeboren immuuncellen. Momenteel werden verschillende dragers zoals kationische polymere polyethyleeniminen (PEI) [6], liposomen [7, 8] en microdeeltjes [9] gebruikt voor de afgifte van CpG-ODN; er zijn nog enkele nadelen die nog moeten worden verbeterd, zoals de cytotoxiciteit, beperkte laadsnelheid en dergelijke.
DNA-materialen die bestaan uit nucleïnezuur vertonen een groot potentieel om te worden gebruikt als dragers voor het afleveren van CpG-ODN. Vergeleken met ssDNA vertonen DNA-materialen met een tweedimensionale of driedimensionale structuur verschillende eigenschappen, zoals gemakkelijke penetratie van celmembranen en stimulering van macrofagen om cytokinen uit te scheiden [10]. X-vormig DNA werd gebruikt om CpG-motieven af te leveren en met succes de immunostimulerende activiteit van CpG-ODN te verhogen door verhoogde cellulaire opname, terwijl de verhoogde cellulaire opname gedeeltelijk te wijten is aan de X-vormige structuur [11]. Evenzo werd een driedimensionale DNA-tetraëdrische die zelf kan worden geassembleerd tot nanostructuren met uniforme afmetingen niet-invasief en efficiënt ingevoerd in RAW264.7-cellen om te functioneren. Bovendien bleek een dergelijke tetraëdrische vorm mechanisch stabiel en niet-cytotoxisch te zijn volgens het onderzoek [12]. Onlangs is aangetoond dat CpG-RCA-hydrogel (CpG-RCA-gel) met een nanobloemstructuur bereid door middel van rollende cirkelamplificatie (RCA) in staat was om een immuunstimulerend signaal af te geven, degradatie van nuclease te weerstaan, de secretie van immuuncytokinen te verhogen, en remmen de proliferatie van humane acute lymfatische leukemie T-lymfocyten (CCRF-CEM) cellen [13]. Deze bovenstaande resultaten suggereerden dat de vorm en structuur van DNA-materialen een belangrijke rol speelden bij het verbeteren van de cellulaire opname en het verhogen van de efficiëntie van de immuunstimulatie. Omdat CCRF-CEM-cellen afkomstig zijn van menselijke T-lymfoblastleukemie, een type hematologische maligniteit, was het anders dan een hematologische kwaadaardige tumor; solide tumoren omgeven vaak met een immunosuppressieve micro-omgeving die een geldige anti-tumor immuniteit kan belemmeren [14]. Hiervoor hebben we een DNA-immunostimulerend middel geconstrueerd dat veel meer kopieën van CpG-ODN bevat door middel van multi-primed chain amplification (MCA) [15] in plaats van RCA [16]. Gebruikmakend van het principe van complementaire basenparing, werden CpG-betrokken primer en specifiek ontworpen matrijssequentie gemengd tot ligase en verlengd met phi29-polymerase in aanwezigheid van vrije dNTP's. RCA (R) of MCA (M) reageerde voor x of y uren afzonderlijk worden weergegeven als Rx of My (Fig. 1); de producten werden geïdentificeerd door agarosegelelektroforese (figuur 2a). Op basis van de MCA-reactie noemden we de verkregen producten CpG-MCA-hydrogels (CpG-MCA-gels) die honderden of duizenden tandem-CpG's bezitten vanwege de grote toename van CpG-motiefkopieën. CpG-MCA-gels waren ook een krachtige immunostimulant die de secretie van cytokinen uit RAW264.7-cellen significant verhoogde en de proliferatie van menselijke glioma U251-cellijnen effectief remde. We verwachtten dat deze studie leidt tot een nieuwe nanohydrogel-immunostimulerend middel op basis van DNA-materialen en promootte de toepassing ervan voor tumorimmunotherapie [17].
De afbeeldingen van CpG-MCA-gels en CpG-RCA-gel. een Afbeelding van agarosegelelektroforese van CpG-RCA-gel (R12) en CpG-MCA-gels (R4M4 en R4M8). Baan 1, DNA MW-standaardmarker a-Hind III-digest; baan 2, R12; baan 3, R4M4; baan 4, R4M8, baan 5, DL5000 DNA-marker. SEM-afbeeldingen van R12 (b ), R4M4 (c ), en R4M8 (d ). TEM-afbeeldingen van R12 (e ), R4M4 (f ), en R4M8 (g ). Zwarte schaalbalk is 3 m; rode schaalbalk is 1 m; witte schaalbalk is 500 nm
De beelden van confocale microscoop en gemiddelde fluorescentie-intensiteit in RAW 264,7-cellen die zijn behandeld met CpG-ODN, CpG-RCA-gel (R12) en CpG-MCA-gels (R4M4 en R4M8) (100 nM CpG-equivalenten). CpG-MCA-gels en CpG-RCA-gel werden gelabeld met Cy5 (rood) door Cy5-dCTP toe te voegen voor hun cellulaire opname. Cy5-gelabeld CpG-ODN werd gebruikt als controlegroep. een Confocale microscopiebeelden van CpG-RCA-gel en CpG-MCA-gels door RAW 264,7-cellen na 2 uur geïncubeerd. b De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van Cy5 in RAW264.7-cellen. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten. ****P < 0.0001
Alle oligonucleotiden werden gekocht bij Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. en gezuiverd door middel van hogedrukvloeistofchromatografie. dNTP-sets (elk 100 mM), phi29 DNA-polymerase (10 U/μL) en 10 × phi29 DNA-polymerasereactiebuffer (330 mM Tris-acetaat (pH 7,9 bij 37 °C), 100 mM Mg-acetaat, 660 mM K-acetaat , 1% (v /v ) Tween 20, 10 mM DTT) werden gekocht bij Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, VS). T4 DNA-ligase (400 U/μL), 5′-triphosadenine (ATP) en 10× T4 DNA-ligasereactiebuffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 , 1 mM ATP, 10 mM DTT, pH 7,5 bij 25°C) werden gekocht bij New England Biolabs, Inc. (Ipswich, MA). Cyanine 5-dCTP werd gekocht bij PerkinElmer, Inc. (Waltham, MA, VS). Amicon Ultra-0,5 centrifugale filterapparaten werden gekocht bij Merck KGaA (Darmstadt, Duitsland). Het water dat in dit papier wordt gebruikt, is gezuiverd door het Millipore Synergy UV Ultrapure waterzuiveringssysteem. Gibco foetaal runderserum (FBS), Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium (DMEM, met hoge glucose, L-glutamine, fenolrood, natriumpyruvaat, zonder HEPES), trypsine-EDTA (0,25%) en penicilline (10000 U/mL)- streptomycine (10000 g / ml) werd gekocht bij Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, VS). ELISA-kits werden gekocht bij R&D Systems, Inc. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) werd gekocht bij Dojindo (Kumamoto, Japan). De muis macrofaag-achtige cellijn (RAW264.7-cellen) werd verkregen van de celbank van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China). De menselijke glioomcellijnen (U251-cellen) werden verkregen van de celbank van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China).
Lang enkelstrengs DNA met een gefosforyleerde groep aan het 5'-uiteinde met gelijke verhouding CpG-ODN-primers (primer 1) werden gemengd in 1 x phi29-reactiebuffer en gedurende 5 minuten bij 95 ° C gegloeid en langzaam afgekoeld tot 4 ° C bij een snelheid van -1 °C/sec met behulp van een thermische cycler (Bio-Rad T100, Duitsland). Na de annealing werd 20 U/μL T4 DNA-ligase met ATP en T4 DNA-ligasereactiebuffer toegevoegd en een nacht bij 4 °C geïncubeerd. Enzymen waren 10 min. inactief bij 75°C.
Een cirkelvormige DNA-template (10 L) werd gemengd met 1 x phi29 DNA-polymerasereactiebuffer, 4 mM dNTP voor elk, en 5 U phi29 DNA-polymerase en steriel DDW werden toegevoegd, in totaal 50 μL. Het mengsel werd gedurende 12 uur bij 30°C onder schudden geïncubeerd (R12). Voor de MCA-gelvorming werd na een RCA-reactie van 4 uur vervolgens 500 pM primer 2 en primer 3 toegevoegd aan het resulterende mengsel om gedurende de rusturen bij 30 ° C te worden geïncubeerd zonder toevoeging van extra reagentia (R4M4 en R4M8). Het phi29-polymerase werd gedurende 10 min. bij 65 °C geïnactiveerd. De CpG-RCA-gel en CpG-MCA-gels werden gezuiverd door ultrafiltratie.
De concentratie van CpG-MCA-gels en CpG-RCA-gel werd gemeten op basis van het aantal CpG-kopieën dat betrokken was bij alle hydrogels in de behandelingsgroep. Aangezien dNTP toegevoegd aan het reactiesysteem 4 mM voor elk was, bevatte één cirkelvormig sjabloon 81 nucleotiden en 1 kopie van CpG. Als Abs de absorptie is van dNTP bij 260 nm en ε is de extinctiecoëfficiënt van dNTP bij 260 nm, dan kan de verbruikte dNTP in de reactie worden gemeten en kan het totale aantal kopieën van CpG worden berekend met de volgende vergelijking:CpG-kopieën = (4 mM × 4 − Abs/ε × 1.000.000)/81 [13]. Abs en ε van dNTP werden gemeten met NanoDrop 2000c.
Agarosegelelektroforese werd gebruikt om de vorming en afbraak van CpG-MCA-gels en de vorming van een cirkelvormig sjabloon te evalueren. Hydrogels werden uitgevoerd op 1% agarosegel bij 100 V gedurende 60 V en de cirkelvormige sjabloon werd gelopen op 3% agarosegel bij 100 V gedurende 60 V.
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, Hitachi HT7700, Japan) werd gebruikt om de binnenstructuur en geschatte grootte van de CpG-MCA-gels te karakteriseren. CpG-MCA-gels werden gedurende 30 min met ultrageluid onderzocht voordat ze op koper werden afgezet en gedroogd. De tests werden uitgevoerd in het centrumlaboratorium van het Renji-ziekenhuis. Scanning-elektronenmicroscopie (SEM, Hitachi SU8020, Japan) werd gebruikt om de morfologie van de CpG-MCA-gels te verkrijgen. CpG-MCA-gels werden gedurende 30 min met ultrageluid onderzocht voordat ze op een schone siliciumwafel werden afgezet, en het monster werd met een metaalcoating bedekt met Au.
Celopname werd in beeld gebracht door een Leica confocale microscoop. RAW264.7-cellen werden gezaaid op een confocale petrischaal met een dichtheid van 2 × 10
5
cellen/ml. Na tweemaal wassen met fosfaatbuffer (PBS), werden de cellen gedurende 2 uur bij 37 ° C geïncubeerd met 100 nM Cy5-gelabelde CpG-ODN, CpG-RCA-gel en CpG-MCA-gels in vers DMEM-medium. Cellen werden vervolgens drie keer gewassen met PBS en gedurende 30 min gefixeerd met 4% paraformaldehyde, vervolgens werden cellen gekleurd met FITC-phalloidin en Hoechst 33342. Alle beelden werden genomen met behulp van een Leica laser confocale microscoop. De semi-kwantitatieve gemiddelde fluorescentie-intensiteit werd berekend door Image J, een op Java gebaseerde applicatie voor het analyseren van afbeeldingen.
RAW264.7-cellen werden gezaaid met een dichtheid van 7 × 10
4
cellen/mL in een 24-wells plaat gekweekt voor 24 h voor gebruik. De cellen werden geïncubeerd bij aanwezigheid van CpG-MCA-gels en andere groepen bij 37°C gedurende 8 uur voor TNF-a en 24 uur voor IL-6; de supernatanten werden verzameld. De niveaus van cytokines in de supernatanten werden gedetecteerd door enzymgekoppelde immunosorbent-assay (ELISA) volgens protocollen die door de fabrikant werden voorgesteld.
Genexpressieniveaus werden bepaald door kwantitatieve real-time PCR (Q-PCR). RAW264.7-cellen werden gezaaid met een dichtheid van 1 × 10
6
cellen/mL in een 6-wells-plaat gekweekt voor 24 h voor gebruik. Cellen werden geïncubeerd bij aanwezigheid van CpG-MCA-gels en andere groepen bij 37 ° C gedurende 2 uur voor TNF-a en TLR9 en 8 uur voor IL-6 en andere. Isolatie en zuivering van mRNA werden uitgevoerd met behulp van TRIzol-reagens (Thermo Fisher Scientific). Geëxtraheerd mRNA werd gekwantificeerd door NanoDrop 2000c. Eén microgram totaal RNA werd omgekeerd getranscribeerd met behulp van PrimeScript RT-reagenskit met gDNA Eraser (Takara Bio Inc.); amplificatie werd uitgevoerd in een totaal reactievolume van 20 L, met behulp van TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio Inc) volgens de instructies van de fabrikant. Primers voor genen zijn als volgt:GAPDH:F:AGGTCGGTGTGAACGGATTTG; R:TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA; TLR9:F:ATGGTTCTCCGTCGAAGGACT; R:GAGGCTTCAGCTCACAGGG; TNF-a:F:GACGTGGAACTGGCAGAAGAG; R:TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG; IL-6:F:CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC; R:CTGTTGTTCAGACTCTCTCCCT; CD86:F:GAGCTGGTAGTATTTTGGCAGG; R:GGCCCAGGTACTTGGCATT; CD206(MRC1):F:CTCTGTTCAGCTATTGGACGC; R:CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTC.
RAW264.7-cellen werden gezaaid met 70 μL met een dichtheid van 5 × 10
5
cellen/mL in cultuur-inserts gedurende 24 h voor gebruik. Vervolgens werden de inzetstukken voorzichtig verwijderd en werden de cellen twee keer gewassen voordat ze met elke groep in een vers medium werden behandeld. Foto's werden verzameld in 0 uur, 6 uur en 24 uur; het wondgebied werd gemeten door ImageJ. Elke groep had drie herhalingen en het experiment werd drie keer herhaald.
Cytotoxiciteit werd getest met CCK8. RAW264.7-cellen werden gezaaid in platen met 96 putjes en gedurende 24 uur met elke groep behandeld. Vervolgens werd 10 L CCK8-oplossing aan elk putje toegevoegd, gevolgd door 1-2 uur incubatie bij 37 ° C. De absorptie werd gemeten bij 450 nm, elke groep had drie herhalingen en het experiment werd drie keer herhaald.
RAW264.7-cellen werden in de bovenste kamers gezaaid en U251-cellen werden afzonderlijk in de onderste kamers gezaaid en gedurende 24 uur voorafgaand aan de behandeling geïncubeerd. Na drie keer wassen met PBS werden 1 M GpC-ODN, CpG-ODN, CpG-RCA-gel en CpG-MCA-gels in het verse medium gedurende de aangegeven tijd in zowel de bovenste als de onderste kamers toegevoegd. De U251-cellen in de onderste kamers werden verzameld en voerden het plaatkloneringsexperiment uit.
Het effect op de proliferatie van U251-cellen van samen gekweekt met RAW264.7-cellen werd geanalyseerd met plaatkloneringsexperimenten. U251-cellen op de onderste kamers werden verzameld en verdund met meerdere verhoudingen in DMEM met 15% FBS op een uiteindelijk aantal van 200 cellen/putje op een kweekplaat met 6 putjes en bleven gedurende 2 weken kweken totdat de kloonclusters konden worden waargenomen door blote ogen (meer dan 50 cellen/kloon). Na voorzichtig wassen met PBS werden de cellen gedurende 30 min gefixeerd met 4% paraformaldehyde en vervolgens gedurende 1 uur gekleurd met kristalviolet. Clusters die meer dan 50 cellen bevatten, zouden in de telling worden opgenomen als een succesvolle kloonvorming. De experimenten werden drie keer herhaald en elk experiment had drie herhalingsputjes:kloonvormingssnelheid = (kloonvormingsaantal/geënte celaantal) × 100%.
Gevriesdroogde CpG-MCA-gels of CpG-RCA-gel werden in 400 L DMEM met respectievelijk 10% foetaal runderserum (10% FBS-DMEM) gedaan en 24 uur bij 37 ° C geïncubeerd; de DNA-concentraties in het supernatant werden gemeten met NanoDrop 2000c na 10 s te zijn gecentrifugeerd bij 1000 rpm. De resterende hydrogels werden berekend volgens de DNA-concentraties in het supernatant. De resterende gel = (m − c × V )/m × 100%, waar m is de gelmassa die we hebben toegevoegd, c is de DNA-concentratie in het supernatant, en V is het volume van het supernatant. CpG-MCA-gels of CpG-RCA-gel werden respectievelijk in 10% FBS-DMEM of PBS gedaan en gedurende 12 uur of 24 uur bij 37 ° C geïncubeerd. Na incubatie werden de gels gedurende 60 min op 1% agarosegel bij 100 V gelopen.
Enkelstrengs CpG-ODN werd gesynthetiseerd door Sangon Company (Beijing, China) en gezuiverd met behulp van hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC). De CpG-ODN die in deze studie werd gebruikt, was CpG-ODN 1668 [18]:5'-TCCATGACGTTCCTGATGCT, en de niet-CpG-oligonucleotiden werden GpC-ODN [18] genoemd:5'-TCCATGAGCTTCCTGATGCT.
Alle gegevens in deze studie worden weergegeven als gemiddelde waarden ± standaarddeviatie (gemiddelde ± SD) van twee of drie onafhankelijke experimenten. Statistische analyse tussen verschillende groepen werd uitgevoerd via een Student's t test. De statistische significantie werd ingesteld op P < 0,05 (95% betrouwbaarheidsniveau).
Het DNA-immunostimulerend middel werd met succes geconstrueerd via MCA-reactie [16]. In deze reactie is de eerste en belangrijke stap vóór isotherme amplificatie de cyclisatiereactie van een lange enkelstrengs (ss) sjabloon (schema 1). We gebruikten agarosegelelektroforese om de vorming van circulair DNA te bevestigen na annealing en ligatie met een primer (aanvullend bestand 1:figuur S1). De migratieafstand tussen de primer en de lange ssDNA-template werd korter omdat de structuur veranderde nadat de template een cyclus werd en met primer werd geligeerd. De MCA-reactie bevat een reeks herhalende eenheden in serie en leidt gemakkelijk tot het verschijnen van nanobloemen vanwege de continue wikkeling (schema 1). Resultaten van agarosegelelektroforese toonden aan dat de producten van RCA-reactie (CpG-RCA-gel of R12) en MCA-reactie (CpG-MCA-gel of R4M4 / R4M8) succesvol werden verkregen (figuur 1a). CpG-RCA-gel en CpG-MCA-gels waren moeilijk te migreren door de agarosegel en bleven in de thuispositie. Beide gels waren te plakkerig, dus werden ze eruit getrokken als zijde toen we ze pipetteren (aanvullend bestand 1:figuur S2A–C). Deze resultaten suggereerden dat de DNA-matrijs exponentieel wordt geamplificeerd met vrije dNTP's om een hydrogel te vormen [15]. Het is vermeldenswaard dat de migratieafstand geen significant verschil maakte tussen de CpG-RCA-gel en CpG-MCA-gels. Bovendien toonden SEM- en TEM-resultaten verder aan dat de diameter van CpG-RCA-gel (Fig. 1b, e) en CpG-MCA-gels (Fig. 1c, d, f en g) varieerden van nanoschaal tot micrometerschaal, en vertoonden een morfologie van nanoflowers. De CpG-ODN moet worden geïnternaliseerd in TLR9-positieve immuuncellen en interageren met TLR9 die zich in de endosomen in immuuncellen bevindt om zijn immunostimulerende activiteit uit te voeren. Hiervoor hebben we Cy5-gelabelde CpG-ODN, CpG-RCA-gel en CpG-MCA-gels gebruikt om hun opname in de RAW264.7-cellen te onderzoeken met behulp van confocale microscopie. Zoals waargenomen in Fig. 2a, waren Cy5-gelabelde CpG-MCA-gels effectief geïnternaliseerd en gedistribueerd in het cytoplasma van RAW264.7-cellen. Op basis van de gemeten gemiddelde fluorescentie-intensiteit was de opname-efficiëntie van CpG-MCA-gels significant verhoogd (P <-0,0001) vergeleken met die van CpG-ODN (Fig. 2b), wat de effectieve opname van CpG-MCA-gels aantoont, wat gunstig is voor het uitoefenen van sterkere immuunstimulatie. Het is gemeld dat de opname van DNA door muizenmacrofaag RAW264.7-cellen werd verhoogd door verschillende DNA-nanostructuren te ontwerpen. Zoals tetrapod-achtig gestructureerd DNA (tetrapodna), tetraëdrisch DNA (tetraëder) en tetragonaal DNA (tetragon) [19]. Evenzo werd bewezen dat X-vormig DNA, Y-vormig DNA en X-DNA hydrogel de opname van DNA door cellen verhogen [20, 21]. Deze resultaten suggereerden dat hogere-orde structuren van DNA efficiëntere vormen waren om gefunctionaliseerde DNA-fragmenten af te leveren. We speculeerden daarom dat de hoge cellulaire opname van CpG-MCA-gels afkomstig was van de verandering van de vorm van CpG-MCA-gels door gelvorming. Vervolgens hebben we de stabiliteit van CpG-MCA-gels getest. CpG-MCA-gels werden gedurende verschillende tijd in verschillende oplossingen bij 37 ° C geïncubeerd. Resultaten van agarosegelelektroforese toonden aan dat CpG-MCA-gels relatief stabiel waren in PBS-oplossing en gedeeltelijk werden afgebroken in medium betrokken serum (aanvullend bestand 1:figuur S3A). CpG-MCA-gels vertoonden nog steeds een ladder in plaats van een enkele band, wat een onvolledige afbraak suggereerde. Vervolgens hebben we de stabiliteit van gels onderzocht in 10% FBS-DMEM. TEM-resultaten bevestigden dat CpG-MCA-gels gedeeltelijk verteerd waren en niet langer op bloemen lijken, maar nog steeds de vorm behouden (aanvullend bestand 1:figuur S2D-F). De degradatiecurve van CpG-MCA-gels werd uitgezet door de concentratie van DNA in het supernatant binnen 24 h te detecteren (aanvullend bestand 1:figuur S3B). Er werd aangetoond dat na een incubatie gedurende 24 u in 10% FBS-DMEM, R12 bijna 80% behield, terwijl R4M4 en R4M8 bijna 85% bleven, wat overeenkwam met de resultaten van de agarosegelelektroforese. Om de afbraak van gels te bevestigen, werden CpG-MCA-gels geïncubeerd bij 37 ° C tot 48 uur in serum, en de productie van afbraak werd uitgevoerd in agarosegelelektroforese (aanvullend bestand 1:figuur S4). Gels zien er niet langer uit als ladders omdat ze door het enzym in het serum in stukjes werden verteerd en hun viscositeit verloren en zelfs losse nucleotiden werden, wat suggereert dat CpG-MCA-gels biologisch afbreekbaar zijn omdat ze kunnen worden verteerd in de aanwezigheid van foetaal runderserum ( FBS). Dienovereenkomstig weerstaan CpG-MCA-gels effectief de serumvertering binnen 24 h en worden uiteindelijk volledig afgebroken. Het hoge vermogen om degradatie te weerstaan, zal helpen om de immuunstimulerende efficiëntie te verbeteren; de expressieniveaus van TNF-α en IL-6 in het supernatant van RAW264.7-cellen toonden ook duidelijk aan dat CpG-MCA-gels cellen effectief konden stimuleren om immuuncytokinen te produceren.
De schematische illustratie van de voorbereiding en cellulaire opname van CpG-MCA-gels en CpG-RCA-gel. Lang enkelstrengs DNA met een gefosforyleerde groep aan het 5'-uiteinde werden gemengd met primers bestaande uit CpG-motieven, werden eerst versmolten en geligeerd door T4-DNA-ligase om een cirkelvormige matrijs te vormen. RCA- en MCA-reactie werd uitgevoerd door phi29 DNA-polymerase om een grote hoeveelheid sequentieel concatemeer-DNA te genereren en te convolueren zoals veel nanobloemen. Gels kunnen dan worden opgenomen door macrofagen en de secretie van cytokinen stimuleren
De immuunstimulerende werkzaamheid van CpG-MCA-gels werd verder geëvalueerd, we behandelden RAW264.7-macrofagen met GpC-ODN (de sequentie veranderde van effect GACGTT in GAGCTT) [22], CpG-ODN, CpG-RCA-gel en CpG- MCA gels en detecteerde vervolgens de expressie van TNF-α en IL-6. De concentratie van TNF-α in het supernatant van RAW264.7-cellen die gedurende 8 h waren geïncubeerd met CpG-RCA-gel (R12) en CpG-MCA-gels (R4M4 en R4M8) wekte een veel hoger niveau van TNF-α op dan CpG-ODN in de dezelfde behandelingsconcentratie (Fig. 3a). Voor de CpG-MCA-gels induceerde R4M8 in plaats van R4M4 een hoger niveau van TNF-α-secretie (P <-0,001), wat suggereert dat de secretie van TNF-α toenam naarmate de kopieën toenamen. Bovendien induceerde R4M8 een significante (P < 0,001) hogere concentratie TNF-α dan R12, wat aangeeft dat CpG-MCA-gels krachtigere stimulatoren zijn dan CpG-RCA-gels wanneer de totale reactietijd gelijk is. Dezelfde trend werd ook gevonden bij de detectie van IL-6 (figuur 3d). De secretie van IL-6 gestimuleerd door CpG-MCA-gels en CpG-RCA-gel was significant verhoogd. De secretie van IL-6 in de groepen R12, R4M4 en R4M8 was 2,97 keer (P < 0.0001), 4.39 keer (P < 0,0001), en 27,81 keer (P <-0,0001) daarvan in respectievelijk de CpG-ODN-groep. De secretie van IL-6 in de R4M8-groep was 6,33 keer (P < 0.0001) daarvan genoteerd in de R4M4-groep en 9,36 keer (P <-0,001) van die genoteerd in de R12-groep. Het is vermeldenswaard dat de secretie van IL-6 geen significant verschil vertoonde tussen de CpG-ODN-, GpC-ODN- en controlegroepen. Deze resultaten bevestigden dat een hogere efficiëntie van vrijgemaakt TNF-a en IL-6 werd waargenomen bij RAW264.7-cellen die waren behandeld met CpG-MCA-gels in plaats van bij CpG-ODN. Verder werd ook het effect van CpG-MCA-gels met een andere concentratie op cytokinesecretie onderzocht, en we vonden dat de secretie van TNF-α en IL-6 toenam met de concentratie van gels (Fig. 3b, e). Het immuunstimulerende vermogen van de niet-CpG-gels (aangeduid als R12-C, R4M4-C en R4M8-C in Fig. 3c) en GpC-ODN toonden aan dat ze nauwelijks de afscheiding van TNF-α induceerden (Fig. 3c), wat aangeeft dat de immuunresponsen die worden geïnduceerd door CpG-MCA-gels het gevolg zijn van de CpG-motieven.
Detectie van cytokinen die vrijkomen uit RAW264.7-cellen gestimuleerd met CpG-ODN, CpG-RCA-gel en CpG-MCA-gels met behulp van ELISA-kit. een De afscheiding van TNF-α uit RAW264.7-cellen. b De afscheiding van TNF-α uit RAW264.7-cellen na behandeling met verschillende concentraties CpG-MCA-gels. c Detectie van het immunostimulerende vermogen van CpG-gels en niet-CpG-gels (R12-C, R4M4-C en R4M8-C). d De uitscheiding van IL-6 uit RAW264.7-cellen. e De afscheiding van IL-6 uit RAW264.7-cellen na behandeling met verschillende concentraties MCA-gels. Resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD van twee onafhankelijke experimenten. **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001
Vervolgens hebben we de mRNA-expressie van cytokinen, celoppervlaktemarkers en TLR-9 getest. Het TNF-α-mRNA in de CpG-ODN-groep was 1,25 keer de expressie die werd gedetecteerd in de controlegroep, en de veelvoud van verandering in R12-, R4M4- en R4M8-groepen was 3,28 keer (P < 0.01), 2.53 keer (P < 0.05) en 4.57 keer (P <-0,001) daarvan werd afzonderlijk in de CpG-ODN-groep getest (aanvullend bestand 1:figuur S5A). De mRNA-expressie van IL-6 in de CpG-ODN-groep was 1,01 keer zoveel als die in de controlegroep. De IL-6-mRNA-expressie in de R12-, R4M4- en R4M8-groepen was 3,87 keer (P < 0.01), 4.63 keer (P < 0.05) en 23.04 keer (P < 0,0001) evenveel als die in respectievelijk de CpG-ODN-groep (aanvullend bestand 1:figuur S5B).
De mRNA-expressie van TLR-9, de receptor van CpG in cellen [4], nam ook toe in alle groepen in vergelijking met de controlegroep, maar de CpG-MCA-gelgroepen verbeterden opmerkelijk de mRNA-expressie van TLR-9 in vergelijking met de CpG -ODN-groep (aanvullend bestand 1:Afbeelding S5C). Naast cytokines en TLR9 hebben we ook co-stimulerende moleculen (CD) CD86 en CD206 gedetecteerd, die werden gebruikt om respectievelijk pro-inflammatoire (M1) en groeibevorderende (M2) macrofagen te taggen [23]. Er werd vastgesteld dat er geen significant verschil was tussen de CpG-ODN-groep en de controlegroep in CD86 of CD206 (aanvullend bestand 1:figuur S5D, E). Vergeleken met de CpG-RCA-gelgroep, nam CD86 in de CpG-MCA-gelgroepen in verschillende mate toe, terwijl CD206 in verschillende mate afnam, en de R4M8-groep nam het meest toe en af, wat suggereert dat RAW264.7-cellen behandeld met CpG-MCA-gels zijn vatbaar voor differentiatie in M1-populatie met CD86-oppervlaktemarker, die het immuunstimulerende vermogen van CpG-MCA-gels verder bevestigde.
De afscheiding van cytokinen door macrofagen is uiterst belangrijk bij de respons van immuunstimulatie en bij de proliferatie en migratie van macrofagen. De stimulatie van macrofagen met CpG-ODN zou de productie van ontstekingsremmende cytokinen verhogen via een TLR9-afhankelijke route. De door CpG-ODN geïnduceerde cytokinen verhoogden de migratie van macrofagen en bevorderden de proliferatie van macrofagen door de expressie van een negatieve regulator van de celcyclus te verlagen [24]. CpG-ODN induceerde ook de expressie van plasminogeenactivatorremmer type-1 (PAI-1) in macrofagen, wat resulteerde in een verhoogde migratie door vitronectine [25]. We hebben ook het vermogen van CpG-MCA-gels om macrofagen te laten migreren verder onderzocht en hun cytotoxiciteit geëvalueerd. De migratie van RAW264.7-cellen werd geïnduceerd door CpG-MCA-gels in zowel het transwell-migratiesysteem (figuur 4a) als de kraswondmigratie-assay (figuur 4b). RAW264.7-cellen werden gekweekt in de aanwezigheid of afwezigheid van CpG-MCA-gels en men liet ze 24 uur migreren. Het migratieaantal macrofagen in de CpG-MCA-gelgroepen was veel meer dan dat in de CpG-ODN-groep (figuur 4a). Daarna gingen we verder met de kraswondmigratietest; cellen mochten 24 uur migreren en foto's werden vastgelegd in 0 uur, 6 uur en 24 uur. De resultaten toonden aan dat het krasgebied kleiner werd naarmate de wond genas. Migratie van macrofagen bij 6 h toonde aan dat de CpG-MCA-gels effectiever waren dan de CpG-ODN-groep omdat de wondgenezingsverhouding hoger was, maar er is geen duidelijke significantie tussen de R12-, R4M4- en R4M8-groepen (aanvullend bestand 1:Afbeelding S6A, B). En het krasgebied bij 24 h bevestigde dat de genezingssnelheid van het krasgebied in de CpG-ODN-groep 1,70 keer was (P <-0,05) daarvan in de controlegroep, en de genezingssnelheid in de R12-, R4M4- en R4M8-groepen was 1,63 keer (P < 0,001), 1,63 keer (P < 0,0001), en 2,23 keer (P < 0.0001) of that measured in the CpG-ODN group separately. The healing rate in the R4M8 group was 1.36 times (P < 0.01) of that in the R12 group. CpG-MCA gels strongly promoted the migration of RAW264.7 cells compared to that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 4c). In addition, RAW264.7 cells were cultured with a series concentration of gels for 24 h. We found that the CpG-MCA gels exhibited a negligible cytotoxicity to RAW264.7 cells due to the non-toxicity of DNA itself; on the contrary, CpG-MCA gels could stimulate RAW264.7 cell proliferation with a dose-dependent effect, which was a benefit to enhance the production of immune cytokines (Fig. 4d).
The analysises of migration and cell viability of CpG-ODN, CpG-RCA gel (R12), and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) in RAW264.7 cells. een The migration assay of RAW264.7 cells induced with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8. b The migration assay of RAW264.7 cells stimulated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. c The scratch area analysis in the scratch migration experiment. The percentages are calculated as the ratio of the original area. d The cell viability of RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001
For further verifying the inhibited efficiency of CpG-MCA gels for the proliferation of solid tumor cells, we estimated the inhibitory effects of CpG-MCA gels as immune stimulators for the U251 human brain glioma cells. The U251 cells was first co-cultured with RAW264.7 macrophages for 24 h, and the clone formation rate was used to check the proliferate ability of the U251 cells. As shown in Fig. 5a–f, the clone formation rate in the CpG-ODN group was 74.1% of that observed in the control group (P < 0.05), and the rates in R12, R4M4, and R4M8 groups were 45.4% (P < 0.01), 15.3% (P < 0.001), and 12.0% (P < 0.001) of that in the CpG-ODN group, respectively. The results demonstrated that the U251 cells treated with CpG-MCA gels presented a significantly lower percentage of clone formation rate compared with that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 5g). It is notable that the trend of inhibitory results was in accordance with the secretion of TNF-α among groups, CpG-MCA gels exhibited a stronger effect on stimulating RAW264.7 cells to secrete cytokines to inhibit proliferation of U251 cells than CpG-ODN. Our research provided preliminary evidence to demonstrate the CpG-MCA gels have the potential to be used as an immunostimulant.
The assessment on the therapeutic effect of immunostimulatory CpG-RCA gel (R12) and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) on cancer cells in vitro by plate clone formation assay. U251 cells treated with a none, b RAW264.7 cells, c RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, d RAW264.7 cells treated with R12, e RAW264.7 cells treated with R4M4, and f RAW264.7 cells treated with R4M8. g Results of the proliferation percentage of U251 cells after co-cultured with RAW264.7 cells for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. **P < 0.01, ***P < 0.001
In summary, we have successfully preparedCpG-MCA nanohydrogels that consist of hundreds of immunostimulatory CpG motifs to effectively deliver immune stimulus signal into cells and significantly induce the expression of immune cytokines. CpG-MCA nanohydrogels exhibited powerful anti-tumor immunity against human glioma cells, demonstrating that CpG-MCA nanohydrogels have the potential to be used as an immunostimulant for the therapy of cancer.
The datasets used and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.
CpG-MCA hydrogel
CpG-RCA hydrogel
Multi-primed chain amplification
CpG-RCA gel
Hydrogels not containing CpG motifs
CpG-MCA gels
Rolling circle amplificationInleiding
Methoden/experimenteel
Materialen
Voorbereiding van circulaire DNA-sjablonen
Voorbereiding van CpG-MCA-gels en CpG-RCA-gel
Concentratie van CpG-MCA-gels en CpG-RCA-gel
Agarosegelelektroforese
Karakterisatie van CpG-MCA-gels en CpG-RCA-gel
Confocale microscopische beeldvorming
ELISA-test
Genexpressietest
Kraswondmigratietest
Cytotoxiciteitstest
U251-cellen samen gekweekt met RAW264.7-cellen
Plate Clone Formation Assay
Stabiliteit van CpG-MCA-gels en CpG-RCA-gel
CpG-ODN
Statistische analyse
Resultaten en discussie
Conclusions
Beschikbaarheid van gegevens en materialen
Afkortingen
Nanomaterialen
- Wist u? Hoe staal van ijzer wordt gemaakt
- 3D-printen van plastic in de ruimte — het nieuwste van Made in Space
- Nanocellulose uit blauwgroene algen
- 3D-DNA-nanostructuren
- Nanobomen voor kleurstofgevoelige zonnecellen
- Nano-heterojuncties voor zonnecellen
- Continu-vezelversterkte thermoplastische composiet volledig gemaakt van natuurlijke hulpbronnen
- 7 geweldige dingen gemaakt van brons
- 3D-geprinte objecten voelen hoe een gebruiker ermee omgaat
- Cellabelingmethode van microscopie aangepast voor gebruik in beeldvorming van het hele lichaam
- Zwitserse bewerking van medische elektroden gemaakt van MP35N®