DNA-Gebaseerde Nanohydrogel met Krachtige Anti-Tumor Immunostimulerende Activiteit

Samenvatting

Ongemethyleerde CpG oligodeoxynucleotiden (CpG-ODN) zijn krachtige activatoren van aangeboren en adaptieve immuniteit, maar hun snelle afbraak in serum beperkt klinische bruikbaarheid. We ontwierpen CpG-MCA nanohydrogels door multi-geprimeerde ketenamplificatie (MCA), wat hydrogels genereert rijk in tandem CpG-herhalingen. De resulterende CpG-MCA-gels weerstaan nucleasedegradatie, worden gemakkelijk geïinternaliseerd door RAW264.7 macrofagen, en triggeren robuuste secretie van tumornecrosefactor-α (TNF-α) en interleukine-6 (IL-6). In co-cultuur met humane gliom U251 cellen, onderdrukten CpG-MCA-gels tumorcelproliferatie aanzienlijk, en presteerden beter dan conventionele CpG-ODN en CpG-RCA-gels. Deze bevindingen tonen aan dat CpG-MCA nanohydrogels een krachtige, bio-compatibele immunostimulans zijn met sterke anti-tumoractiviteit.

Inleiding

Bacterieel DNA bevattende ongemethyleerde CpG-motieven fungeert als effectieve adjuvant en antikankeragent door Toll-achtige receptor 9 (TLR9) op dendritische cellen, macrofagen, en andere immuuncellen te activeren. Echter, CpG-ODN is vatbaar voor proteïne-adsorptie en nucleasedigestie, wat de stabiliteit en potentie in vivo compromitteert. Inkapseling in leveringsvoertjes of zelf-assemblage in hogere-orde DNA-nanostructuren heeft stabiliteit en celulair opname verbeterd, maar uitdagingen zoals cytotoxiciteit en beperkte lading blijven bestaan.

DNA-nanomaterialen – tetraeders, X-vormige roosters, en hydrogel-netwerken – hebben verbeterde cellulair opname en cytocine-inductie getoond vergeleken met lineaire oligonucleotiden. Rolling circle amplificatie (RCA) levert nanoflower-hydrogels die CpG-motieven beschermen en immuunsignaling versterken. Opbouwend op dit concept, gebruikten we multi-geprimeerde ketenamplificatie (MCA) om CpG-MCA-hydrogels te produceren, die duizenden CpG-herhalingen bevatten en nanoflower-structuren vormen. We hypotheseerden dat deze hydrogels superieure stabiliteit, opname, en immunostimulatie zullen bieden, wat solide-tumor-groei zal remmen.

Materialen en Methoden

Materialen

Alle oligonucleotiden werden gesynthetiseerd (Sangon Biotech, Shanghai) en gezuiverd door HPLC. Reagentia voor MCA en RCA, inclusief phi29 DNA-polymerase, T4 DNA-ligase, dNTPs, en buffers, werden verkregen van Thermo Fisher en New England Biolabs. Cellijnen RAW264.7 (muizenmacrofage) en U251 (humaan gliom) werden bezorgd door de Chinese Academie van Wetenschappen. ELISA-kits (R&D Systems) en CCK-8 (Dojindo) werden gebruikt voor cytocine-kwantificering en viabiliteitsassays.

Bereiding van Circulaire DNA-Sjablonen

Gefosforyleerde enkelstrengs DNA (SS-DNA) bevattende CpG-primers werd geanneald bij 95 °C voor 5 min en afgekoeld tot 4 °C. Ligase werd overnacht bij 4 °C toegevoegd om circulaire sjablonen te vormen; enzymen werden geïnactiveerd bij 75 °C voor 10 min.

Constructie van CpG-MCA en CpG-RCA Hydrogels

Een 10 µL aliquot van de circulaire sjabloon werd gemengd met 1× phi29-buffer, 4 mM dNTPs, en 5 U phi29-polymerase tot een volume van 50 µL. Incubatie bij 30 °C voor 12 u produceerde de RCA-gel (R12). Voor MCA, na 4 u RCA, werden 500 pM primers 2 en 3 toegevoegd en het mengsel geïncubeerd voor de resterende tijd (R4M4 en R4M8). Polymeren werden hitte-geïnactiveerd bij 65 °C en gezuiverd door ultrafiltratie.

Karakterisatie

Agarose-gel-elektroforese bevestigde hydrogel-formatie. TEM en SEM onthulden nanoflower-morfologieën variërend van 100 nm tot verschillende micrometers. Cytotoxiciteit werd beoordeeld door CCK-8; opname gevisualiseerd met Cy5-labeling en confocal microscopie; cytocinesecretie gemeten door ELISA; genexpressie gekwantificeerd door qRT-PCR.

Stabiliteitsassay

Hydrogels werden geïncubeerd in 10 % FBS-DMEM of PBS bij 37 °C; residueel DNA gekwantificeerd door NanoDrop, en degradatiepatronen gemonitord door agarose-gel-elektroforese.

Co-cultuur met U251 Cellen

RAW264.7 cellen werden gezaaid in de bovenkamer van een Transwell; U251 cellen werden geplaatst in de onderkamer. Na 24 u behandeling met CpG-ODN, CpG-RCA, of CpG-MCA-gels, werd U251-proliferatie geëvalueerd door een klonogene assay.

Resultaten en Discussie

Formatie van circulaire sjablonen en succesvolle amplificatie werd bevestigd door agarose-gel: het MCA-product (R4M4/R4M8) en RCA-product (R12) vertoonden hoge molecuulgewichtsretentie en nanoflower-verschijning op TEM/SEM.

Confocal imaging demonstreerde dat CpG-MCA-gels efficiënt werden geïinternaliseerd door RAW264.7-cellen, met een gemiddelde fluorescentie-intensiteit >10× die van lineaire CpG-ODN (p < 0,0001), wat superieure opname door de nanoflower-architectuur aangeeft.

Stabiliteitsstudies toonden aan dat CpG-MCA-gels ~85 % van hun DNA-inhoud behielden na 24 u in 10 % FBS-DMEM, terwijl lineaire CpG-ODN >90 % degradeerde binnen 12 u, wat het beschermende effect van de hydrogel-matrix onderstreept.

In vitro immunostimulatie-assays onthulden dat CpG-MCA-gels TNF-α en IL-6 secretie induceerden op niveaus 3–27× hoger dan CpG-ODN (p < 0,0001). Opvallend produceerde R4M8 de sterkste cytocinerespons, correlerend met het hogere CpG-kopienummer.

Genexpressie-analyse toonde significante up-regulatie van TLR9, TNF-α, en IL-6 transcripten in CpG-MCA-behandelde cellen, samen met verhoogde CD86 en verminderde CD206 oppervlaktemarkeren, wat een verschuiving naar het pro-inflammatoire M1-fenotype aangeeft.

Migratie-assays (Transwell en kwetsuur) onthulden dat CpG-MCA-gels RAW264.7-migratie stimuleerden meer dan CpG-ODN, wat het potentieel voor immuuncel-infiltratie in tumoren vergroot.

Co-cultuur met U251-gliomcellen demonstreerde een uitgesproken reductie in kloonvorming: R4M8 bereikte een 12 % kloonvormingsgraad ten opzichte van de CpG-ODN-controle (p < 0,001), wat krachtige anti-tumoractiviteit bevestigt gemedieerd door CpG-MCA-geïnduceerde cytocinevrijgave.

Conclusies

We hebben met succes CpG-MCA-nanohydrogels geïnjineerd die duizenden CpG-motieven incorporeren, wat nucleaseresistentie, efficiënte macrofaagopname, en robuuste Th1-type cytocine-inductie verleiht. Deze hydrogels onderdrukken effectief gliomcelproliferatie in vitro, wat hun belofte als bio-compatibele immunostimulans voor kankertherapie benadrukt.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

Datasets die deze studie ondersteunen zijn beschikbaar bij de corresponderende auteur op redelijk verzoek.

Afkortingen

CpG-MCA-gels

DNA-hydrogel gegenereerd door multi-geprimeerde ketenamplificatie

CpG-RCA-gel

DNA-hydrogel gegenereerd door rolling-circle-amplificatie

MCA

Multi-geprimeerde ketenamplificatie

R12

RCA-afgeleide CpG-gel

R4M4, R4M8

CpG-MCA-hydrogels met 4 of 8 primerextensies

R12-C, R4M4-C, R4M8-C

Hydrogels zonder CpG-motieven