Een magnetisch nanodeeltje met dubbele targeting voor de detectie van menselijke kanker

Materialen en methode

Cellijn- en celkweekcondities

De colonkankercellijn (HT29), die werd gekocht bij de ATCC-celbank, werd gekweekt bij 37 ° C in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, VS) dat 10% foetaal runderserum bevat ( Gibco, Grand Island, NY, VS), 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine, minder dan 5% CO₂ .

Experimenteel diermodel

Veertig vrouwelijke NOD/SCID-muizen (4-6 weken oud) werden gekocht bij Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Beijing, China). HT29-cellen die in log-fase waren gekweekt, werden driemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Na vertering met trypsine werden de cellen gedurende 5 minuten bij 1000 tpm gecentrifugeerd. De cellen werden vervolgens opnieuw gesuspendeerd in PBS en de celconcentratie werd aangepast tot 2 × 10 ⁷ /ml. Elke muis werd geïnjecteerd met 200 μL van de celsuspensie. Alle experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Guangxi Medical University (Guangxi, China).

Voorbereiding en karakterisering van Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Dubbele antilichaam magnetische nanosondes

Chitosan (Xi'an Ruixi Biotechnology) werd gecarboxyleerd met α-ketoglutaarzuur om α-ketoglutaraat carboxymethyl Chitosan (KCTS) te verkrijgen dat rijk is aan CO-groepen op het oppervlak [19]. Fe₃ O₄ (Xi'an Ruixi Biotechnology) werd gebruikt als de kern en KCTS werd ingesteld als de basisskeletstructuur. Na het activeren van Fe₃ O₄ nanodeeltjes met carbodiimide, Fe₃ O₄ @KCTS werd gevormd door de covalente binding van KCTS-COOH en oppervlakte-OH te combineren. De geselecteerde LECs-antilichamen waren specifiek tegen humaan LYVE-1 APC-geconjugeerd antilichaam (R&D Systems®, Cat. No. FAB20892A) en anti-podoplanine-antilichaam (FITC) (Abcam, Cat. No. ab205333). Deze antilichamen werden covalent gecrosslinkt aan gecarboxyleerd Fe₃ O₄ @KCTS met geactiveerde EDC/NHS. Bijgevolg, magnetische nanosondes gemodificeerd met LEC's dubbele antilichamen, aangeduid als Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Dubbele antilichaam magnetische nanosonde (0,1 mg/ml) werd verkregen. De dubbele antilichaam-geconjugeerde nanodeeltjes werden in het donker bewaard bij 4 ° C.

De morfologie en grootteverdeling van bereid Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes werden geëvalueerd met behulp van transmissie-elektronenmicroscoop (TEM; H-7650, Japan). De deeltjesgrootte (grootte), zeta-potentiaal en deeltjesdispersie-index (PDI) van de Fe₃ O₄ @KCTS-Double-antilichamen werden gemeten met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS; PRO3000, Japan) en hun fotoluminescentie werd gemeten met een fluorescentiespectrofotometer (FL-7000, Perkin Elmer, VS).

Immunohistochemie en immunofluorescentie

Bevroren weefselcoupes werden bereid en gedurende 10 minuten in ijsaceton gedaan en vervolgens gedurende 10 minuten in PBS-oplossing ondergedompeld. Na blokkering in 1% BSA en driemaal wassen met PBS, werden de coupes gedurende 30 minuten bij 4 ° C geïncubeerd met humaan LYVE-1 APC-geconjugeerd antilichaam en anti-podoplanine-antilichaam (FITC). Na incubatie werden de coupes driemaal ondergedompeld in PBS-oplossing, waarna een 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) kleuroplossing aan het tumorweefsel werd toegevoegd om de weefsels volledig te bedekken. De secties werden opnieuw gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Daarna werden ze driemaal gewassen met PBS, gevolgd door toevoeging van anti-fluorescentiedovend middel wanneer de coupes volledig droog waren. Ten slotte werden de secties op een dekglas gemonteerd en bekeken onder een confocale microscoop (Nikon DS-Ri1; Nikon, Tokyo, Japan).

Voor dit onderzoek werden darmkankerweefsels geconserveerd in formaline ingebed in paraffine. Van was ontdane coupes van HT29-kankerxenotransplantaten werden geblokkeerd met 3% waterstofperoxide, geblokkeerd in 5% normaal serum en een nacht bij 4 ° C geïncubeerd met anti-LYVE-1-antilichaam (Abcam, ab10278, VK). Vervolgens werd het met biotine gelabelde secundaire antilichaam geit-anti-konijn IgG H&L (HRP) (ab205718) in het labelingsreagens van met mierikswortelperoxidase geconjugeerde superstreptavidine gedurende 30 minuten geïncubeerd. De kleur werd gemeten met een 3,3′-diaminobenzidine (DAB) oplossing.

Celzuivering

Het gemiddelde volume van de tumoren was ongeveer 1,5 × 1 × 1 cm ³ . Voordat de tumoren werden verwijderd, werden de muizen gedesinfecteerd door ze 3-5 minuten onder te dompelen in 75% ethanol. De gedesinfecteerde muizenhuid werd gesneden met een steriele schaar en een steriele pincet op een schone bank. Het tumorweefsel werd zorgvuldig uitgesneden en in een petrischaal met PBS geplaatst. Het doorweekte tumorweefsel werd vervolgens gesneden met een oftalmische schaar en in een steriele plaat geplaatst. Het versnipperde weefsel werd met een gepasteuriseerde buis in een centrifugebuis van 50 ml gepipetteerd. Driemaal volume collagenase I werd vervolgens aan de buis toegevoegd en gedurende 10 minuten gevortext om een ​​mengsel van collagenase I-tumorweefsel te verkrijgen. Het mengsel werd vervolgens gedurende 20 minuten in een waterbad van 37 °C geplaatst en dit werd vijf keer herhaald. Aan het einde van de digestie werd collagenase I gestopt door een compleet medium toe te voegen en liet men het mengsel 2 minuten staan. Na 10 minuten centrifugeren bij 300 g werden de tumoren tweemaal gewassen met PBS, vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 10 ml PBS en langzaam gefiltreerd door een zeef met een poriegrootte van 75 m (200 mesh). De gefilterde cellen werden geteld, gemiddeld in twee centrifugebuizen van 15 ml, opnieuw gesuspendeerd in PBS, vervolgens 10 minuten bij 300 g gecentrifugeerd en vervolgens driemaal gewassen. (1) MACS magnetische parelsorteermethode:de gewassen cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 100 μL buffer. Een oplossing met PBS pH 7,2, 0,5% BSA en 2 mM EDTA werd bereid door MACS BSA-voorraadoplossing (cat. nr. 130-091-376) te verdunnen tot 1:20 met auto MACS™-spoeloplossing (cat. nr. 130 -091-222). Vervolgens werd 10 μL humaan LYVE-1 APC-geconjugeerd antilichaam toegevoegd en vervolgens gedurende 15 minuten in het donker bij 4 ° C geïncubeerd. Ten slotte werd het driemaal gewassen met 2 ml bufferoplossing. Na centrifugeren werd 80 L bufferoplossing toegevoegd om de cellen te resuspenderen, en 20 μL anti-APC fluoresceïne magnetische kralenoplossing werd toegevoegd. Het mengsel werd 15 minuten geïncubeerd, drie keer gewassen, vervolgens gecentrifugeerd en goed gemengd met 300 μL bufferoplossing. Ten slotte werden de positieve cellen in de kolom snel neergeslagen met 3 ml bufferoplossing. De resulterende cellen werden gekweekt in een plaat met zes putjes. (2) Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes sorteermethode:de gewassen cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 200 μL buffer, gemengd met Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes, 20 minuten geïncubeerd bij 4 ° C in het donker, vervolgens drie keer gewassen met 4 ml buffer, gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in 160 μL buffer. Ten slotte werden de cellen geëlueerd met behulp van een magneet en gekweekt in een plaat met 6 putjes.

Immunofluorescentie van cellen gesorteerd op verschillende methoden

De via verschillende sorteermethoden gesorteerde cellen werden aangepast tot een celconcentratie van 5 × 10 ⁴ /mL met PBS, en gelijkmatig verdeeld in een 12-wells plaat. Eén milliliter van de celsuspensie werd aan elk putje toegevoegd en vervolgens 24 uur gekweekt bij 37 ° C in 5% CO₂ omgeving. Het oude medium werd vervolgens weggegooid en de cellen werden driemaal gewassen met PBS-oplossing. Vervolgens werd 200 μL 4% paraformaldehyde aan elk putje toegevoegd en werden de cellen 10 minuten op kamertemperatuur gehouden. De cellen werden vervolgens driemaal gewassen met PBS-oplossing, menselijk LYVE-1 APC-geconjugeerd antilichaam en anti-podoplanine-antilichaam (FITC) werden toegevoegd. Na incubatie in het donker bij 4 ° C gedurende 2 uur werden de cellen driemaal gewassen. Verder werd 50 μL DAPI aan elk putje toegevoegd en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd om de kernen blauw te kleuren, gevolgd door driemaal wassen met PBS. Ten slotte werd de anti-fluorescentiedover in het midden van het objectglaasje laten vallen en werd de met cellen bedekte kant op een glasplaatje geplaatst en geobserveerd met behulp van een confocale laserscanmicroscoop.

Flowcytometrie van cellen gesorteerd op verschillende methoden

De cellen gesorteerd op verschillende methoden werden opnieuw gesuspendeerd met humaan LYVE-1 APC-geconjugeerd antilichaam en anti-podoplanine antilichaam (FITC) antilichaam in 200 L bindingsbuffer (10 mM HEPES/NaOH pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl) , en gedurende 1 uur bij 4 ° C in het donker geïncubeerd en vervolgens driemaal gewassen met PBS. De cellen werden gedetecteerd en geanalyseerd met flowcytometrie (BD Accury6; Becton Dickinson, San Jose, CA, VS) en vervolgens geanalyseerd door FlowJo-software (Tree Star Inc., Ashland, OR, VS).

Detectie van LECs-activiteit

Cellen in de logaritmische groeifase, gesorteerd volgens verschillende methoden, werden verzameld, verteerd en geteld. De celconcentratie werd aangepast tot 2 × 10 ⁵ cellen/ml en 50 μL van deze cellen werd toegevoegd aan elk putje van een Matrigel-gecoate μ-slide plaat en geïncubeerd in een 5% CO₂ incubator bij 37 ° C gedurende 6 uur. Het medium werd gescheiden en weggegooid met een gepasteuriseerde druppelaar, gevolgd door toevoeging van PBS-oplossing die 1 g/ml calceïne AM bevat (Invitrogen, Cat. No. c3099). De cellen werden vervolgens 1 uur in het donker bij kamertemperatuur geïncubeerd, gewassen met PBS en gefotografeerd onder een microscoop (Nikon, Japan). Daarna 1 × 10 ⁵ cellen werden gemengd met 500 μL compleet medium dat 20 μg / ml DiI-ac-LDL (Molecular Probes, Invitrogen) bevat en vervolgens gedurende 4 uur geïnoculeerd in een plaat met 24 putjes bij 37 ° C. De oude kweekoplossing werd verwijderd en de cellen werden driemaal gewassen in PBS. Vervolgens werd 50 μL DAPI-oplossing aan elk putje toegevoegd en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd om de kernen blauw te kleuren. Na drie keer wassen met PBS werden ze uiteindelijk onder een microscoop in beeld gebracht.

MR- en fluorescentiebeeldvorming in vivo

De volgende stappen werden gevolgd om te bepalen of de tumor het doelwit was van Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes bij dieren. Het NOD/SCID-muis subcutane xenotransplantaatmodel van darmkanker werd gebruikt voor magnetische resonantie of fluorescentiescanning. T2-gewogen beeldvorming werd uitgevoerd in een specifieke toestand met gezichtsveld (80 × 80 mm), echotijd (69 ms) en laagdikte (2,0 mm) met behulp van een 3.0T MRI-scanner (Discovery 750, gE, duitsland) , met een muisvolumespoel met een diameter van 40 mm. De NOD/SCID-muizen werden in twee groepen verdeeld (n = 3); de experimentele groep en de receptorblokkerende groep. Alle muizen werden geïnjecteerd met Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbel antilichaam (0,5 mmol/kg) magnetische nanodeeltjes via de staartader. Elke muis werd gescand op vier specifieke tijdstippen:vóór injectie, 0,5 h, 12 uur en 24 uur na injectie. In de receptorblokkerende groep werd elke muis vóór injectie met Fe₃ geïnjecteerd met anti-LYVE-1-antilichaam (Abeam, ab10278, VK) en anti-podoplanine-antilichaam (Abcam, ab10288, VK). O₄ @KCTS-LECs-dubbel antilichaam. MRI-scans werden op dezelfde vier tijdstippen uitgevoerd. Fluorescentiebeelden werden genomen met behulp van het in vivo beeldvormingssysteem voor kleine dieren (Bruker, VS). De tijdstippen voor groepering, medicijninjectie en scannen waren zoals hierboven vermeld.

Toxiciteit van Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Dubbele antilichaam magnetische nanosonde

Toxiciteit van Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanoprobe tegen LECs werd geëvalueerd door CCK-8-assay. Cellen (100 μL medium, 2 × 10 ⁵ /mL) werden overnacht gekweekt in platen met 96 putjes bij 37 ° C in een gehumaniseerde atmosfeer die 5% CO₂ bevat. , vervolgens behandeld met Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanoprobe (0,1, 0,5, 1,0, 2,0 mg/ml) gedurende 24 of 48 uur onder dezelfde omstandigheden. Na incubatie werd 10 μL CCK-8-oplossing aan elk putje toegevoegd, gevolgd voor nog een incubatie gedurende 2 uur. De optische dichtheid (OD) werd gemeten bij 450 nm met een ELISA-microplaatlezer (Thermo Scientific, VS).

Om de toxiciteit van Fe₃ . te beoordelen O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanoprobe in vivo, NOD/SCID vrouwelijke muizen kregen een enkele staartaderinjectie van 200 μL PBS (controlegroep) of Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanosonde (2 mg/mL) (n = 3 dieren per groep). Na 1 week werden muizen opgeofferd, werden secties van belangrijke weefsels (hart, long, lever, milt, nier) verkregen en ondergedompeld in 10% formaldehyde-oplossing, gedehydrateerd en ingebed in paraffine. Geparaffineerde coupes (4 μm dik) werden gesneden en gekleurd met hematoxyline-eosine.

Datumanalyse

SPSS 16.0 statistische software werd gebruikt voor gegevensanalyse. De meetgegevens werden uitgedrukt als x ± s, de vergelijking tussen groepen werd gedaan door variantieanalyse en de vergelijking van telgegevens werd uitgevoerd door middel van een chi-kwadraattest. P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaat

Principe van een magnetisch nanodeeltje met dubbele targeting voor de detectie van menselijke kanker

In deze studie, zoals weergegeven in Schema 1, Fe₃ O₄ @KCTS, een kern-schaal type magnetische nanodeeltjes, werd bereid door Fe₃ te activeren O₄ met carbodiimide en het verknopen met α-ketoglutaraatchitosan (KCTS). De LYVE-1- en podoplanine-antilichamen werden vervolgens aan het oppervlak van deze magnetische nanodeeltjes toegevoegd, waardoor magnetische nanosondes met dubbele targeting werden gevormd. Deze sondes werden via de staartader in muizenmodellen geïnjecteerd om de tumor te diagnosticeren door T2-gewogen MR-beeldvorming en fluorescentiebeeldvorming. Na excisie werd de tumor tot een enkele cel gepureerd en vervolgens met de sonde geïncubeerd om de lymfocytendotheelcellen met hogere zuiverheid te identificeren door een magneet om het mechanisme van tumormetastase te onderzoeken. De resultaten toonden aan dat een dual-targeting magnetische nanoprobe die zeer zuivere LEC's uit tumorweefsel levert, met succes is ontwikkeld, wat een basis vormt voor klinische toepassing van LEC's bij colorectale kanker en bij vroege klinische diagnose door dual-mode beeldvorming van colorectale kanker.

Schematische illustratie van Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes

Karakterisering van Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes

TEM-afbeeldingen (Fig. 1a) toonden aan dat naakt Fe₃ O₄ is onregelmatig met bolvormig en heeft agglomeraten tussen de deeltjes. Wanneer Fe₃ O₄ werd gemodificeerd door KCTS (figuur 1b), de deeltjes waren regelmatig bolvormig of ovaal en de deeltjes waren uniform gedispergeerd. Zoals weergegeven in Afb. 1c, Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes werden gemodificeerd met het negatief geladen antilichaam op het oppervlak van Fe₃ O₄ @KCTS die negatieve ladingen toekende, waardoor de elektrostatische afstoting tussen nanodeeltjes toenam. Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes waren bolvormig, uniform, vrij van deeltjesaggregatie en waren niet beschadigd. De gemiddelde diameter was 91,28 ± 2,31 nm en de PDI was 0,207 ± 0,015 (figuur 1d). De figuur laat zien dat de grootteverdeling van de nanodeeltjes smal was en een goede dispersie in water vertoonde. Het negatief geladen oppervlak had een zeta-potentiaal van -32,8 ± -1,51 mV, met een absolute waarde van meer dan -30, wat aangeeft dat het materiaal een goede stabiliteit had (figuur 1e).

Karakterisering van magnetische nanosonde. een Transmissie-elektronenmicrofoto van Fe₃ O₄ nanosonde (schaalbalk, 100 nm). b Transmissie-elektronenmicrofoto van Fe₃ O₄ @KCTS nanosonde (schaalbalk, 100 nm). c Transmissie-elektronenmicrofoto van Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanosonde (schaalbalk, 100 nm). d De deeltjesgrootte werd gedetecteerd door analyse van de grootte en de gemiddelde grootte van de sonde was 91,28 nm. e Zeta-potentiaal was ongeveer -32,8 mv. v De Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam nanosonde heeft emissiepieken onder excitatielicht van 488 en 545

De resultaten van de fluorescentiespectrometer worden getoond in Fig. 1f. Een duidelijke emissiepiek werd waargenomen in het anti-podoplanine-antilichaam (FITC) onder een 488-excitatielicht en in het anti-LYVE-1-antilichaam (APC) onder een 545-excitatielicht. De aanwezigheid van emissiepieken in de Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbel antilichaamcomplex onder 488 en 545 excitatie geeft aan dat de materialen met succes werden gekoppeld.

Immunohistochemie en immunofluorescentie

Zoals getoond in Fig. 2a, b, werd de expressie van LYVE-1 in darmkankerweefsels en LYVE-1 en podoplanine-antilichaam in bevroren tumorweefsels waargenomen. Dit toonde aan dat er een kleine hoeveelheid lymfatische endotheelcellen aanwezig was in darmkankerweefsels.

Expressie van lymfevaten in colorectale kankerweefsels. een Verwijde vaten in de weefselsecties waren positief voor LYVE-1 op endotheelcelmembraan door immunohistochemie (schaalbalk, 100 m). Rechts een uitvergrote afbeelding. b Verwijde bloedvaten in de weefselcoupes waren positief voor LYVE-1 en podoplanine op het endotheelcelmembraan, zoals blijkt uit immunofluorescentie (schaalbalk, 50 μm)

Isolatie en verrijking van LEC's

Immunofluorescentiekleuring werd uitgevoerd op de cellen die waren verkregen door middel van twee verschillende sorteermethoden. Er werd gevonden dat de cellen gesorteerd door LYVE-1 MicroBeads magnetische kralen het eiwit LYVE-1 tot expressie brachten, maar niet podoplanine, terwijl cellen verkregen door Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes brachten eiwit LYVE-1 en eiwit podoplanine tot expressie (Fig. 3a). Bovendien werden de flowcytometrieresultaten van de cellen die volgens verschillende methoden waren gesorteerd, geanalyseerd. Zoals getoond in Fig. 3b, was de co-expressiesnelheid van eiwit LYVE-1 en eiwit podoplanine door LYVE-1 MicroBeads magnetische kralen 71,2%, terwijl de co-expressiesnelheid van de twee markers verkregen door sortering met Fe3 O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes was 88,9%. Twee onafhankelijke steekproeven t testen toonden aan dat er statistisch significante verschillen waren tussen de twee groepen (P < 0.05) (Fig. 3c).

Analyse van de zuiverheid van lymfatische endotheelcellen. een Fluorescentiemicrofoto's dubbelkleurige beeldvorming van LYVE-1 (rood) en podoplanine (groen)/kernen [4,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, blauw) in de geïsoleerde menselijke colorectale kanker LEC's gesorteerd met behulp van LYVE-1 Microbeads en Fe ₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbel antilichaam (schaalbalk, 100 μm). b De co-expressie van LYVE-1 (APC) en podoplanine (FITC) zoals onthuld door flowcytometrische detectie. c Resultaten van flowcytometrie, *P < 0.05

Vergelijking van biologische functies van LEC's verkregen door de twee verschillende sorteermethoden

We vergeleken verder de biologische kenmerken van lymfatische endotheelcellen verkregen door twee verschillende sorteermethoden. De testresultaten van Matrigel-lijmbuisjes worden getoond in Fig. 4a. De cellen verkregen door te sorteren met Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes hadden een sterker buisvormend vermogen. Het resultaat van de Dil-ac-LDL endotheelcelopname-assay getoond in Fig. 4b onthult dat een rode fluorescentie werd waargenomen in cellen gesorteerd op LYVE-1 MicroBeads magnetische kralen, maar een sterkere rode fluorescentie werd waargenomen in de cellen gesorteerd op Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes. Deze resultaten geven aan dat de cellen die zijn verkregen door de Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes hadden een hogere zuiverheid, beter buisvormend vermogen en endotheelcelfagocytose, wat aangeeft dat ze meer geschikt zijn voor onderzoek naar lymfatische endotheelcellen in tumoren.

Vergelijking van biologische functies van LEC's. een Bepaling van in vitro LEC-buisvormingsvermogen door Calcein AM (groen) in vitro (schaalbalk, 50 m). b Endotheelcelfagocytose-assay (DiI-gelabeld, rood; DAPI, blauw) van endotheelcelfunctie met behulp van geïsoleerde LEC's door LYVE-1 Microbeads en Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Dubbel antilichaam (schaalbalk, 100 μm)

Bimodale beeldanalyse in vivo

De resultaten van in vivo beeldvorming worden getoond in Fig. 5a. Er werd vastgesteld dat er geen fluorescentie van de tumor was vóór de injectie van Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes. Na injectie nam de fluorescentie van de tumor toe en bereikte de piek na 12 uur. Daarna nam de fluorescentie geleidelijk af met de tijd. In de gesloten controlegroep was er tijdens het experiment bijna geen fluorescentie van de tumor. Na 24 uur werd waargenomen dat het materiaal volledig was gemetaboliseerd uit het muizenlichaam van beide groepen. Evenzo onthulde magnetische resonantiebeeldvorming, getoond in figuur 5b, dat de beeldvorming van de tumor geleidelijk verzwakte en het zwakste niveau bereikte na 12 uur, gevolgd door geleidelijk herstel met de tijd. Het beeldvormende vermogen van de tumor in de gesloten controlegroep was echter vrijwel onveranderd. Hieruit kan worden afgeleid dat de Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes hadden hoge tumortargeting-eigenschappen in vivo.

Fluorescentiebeeldvorming en MRI van subcutane xenografting tumormodellen van colorectale kanker van NOD/SCID-muizen. een NOD / SCID-muizen werden verdoofd en afgebeeld met fluorescentiebeeldvormingssysteem bij pre-injectie en post-injectie 0,5 uur, 12 uur en 24 uur. b NOD/SCID-muizen werden verdoofd en afgebeeld met 3.0T MRI-scanner bij pre-injectie en post-injectie 0,5 h, 12 h en 24 h

In vitro en in vivo toxiciteit van magnetische nanodeeltjes

In vitro cytotoxiciteit van de magnetische nanosondes werd geëvalueerd in de LEC's die werden gesorteerd op Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes. De resultaten van de CCK-8-assay toonden aan dat de levensvatbaarheid van de cel hoog was na incubatie met verschillende concentraties magnetische nanosonde (figuur 6a). Dit suggereert dat Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanodeeltjes hebben minimale cytotoxiciteit. We evalueerden verder de toxiciteit van de magnetische nanodeeltjes in vivo. Vrouwelijke NOD/SCID-muizen werden behandeld met magnetische nanosonde en vervolgens werden weefselcoupes van de belangrijkste organen na kleuring met hematoxyline-eosine onderzocht. Zoals weergegeven in Fig. 6b, werden geen duidelijke tekenen van necrose of ontsteking waargenomen. Deze resultaten suggereerden dat de magnetische nanosonde in vivo geen toxische effecten had. Deze bevindingen geven aan dat de magnetische nanosonde die in dit onderzoek is ontworpen, geschikt is voor toepassing als detectiesonde in dierlijk en menselijk onderzoek.

Toxiciteit van Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-dubbele antilichaam magnetische nanosonde. een LEC's werden geïncubeerd met verschillende concentraties magnetische nanosonde en de levensvatbaarheid van de cellen werd gemeten na 24 uur en 48 uur. b NOD/SCID-muizen werden behandeld met PBS of magnetische nanosonde, en coupes van de belangrijkste organen werden gekleurd met hematoxyline-eosine en onderzocht met lichtmicroscopie (schaalbalk, 100 μm)

Discussie

It has long been know that transportation through the lymphatic system is an important pathway for tumor cell proliferation. However, compared with vascular endothelial cells (BECs) in blood vessels, LECs, as major components of lymphatic vessels, have not been fully studied. Identification of LECs markers will promote investigations on LECs and make it easier to distinguish them from BECs. LYVE-1 is a type I intact transmembrane glycoprotein receptor composed of 322 amino acid residues [20, 21], and it is presently considered to be the most specific lymphatic endothelial cells marker [22, 23]. Podoplanin is a type I transmembrane salivary mucin-like glycoprotein with a molecular weight of 38 kDa. Current research shows that podoplanin can distinguish lymphatic vessels and blood vessels very well [24, 25]. Therefore, it can be combined with other lymphatic markers to identify LECs. In this study, two antibodies were used to sort LECs, and the purity of the sorted cells was verified by immunofluorescence co-localization, flow double staining, and co-expression. The cells sorted by Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles displayed similar biological characteristics with LECs, and had stronger tube-forming ability and better phagocytic ability.

Recently, immunomagnetic-based purification methods have been used to separate different cells from mixed cultures, while magnetic beads coated with LYVE-1 or podoplanin antibodies have been used to separate specific subpopulations from crude cells populations [10, 26]. These methods only purify the target subgroups from mixed cultures. It is likely that this not only leads to incomplete isolation of LECs, but also causes contamination of heterogeneous cells such as vascular endothelial cells. Furthermore, these methods are time-consuming and are costly. Previously, several specific lymphoid markers were reported, e.g., LECs were isolated from different tissues primarily by the means of collagenase treatment. However, during primary culture, collagenase treatment may produce a mixture of cells, including vascular endothelial cells and interstitial cells.

In this study, the Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-diabody magnetic nano-double targeting probe was constructed using chitosan-coated ferroferric oxide which binds to highly specific target molecules LYVE-1 and podoplanin expressed on lymphatic endothelial cells. The electron microscope analysis showed that the probe had uniform appearance and good dispersibility. Zeta potential reflects the stability of a molecular probe. Highly positive or negative zeta potential values reflect high stability and low capacity to aggregate. It is generally believed that molecules with zeta potential greater than + 30 mV or less than − 30 mV have good stability. In this experiment, the probe had a zeta potential of − 32.8 ± 1.51 mV, which indicates that the probe had good stability.

Fe₃ O₄ is a magnetic nanoparticle oxide which has been widely used in modern medicine and biology because of its unique physical properties. It is particularly used in diagnosis systems based on magnetic resonance imaging and magnetic hyperthermia as well as in cell separation applications. The contrast agents used in MR imaging can be divided into paramagnetic iron oxide nanoparticles (T2-negative contrast agent) and Gd compounds (T1-positive contrast agent). Fe₃ O₄ nanoparticle resonance contrast agent is considered to be a R2-weighted, and its performance is often affected by some factors, such as (a) composition, (b) NP size, (c) surface coating, and (d) synergistic magnetic effect produced by multiple superparamagnetic Fe₃ O₄ NP centers in a small volume [27]. In addition, it can be used in sorting of target cells under the magnetic field effect, that is, after the target cells are combined with specific probes, the target cells are sorted by magnet adsorption. For example, the lymphatic endothelial cells sorted using the probe designed in this study had better tube forming ability and endothelial cell phagocytosis. The relaxation parameter R1 or R2 is typically used to measure the quality of the MRI contrast agent, which describes the ability of the contrast agent T1 or T2 relaxation time [28]. The current NP-based T1 contrast agents are associated with cell toxicity, generating the need for better alternatives. Fe₃ O₄ provides good biocompatibility compared to the above-described cerium-based materials [29]. In this study, we studied the in vitro and in vivo toxicity of the nano-probes modified by chitosan on the surface of Fe₃ O₄ . Our results showed that the probe was suitable for sorting of specific cells, and had low toxicity. It is therefore an ideal material that can be used for culturing of the sorted cells and further research on tumor metastasis through lymphatic vessels.

Here, specific target molecules such as peptides, antibodies, aptamers, etc. were attached to the surface of magnetic nanomaterials, thereby facilitating tumor diagnosis and treatment [30, 31]. This study successfully constructed the Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nano-double targeting probe. This probe could bind to specific target molecules, and hence can be used to separate lymphatic endothelial cells and MR/fluorescence imaging.

Conclusies

In summary, a dual targeting magnetic nanoparticle that can detect human cancer is presented in this study. The magnetic nanoparticle probe displays high biosafety and stability. The probe could bind to specific target molecules, thereby enabling sorting of lymphatic endothelial cells. The double antibody coating customized by incorporating self-made magnetic beads produced enabled separation of pure LECs, which reduced sorting time, improved cell activity, and reduced cost. These findings indicate that the magnetic nanoprobe designed in this study is suitable for application as a detection probe in animal and human investigations. This study provides a platform for studying the mechanisms of lymphatic metastasis and role of lymphatic endothelial cells in tumors. Moreover, the Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles can be applied in fluorescence/MR molecular imaging in vivo, enabling clinical diagnosis of cancer.

Afkortingen

DAPI:

4′,6-diamidino-2-fenylindol

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle medium

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride

FBS:

Containing no fetal bovine serum

Fe₃ O₄ :

Magnetic ferroferric oxide

HT29:

Human colon cancer cell

KCT:

α-Ketoglutarate carboxymethyl chitosan

LECs:

Lymphatic endothelial cells

LYVE-1:

Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1

MR:

Magnetic resonance

NHS:

N-hydroxysuccinimide

T2:

Transverse (spin-spin) relaxation time

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscopie

VEGFR-3:

Vascular endothelial growth factor receptor 3