Bereiding van glycyrrhetinezuur-liposomen met behulp van vriesdrogen Monofase-oplossingsmethode:voorformulering, optimalisatie en in-vitro-evaluatie

Abstract

In deze studie werden glycyrrhetinezuur (GA) liposomen met succes bereid met behulp van de lyofilisatie-monofase-oplossingsmethode. Preformulatie-onderzoeken omvatten evaluatie van de oplosbaarheid van sojafosfatidylcholine (SPC), cholesterol en GA in tert-butylalcohol (TBA)/water-co-oplosmiddel. De invloeden van het TBA-volumepercentage op de sublimatiesnelheid werden onderzocht. GA na lyofilisatie met behulp van TBA/water co-oplosmiddel met verschillende volumepercentages werd fysisch-chemisch gekarakteriseerd door DSC, XRD en FTIR. De XRD-patronen van GA vertonen een schijnbaar amorf karakter. FTIR-spectroscopieresultaten laten zien dat er geen chemische structurele veranderingen zijn opgetreden. Oplosbaarheidsonderzoeken tonen aan dat de oplosbaarheid van GA in water is verbeterd. De optimale formulerings- en verwerkingsvariabelen van 508 mg SPC, 151 mg cholesterol, 55% volumepercentage TBA, 4:1 trehalose/SPC gewichtsverhouding werden verkregen na onderzoek door middel van Box-Benhnken ontwerp- en selectie-experiment van lyoprotectant. Onder de optimale omstandigheden werden bevredigende inkapselingsefficiëntie (74,87%) en gemiddelde diameter (191 nm) van gereconstitueerde liposomen verkregen. In vitro onderzoek naar geneesmiddelafgifte toonde aan dat gereconstitueerde liposomen eigenschappen voor langdurige afgifte hebben in twee soorten medium met afgifte. Bovendien bleek uit in vitro celopnameonderzoek dat het opnameproces van met geneesmiddelen beladen liposomen door Hep G2-cellen tijdsafhankelijk is.

Achtergrond

Glycyrrhetinezuur (GA), een soort triterpeensaponine, wordt voornamelijk gewonnen uit de wortels van de traditionele Chinese geneeskunde glycyrrhiza [1]. Studies hebben aangetoond dat GA duidelijke antimicrobiële, antivirale en antikanker effecten heeft en het wordt vaak gebruikt voor klinische behandelingen van chronische hepatitis en leverkanker [2,3,4]. Volgens het biofarmaceutische classificatiesysteem is GA een type II-medicijn. Vanwege de lage polariteit, hoge hydrofobiciteit en slechte oplosbaarheid van GA-moleculen, is de orale biologische beschikbaarheid relatief laag [5]. Bovendien kan GA natriumretentie en kaliumverlies veroorzaken [6], die geassocieerd zijn met hypertensie, terwijl de nadelige effecten van GA dosisafhankelijk lijken te zijn. Daarom zal het gebruik van geschikte formuleringsstrategieën om de absorptie te verhogen en een effectieve concentratie van GA te behouden, de biologische beschikbaarheid en veiligheid aanzienlijk verbeteren.

De superioriteit van liposomen als geneesmiddeldragers is algemeen erkend [7,8,9]. Hun functionele voordelen worden voornamelijk aangetoond door de volgende aspecten:(1) liposomen hebben een goede biocompatibiliteit en veiligheid; (2) liposomen verbeteren de gerichte afgifte van geneesmiddelen aan lymfeklieren en verminderen de remmende effecten of schade die geneesmiddelen tegen kanker hebben op normale cellen en weefsels; (3) geneesmiddeldragende liposomen van geschikte grootte hebben verbeterde permeabiliteit en retentie-effecten op plaatsen van solide tumoren, infectie en ontsteking waar de permeabiliteit van capillaire bloedvaten is verhoogd, wat het vermogen van passieve targeting aantoont; (4) liposomen kunnen zowel hydrofobe als in water oplosbare geneesmiddelen dragen; en (5) het liposoomoppervlak kan worden gemodificeerd en gekoppeld aan functionele groepen. Als gevolg van deze gunstige eigenschappen zijn veel liposoomgeneesmiddelen goedgekeurd.

De producten die worden verkregen door conventionele liposoombereidingsmethoden zijn waterige liposoomsuspensies. Waterige liposoomsuspensies zijn echter relatief onstabiel en kunnen tijdens opslag lekken, fuseren en hydrolyse van fosfolipiden ondergaan, wat resulteert in een beperkte opslagcapaciteit op lange termijn [10]. Momenteel is de effectieve manier om deze problemen op te lossen het bereiden van proliposomen [11]. Proliposoom is een poeder met een goede vloeibaarheid dat is gemaakt van gedehydrateerde liposoomcomponenten en hulpstoffen. Liposomen kunnen worden gereconstrueerd door het proliposoom vóór het aanbrengen in water te dispergeren. Sproeidrogen en vriesdrogen zijn de twee meest voorkomende methoden voor de bereiding van proliposomen [12], maar ze hebben verschillende beperkingen bij de toepassing. Sproeidrogen is bijvoorbeeld niet geschikt voor thermogevoelige medicijnen en kan vaak leiden tot problemen zoals hechting aan de muur vanwege de lage thermische efficiëntie van de apparatuur. De structurele herschikkingen van de liposomale dubbellagen kunnen plaatsvinden tijdens het sproeidroogproces [13]. De veelgebruikte vriesdroogmethode is een watersuspensiesysteem, maar het duurt lang voordat water gevriesdroogd is, dus deze methode is erg kostbaar en tijdrovend.

De afgelopen jaren is een nieuwe bereidingsmethode voor proliposomen (lyofilisatie-monofase-oplossingsmethode) ontwikkeld [14, 15]. Deze methode omvat het oplossen van de lipiden, het geneesmiddel en de in water oplosbare lyoprotectanten in een tert-butylalcohol (TBA)/water co-oplosmiddelsysteem, waarna proliposomen worden verkregen door vriesdrogen, na toevoeging van water, waardoor een homogene liposoomsuspensie wordt gevormd. Deze methode heeft verschillende voordelen:(1) de toevoeging van TBA kan de sublimatiesnelheid van ijs aanzienlijk verbeteren, wat resulteert in een snelle en grondige lyofilisatie die economisch gunstig is. Tegelijkertijd is snelle sublimatie gunstig om te voorkomen dat klonten instorten [16]. (2) Lyofilisatie-monofase-oplossingstechniek is een eenstapsproces, wat een zeer effectieve methode is voor grootschalige liposoombereiding. (3) Hoewel niet vermeld in de ICH-richtlijnen voor resterende oplosmiddelen, valt TBA waarschijnlijk in de categorie van een klasse 3 oplosmiddel met lage toxiciteit op basis van de gelijkenis van LD₅₀ toxiciteitsgegevens voor andere klasse 3 oplosmiddelen [17]. (4) Met deze methode kan steriel poeder worden verkregen. (5) Het is geschikt voor geneesmiddelen met een slechte oplosbaarheid in water of een slechte waterstabiliteit [18].

Er zijn enkele rapporten geweest over het gebruik van het TBA/water-lyofilisatiesysteem voor de bereiding van liposomen. Onderzoek naar dit systeem is echter ontoereikend en er blijven nog veel vragen over. Zo zijn bijvoorbeeld de variatie in sublimatiesnelheid van TBA/watersystemen met verschillende concentraties, veranderingen in de vastestofeigenschap van het specifieke geneesmiddel na lyofilisatie door TBA/watersystemen met verschillende concentraties, en het hydratatie- en assemblageproces van het gevriesdroogde poeder. nog onduidelijk. Aan de andere kant is de oplosbaarheid van een bepaald hydrofoob geneesmiddel in TBA/water-co-oplosmiddel met verschillende verhoudingen en temperaturen zeer specifiek. De bovenstaande informatie is van cruciaal belang voor de formulering en het technologische ontwerp van liposomen die geneesmiddelen bevatten. Daarom hebben we in deze huidige studie de GA gebruikt als een modelgeneesmiddel om preformulatie-onderzoek uit te voeren zoals hierboven beschreven. Verder hebben we, met behulp van gemiddelde diameter en beknellingsefficiëntie als de primaire evaluatiemaatregelen, de formulerings- en verwerkingsvariabelen van GA-liposomen geoptimaliseerd die zijn bereid door middel van de monofase-oplossingsmethode van lyofilisatie met behulp van Box-Benhnken-ontwerp. De effecten van de typen beschermende middelen tegen vriesdrogen op de kwaliteit van liposomen werden geëvalueerd, evenals de in vitro afgifte van liposomen en hun opname door hepatoomcellen.

Methoden/experimenteel

Materialen

Glycyrrhetinezuur (> 98% zuiver) werd verkregen van Dalian Meilun Biology Technology Co., Ltd. (Dalian, China). Sojabonenfosfatidylcholine (Lipoid S100) werd gekocht bij Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Duitsland). Cholesterol werd gekocht bij J&K Scientific Ltd. (Beijing, China). Referentieverbinding van GA werd gekocht bij National Institutes for Food and Drug Control (Beijing, China). FITC-PEG-DSPE (molecuulgewicht 2000) werd gekocht bij Shanghai Ponsure Biotech, Inc. (Shanghai, China). Tert-butylalcohol (> 98%) en alle andere reagentia, indien niet anders gespecificeerd, werden gekocht bij Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Beijing, China). Gedeïoniseerd water werd bereid door een Milli-Q waterzuiveringssysteem (Millipore, Bedford, MA, VS).

Oplosbaarheidsonderzoek van GA, SPC en cholesterol in TBA/water-co-oplosmiddelsysteem

De verzadigde TBA-wateroplossingen (30 ml) van GA met verschillende TBA-volumepercentages werden bereid door een overmaat geneesmiddel in de overeenkomstige drager te roeren bij 25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C en 45 °C gedurende 72 uur. Na centrifugeren (15 min bij 3000 rpm) werd het supernatant door een 0,45 μm microporeuze filters geleid. De verzadigingsoplosbaarheid van GA werd gemeten met HPLC na adequate verdunning. Drie herhalingen werden uitgevoerd in elk TBA/water co-oplosmiddel. HPLC-analyse werd uitgevoerd op een LabAlliance (model Series III) HPLC-systeem (Lab Alliance, Tianjin, China) uitgerust met een quaternaire pomp, een autosampler en een kolomcompartiment, gekoppeld aan een UV-detector. Scheiding werd uitgevoerd op een C18-kolom (4,6 mm × 250 mm; 5 μm; Dikma Technologies, Beijing, China); methanol en water (90:10 V /V ) werden gebruikt als mobiele fase met een stroomsnelheid van 1,0 ml/min. De analyten werden gedetecteerd door een UV-detector bij 250 nm.

De oplosbaarheid van sojafosfatidylcholine (SPC) (of cholesterol) in het TBA/water-co-oplosmiddelsysteem werd geschat met behulp van de turbidimetrische methode [19, 20]. In het kort werd 10 mg SPC (of cholesterol) opgelost in TBA bij 25°C, 30°C, 35°C, 40°C en 45°C om een heldere oplossing te verkrijgen; de temperatuur werd gedurende de duur van het experiment gehandhaafd. Een toenemende hoeveelheid gezuiverd water bij dezelfde temperatuur werd toegevoegd aan een TBA-oplossing van SPC (of cholesterol) bij 25°C totdat de troebelheid voor het eerst optrad en de kritische watervolumewaarde werd geregistreerd. Troebelheid kan worden geïdentificeerd door de absorptiewaarde te detecteren bij 655 nm (> 0,04) ten opzichte van de blanco oplossing (gezuiverd water) op een T6-model UV-Vis-spectrofotometer (Purkinje General Instrument Co., Ltd., Beijing).

Voorbereiding van liposomen met behulp van de methode van vriesdrogen van monofaseoplossing

GA, SPC en cholesterol werden opgelost in TBA bij 45 ° C, en in water oplosbare lyoprotectant zoals mannitol, lactose, sucrose en trehalose werd opgelost in water van 45 ° C. Vervolgens werden deze twee oplossingen in geschikte verhoudingen gemengd om een derde heldere isotrope monofase-oplossing te krijgen (totaal volume 60 ml). Nadat de monofase-oplossing was gesteriliseerd door filtratie door poriën van 0,22 m, werd deze afgevuld in de 10 ml vriesdroogflesjes met een vulvolume van 2,0 ml. Na 12 uur voorvriezen bij -40 °C, werd vriesdrogen uitgevoerd bij een schaptemperatuur van -50 °C gedurende 24 uur met een kamerdruk van 1-20 Pa in een vriesdroger (SJIA-10N, Ningbo Shuangjia Science Technology Development Co., Ltd., China).

Meting van deeltjesgrootte en inkapselingsefficiëntie van liposomen

De liposomensuspensie werd bereid door 5 mg proliposomenpoeder toe te voegen aan 5 ml gezuiverd water en vervolgens tweemaal gedurende 1 minuut te vortexen met een interval van 15 minuten voor volledige hydratatie. De grootte-analyse van de liposomen werd gekarakteriseerd met behulp van laserdeeltjesgrootte-analysator (Nano ZS90 Malvern Instruments, VK).

De inkapselingsefficiëntie van GA in liposomen werd bepaald door de ultrafiltratie-centrifugatietechniek. Pipetteer in het kort 1 ml liposomale dispersie (500 μg proliposomen in 5 ml gezuiverd water) in een maatkolf van 10 ml, gevolgd door 5 ml gezuiverd water, 2 ml aceton en verdun tot 10 ml met gezuiverd water. Breng 0,5 ml van deze suspensie over in de bovenste kamer van het centrifugefilter (Amicon Ultra-0.5, Millipore, Cdduounty Cork, Ierland) met een molecuulgewicht van 50 kDa, dat 30 minuten bij 15 °C bij 10.000 tpm werd gecentrifugeerd met behulp van een ultracentrifuge (CP70MX, Hitachi Koki Co., Ltd., Japan). Vervolgens werd 20 μl ultrafiltraat in het HPLC-systeem geïnjecteerd met een UV-absorptiegolflengte van 250 nm, en de inhoud van GA werd de inhoud van het vrije medicijn genoemd. De inkapselingsefficiëntie (EE) werd berekend volgens de volgende vergelijkingen

$$ \mathrm{EE}\left(\%\right)=\frac{W_{\mathrm{total}}-{W}_{\mathrm{free}}}{W_{\mathrm{total}}} \maal 100 $$ (1)

waar W _gratis is de hoeveelheid gratis medicijn en W _totaal is de hoeveelheid van het totale medicijn.

Bepaling van de sublimatiesnelheid van TBA/watermengsels

Een milliliter TBA/water-mengsels met verschillende TBA-volumepercentages (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% en 90%) werden in vriesdroogflesjes van 10 ml gedaan , respectievelijk. De TBA/water-mengsels werden 12 uur voorgevroren bij -40 ° C en vervolgens gevriesdroogd door lyofilisator (SJIA-10N, Ningbo Shuangjia Science Technology Development Co., Ltd., China) bij -50 ° C. De tijd werd geregistreerd toen TBA/water-mengsels volledig verdwenen uit vriesdroogflesjes, en de sublimatiesnelheid werd berekend door het volume (μl) te delen door de tijd (min).

Bepaling van de verzadigde dampdruk van TBA/watermengsels

De details van het experimentele apparaat en de werkingsprocedure werden elders beschreven [21, 22]. De dampdrukken van het systeem TBA/water (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% en 90%) werden gemeten met een statische methode. Het apparaat bestond uit een werkende ebulliometer gevuld met TBA/water-mengsel, een referentie-ebulliometer gevuld met zuiver water, een buffervat, twee condensors, twee temperatuurmetingen en een drukregelsysteem. De evenwichtsdruk van het systeem werd bepaald door de kooktemperatuur van zuiver water in de referentie-ebulliometer in termen van de temperatuur-drukrelatie weergegeven door de vergelijking van Antoine [23].

Bepaling van GA-oplosbaarheid

De oplosbaarheid in water van vrij GA werd bepaald door overmaat GA (10 mg) toe te voegen aan 10 ml zuiver water onder magnetisch roeren (300 tpm) in een thermostatisch geregeld waterbad (DF-101S, Henan Yuhua instrument Co., Ltd., China) bij 25°C totdat evenwicht is bereikt (48 uur). De monsters werden gefilterd door een membraanfilter van 0,45 m, op geschikte wijze verdund met methanol en geanalyseerd met HPLC [24]. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd.

Waarneming van oppervlaktemorfologie van voorgevroren TBA-/watermengsels

Vijf milliliter water/tert-butanol-mengsels werden in een petrischaal van 90 mm gegoten en vervolgens in de koude val (-40 °C) ingevroren; de bevroren monsters werden waargenomen met behulp van een XSP-4C optische microscoop (Shanghai Changfang Optical Instrument Co. Ltd., Shanghai, China).

Transmissie-elektronenmicroscopie

Het uiterlijk van liposomen werd waargenomen door Hitachi HT7700 transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) (Hitachi, Japan) bij een versnellende spanning van 100 kV. De liposomensuspensie werd verkregen door 5 mg proliposomenpoeder toe te voegen aan 5 ml gezuiverd water bij kamertemperatuur, gedurende 10 seconden gemengd door middel van vortexen en vervolgens 30 seconden te laten staan. Een druppel werd onttrokken met een micropipet en vervolgens op een met koolstof gecoat koperen rooster geplaatst. De overmaat van de suspensie werd verwijderd door het rooster te blotten met een filtreerpapier. Negatieve kleuring met een 1% fosfowolfraamzuuroplossing (w /w , pH 7,1) werd direct op de afzetting aangebracht. De overmaat werd verwijderd met een filtreerpapier en de afzetting werd voor analyse gedroogd.

Fourier Transform Infraroodspectroscopie

De Fourier-transformatie infraroodspectroscopie (FTIR) spectra van monsters werden verkregen op een Nicolet 6700 FTIR-spectrofotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA, VS). Elk monster en kaliumbromide werd gemengd door een agaatmortier en samengeperst tot een dunne schijf. Het scanbereik was 4000–400 cm⁻¹ en de resolutie was 4 cm⁻¹ .

Differentiële scanningcalorimetrie

Differentiële scanning calorimetrie (DSC) metingen werden uitgevoerd op een HSC-1 DSC scanning calorimeter (Hengjiu Instrument, Ltd., Beijing, China). Monsters van 15 mg werden in aluminium pannen geplaatst en in de monsterpan-pers verzegeld. De sondes werden onder een stikstofatmosfeer verwarmd van 25 tot 350 °C met een snelheid van 10 °C/min.

Röntgendiffractie

De structurele eigenschappen van monsters werden verkregen met behulp van de D8 Focus röntgendiffractometer (Bruker, Duitsland) met Cu-Ka-straling. Metingen werden uitgevoerd bij een spanning van 40 kV en 40 mA. Monsters werden gescand van 5° tot 60° en de scansnelheid was 5°/min.

Stabiliteit van GA Proliposome

GA-proliposoompoeders werden overgebracht in een glazen fles, gevuld met stikstof, afgesloten en bij kamertemperatuur uit het licht bewaard. De stabiliteitstest werd gedurende 6 maanden uitgevoerd door de invangefficiëntie en de deeltjesgrootte van de gereconstitueerde liposomen als indexen te gebruiken.

In vitro geneesmiddelafgifte

Afgifte van GA uit liposomen werd waargenomen met behulp van de dialysemethode bij 37 ± 0,5 °C. Na reconstitutie van liposomen in PBS (pH 7,4) of normale zoutoplossing om 0,5 mg/ml GA te maken, werd een aliquot van elke liposomale dispersie (5 ml) in een dialysezak gedaan (molecuulgewichtgrens 8000-14.000 Da) en werd goed afgesloten. Vervolgens werd de buis ondergedompeld in 150 ml afgiftemedium, PBS (pH 7,4) of normale zoutoplossing met 0,1% (v) /v ) Tween 80 om de conditie van de gootsteen te behouden [25, 26]. Terwijl het afgiftemedium met behulp van de magnetische roerder bij 300 rpm werd geroerd, werden met vooraf bepaalde tijdsintervallen monsters (1,5 ml) genomen uit het afgiftemedium gedurende 12 uur, dat opnieuw werd gevuld met hetzelfde volume vers medium. Concentratie van GA werd bepaald door HPLC na geschikte verdunning met methanol.

In vitro cellulaire opname

De fluorescentieliposomen werden bereid door middel van een monofase-oplossingsmethode voor lyofilisatie. In het kort werd een mengsel van 30 mg GA, 254 mg SPC, 75,5 mg cholesterol en 21,2 mg FITC-PEG-DSPE opgelost in TBA. Verder werd 1016 mg trehalose opgelost in water. Vervolgens werden deze twee oplossingen gemengd om een heldere monofase-oplossing te krijgen (totaal volume 30 ml). Nadat de monofase-oplossing was gesteriliseerd door filtratie door poriën van 0,22 μm, werd deze afgevuld in de 10 ml vriesdroogflesjes met een vulvolume van 2,0 ml, vervolgens 24 uur gevriesdroogd en water toegevoegd om de liposomen tot gebruik te reconstitueren.

De HepG2-cellen (Wanleibio, Co., Ltd., Shenyang, China) werden gekweekt in DMEM met 10% FBS (foetaal runderserum). De cellen werden uitgeplaat totdat 90% confluentie was bereikt in platen met 6 putjes, en de cellen werden gekweekt in een bevochtigde incubator bij 37,0 ° C met 5,0% CO₂ . Na een incubatie van 24 uur werd 200 μl FITC-GA-liposomensuspensie toegevoegd aan 1 ml van de HepG2-celsuspensie (1 × 10⁴ cellen per putje). Na incubatie gedurende 0,5 uur, 1 uur, 2 uur en 4 uur werden de cellen driemaal gewassen met pH 7,4 PBS en werd de extracellulaire fluorescentie gedoofd met een 0,4% (w /v ) Trypaanblauwe oplossing. Cellen werden gelyseerd met 1% (w /v ) Triton X100. De fluorescentie-intensiteit van het cellulaire lysaat bij 495 nm-excitatie en 520 nm-emissie werd gemeten met behulp van een RF5301-fluorescentiespectrofotometer (Shimadzu, Tokyo, Japan). Relatieve fluorescentiewaarden werden omgezet in fosfolipideconcentraties op basis van een standaardcurve van fosfolipideconcentratie versus FITC-fluorescentie-intensiteit gemeten in de cellysebuffer. Eiwitconcentratie werd bepaald met behulp van BCA-eiwittestkit (Pierce, Rockford, IL, VS). Opname werd uitgedrukt als de hoeveelheid fosfolipiden versus per milligram cellulair eiwit [27].

Resultaten en discussie

Preformulatieonderzoek

Oplosbaarheidsonderzoek

Aangezien liposomen worden bereid met behulp van de monofase-oplossingsmethode voor vriesdrogen, werd een oplosbaarheidsonderzoek uitgevoerd om ervoor te zorgen dat het geneesmiddel en het dragermateriaal vóór het vriesdrogen in de TBA/wateroplossing konden oplossen.

Figuur 1 toont de veranderingen in de verzadigde oplosbaarheid van GA in TBA/water co-oplosmiddelsysteem met verschillende volumepercentages. Binnen 25 °C tot 45 °C nam de verzadigde oplosbaarheid van GA continu toe met een toenemend TBA-volumepercentage van 10 tot 60%, en de verzadigde oplosbaarheid van GA was> 0,5 mg/ml wanneer het TBA-volumepercentage> 40% was. Aan de andere kant nam de verzadigde oplosbaarheid van GA toe met toenemende temperatuur van de TBA/wateroplossing, wanneer deze op hetzelfde volumepercentage werd gehouden. Het verschil in oplosbaarheid bij verschillende temperaturen werd steeds duidelijker toen het volumepercentage TBA 30% bereikte. De oplosbaarheid van sojafosfolipiden en cholesterol in het TBA/water-co-oplosmiddelsysteem wordt weergegeven in de gestapelde kolomgrafiek (Fig. 2). Figuur 2a, b geeft het volume TBA/water-mengsel weer dat nodig is voor een eenheid (1 mg) fosfolipiden en cholesterol om respectievelijk onder verschillende temperaturen verzadigde oplosbaarheid te bereiken. Het grijze gebied vertegenwoordigt het watervolume en het zwarte gebied vertegenwoordigt het volume TBA. Naarmate de temperatuur geleidelijk toenam van 25 tot 45 °C, nam het totale volume TBA/water co-oplosmiddel en het volumepercentage TBA (labels op de kolommen) dat nodig was om 1 mg fosfolipide op te lossen geleidelijk af (Fig. 2a). Naarmate de temperatuur tot boven de 35 °C steeg, nam het benodigde volume TBA aanzienlijk af en was lager dan 0,15 ml. Evenzo, toen de temperatuur geleidelijk steeg van 25 tot 45 °C, was er een afname van het TBA-volume dat nodig was om 1 mg cholesterol op te lossen, terwijl het TBA-volumepercentage een trend naar een geleidelijke afname vertoonde. De bovenstaande resultaten toonden aan dat temperatuur en TBA-volumepercentage een grote invloed hebben op de oplosbaarheid van fosfolipiden, cholesterol en GA.

Verzadigde oplosbaarheid van GA in TBA/water co-oplosmiddel met verschillend volumepercentage (gemiddelde ± SD, n = 3)

Oplosbaarheid van SPC (a ) en cholesterol (b ) in TBA/water co-oplosmiddel met verschillend volumepercentage

Vergelijking van de sublimatiesnelheid van het TBA/water-co-oplosmiddelsysteem met verschillend volumepercentage

De sublimatiesnelheid heeft rechtstreeks invloed op de productie-efficiëntie van gevriesdroogd poeder. Een snellere sublimatiesnelheid is zuiniger en kan instorting van materialen voorkomen [16]. In deze studie hebben we de sublimatiesnelheden van verschillende concentraties TBA / watersystemen onderzocht. Zoals getoond in Fig. 3, nam de sublimatiesnelheid van het gemengde oplosmiddel geleidelijk toe naarmate het volumepercentage TBA toenam van 10 tot 90%. Bovendien bereikte de sublimatiesnelheid meer dan 10 μl/min, aangezien het volumepercentage 60% overschreed.

Sublimatiesnelheid van TBA/water co-oplosmiddel met verschillend volumepercentage (gemiddelde ± SD, n = 3)

Om de reden voor het verschil in sublimatiesnelheid van TBA met verschillende volumepercentages te identificeren, hebben we eerst de oppervlaktemorfologie van de bevroren monsters onderzocht. Figuur 4 bevat de optische microscopische beelden van de TBA/water-oplossing met 40% tot 80% volumepercentage (TBA met < 30% volumepercentage kon niet worden onderzocht omdat het snel smolt onder de optische microscoop). Vergeleken met TBA met 40% volumepercentage, heeft TBA met> 50% volume duidelijke en verspreide naaldvormige structuren. We speculeren dat naarmate het volumepercentage van TBA toeneemt, de diameter van de naaldvormige kristallen kleiner wordt, wat resulteert in een toename van het specifieke oppervlak en dus een toename van de sublimatiesnelheid.

Oppervlaktemorfologie van TBA / water-co-oplosmiddel van verschillende TBA-volumepercentages door optische microscoop (vergroting × 100). een 40%. b 50%. c 60%. d 70%. e 80%

Daarnaast hebben we ook de verzadigde dampdruk gemeten van het TBA/water co-solvent systeem met verschillende volumepercentages bij 25 °C. Figuur 5 is een staafdiagram van de veranderingen in de verzadigde dampdruk van een TBA/water-co-oplosmiddelsysteem met verschillende TBA-volumepercentages. Zoals weergegeven in de figuur, heeft de verzadigde dampdruk van het gemengde oplosmiddel de neiging om geleidelijk toe te nemen naarmate het volumepercentage van TBA toeneemt. Aangezien de temperatuur positief gecorreleerd is met de verzadigde dampdruk, kunnen we volgens de Antoine-vergelijking (Vgl. 2) afleiden dat de verzadigde dampdruk van het co-oplosmiddelsysteem onder de vriesdroogtemperatuur (-50 ° C) zal toenemen naarmate het volumepercentage van TBA neemt toe, en dit kan een van de redenen zijn voor de geleidelijke toename van de sublimatiesnelheid.

$$ {\log}_{10}p=A-\frac{B}{T} $$ (2)

waar p is de dampdruk, T is temperatuur, A en B zijn componentspecifieke constanten.

Verzadigde dampdruk van TBA/water co-oplosmiddel met verschillend volumepercentage (gemiddelde ± SD, n = 3)

Effect van de vriesdroging op de fysische en chemische eigenschappen van GA in het TBA/water-co-oplosmiddelsysteem met verschillend volumepercentage

Om het effect van vriesdrogen op fysisch-chemische eigenschappen van GA in TBA/water co-oplosmiddelsysteem te onderzoeken, werd het volgende experiment uitgevoerd. Tien milligram GA werd opgelost in 8 ml TBA/water co-oplosmiddel met verschillende TBA-volumepercentages (40%, 50%, 60%, 70% en 80%). Nadat de monofase-oplossing was gesteriliseerd door filtratie door poriën van 0,22 m, werd deze afgevuld in de 10 ml vriesdroogflesjes met een vulvolume van 2,0 ml. Vriesdrogen werd 24 uur bij -50 °C uitgevoerd door middel van een vriesdroger.

De DSC-spectra van het gevriesdroogde poeder na het oplossen van GA in een TBA/water-co-oplosmiddelsysteem met een verschillend TBA-volumepercentage wordt getoond in figuur 6a. De DSC-curve van het ruwe medicijn vertoont een duidelijke endotherme piek bij 301 ° C, het smeltpunt van GA. Lyofilisatie in TBA/water-co-oplosmiddelsysteem met verschillend TBA-volumepercentage veroorzaakte een voorwaartse verschuiving van de GA-smeltpiek. De omvang van de smeltpiekverschuiving nam toe naarmate het TBA-volumepercentage afnam.

DSC (een ), XRD (b ), en FTIR (c ) van GA na lyofilisatie in TBA/water co-oplosmiddel met verschillend volumepercentage; (a) GA, (b) 40% TBA, (c ) 50% TBA, (d) 60% TBA, (e) 70% TBA en (f) 80% TBA

Eerder onderzoek heeft al aangetoond dat de concentratie van TBA de vorming van een complex mengsel van kristallijne, amorfe of metastabiele fasen sterk kan beïnvloeden [28]. In sommige gevallen kan het gebruik van TBA resulteren in een vermindering van de kristalliniteit, en in een ander geval is het tegenovergestelde het geval [29].

De röntgendiffractie (XRD) spectra van het gevriesdroogde poeder na oplossen van GA in TBA/water co-oplosmiddelsysteem met verschillend TBA-volumepercentage worden getoond in Fig. 6b. Het XRD-spectrum van het ruwe geneesmiddel vertoont verschillende duidelijke kristaldiffractiepieken tussen 5° en 20°. Lyofilisatie in TBA/water co-oplosmiddelsysteem met verschillende TBA-volumepercentages veroorzaakte het verdwijnen van diffractiepieken bij 5° tot 20° in de XRD-spectra van de monsters. Dit gaf aan dat het oorspronkelijke medicijnkristal amorf was geworden.

De FTIR-spectra van het gevriesdroogde poeder na oplossen van GA in TBA/water co-oplosmiddelsysteem met verschillend TBA-volumepercentage worden getoond in Fig. 6c. De vorm van het FTIR-spectrum van het onbewerkte geneesmiddel komt overeen met die van het gevriesdroogde poeder in een TBA/water-co-oplosmiddelsysteem met een verschillend TBA-volumepercentage binnen de 4000-400 cm⁻¹ bereik. Er waren geen karakteristieke pieken voor nieuwe functionele groepen, wat aantoont dat de chemische structuur van GA hetzelfde bleef na lyofilisatie in TBA met een ander volumepercentage.

De verandering van een kristallijne naar een amorfe vorm kan de oplosbaarheid van geneesmiddelen veranderen, waardoor de inkapseling van proliposoom tijdens gehydrateerde reconstructie wordt beïnvloed. In deze studie hebben we de oplosbaarheid in water van gevriesdroogd GA-poeder bij 25 ° C gemeten. We ontdekten dat de verzadigde oplosbaarheid van het gevriesdroogde GA in water geleidelijk afnam van 64,10 tot 19,27 μg/ml naarmate het TBA-volumepercentage toenam van 40 tot 80%. Het was echter nog steeds significant hoger dan de oplosbaarheid in water van het ruwe medicijn (6,36 μg/ml), wat aangeeft dat de verandering van een kristallijne naar een amorfe structuur tijdens vriesdrogen de oplosbaarheid van het ruwe medicijn beïnvloedt (Fig. 7).

Waterige oplosbaarheid van GA-lyofilisatie in TBA/water co-oplosmiddel met verschillend volumepercentage (gemiddelde ± SD, n = 3)

Single-Factor Experiment

Er zijn veel factoren die de kwaliteit van liposomen kunnen beïnvloeden. Het is algemeen bekend dat fosfolipide/geneesmiddelverhoudingen een effect hebben op de ingekapselde kwaliteit van het geneesmiddel [30]. Matige hoeveelheden cholesterol kunnen de geordende rangschikking van het lipidemembraan en de stabiliteit verhogen. However, high content of cholesterol in the liposome can decrease the flexibility of membrane and thereby hinder the penetration of drug into the lipid bilayer [31]. In this study, we selected three factors that impact on liposome quality and performed a single-factor study to determine the appropriate values for subsequent optimization tests, including quantity of SPC, quantity of cholesterol, and volume percentage of TBA in the co-solvent. The quality of liposomes was evaluated in terms of encapsulation efficiency and mean diameter. Each experiment was performed in triplicate with all other parameters set to constant value, GA 60 mg, pre-freeze temperature − 40 °C, pre-freeze time 12 h. In this study, we compared the results via a scoring system, giving equal weight to both encapsulation rate and mean diameter. Scoring was conducted as follows:

$$ \mathrm{Score}=\frac{\mathrm{EE}}{\mathrm{MEE}}\times 50\%-\frac{\mathrm{MD}}{\mathrm{MMD}}\times 50\% $$ (3)

where EE is encapsulation efficiency, MEE is maximum encapsulation efficiency of the group, MD is mean diameter, and MMD is maximum mean diameter of the group.

The experimental design and result are shown in Table 1. As can be seen in the table, within the range tested in this experiment, the highest score can be obtained separately when the amount of SPC is 480 mg (drug-SPC ratio of 1:8, w /w ), the amount of cholesterol is120 mg (cholesterol-SPC ratio of 1:4, w /w ), and volume percentage of TBA in the co-solvent is 50%. Therefore, these parameters were chosen as the center level of response surface optimization design, respectively.

Parameter Optimization by Box-Benhnken Design

To further study the interactions between the various factors, parameter optimization was performed by Box-Benhnken design. Based on the results of single-factor experiments, we investigated and optimized the interactions between the parameters, including quantity of SPC (X ₁ ), quantity of cholesterol (X ₂ ), volume percentage of TBA (X ₃ ) by Box-Benhnken design (BBD). Encapsulation efficiency (Y ₁ ) and mean diameter (Y ₂ ) were selected as responses. Optimization process was undertaken with desirability function to optimize the two responses simultaneously. We suppose that Y ₁ en J ₂ have the same weightiness (importance). Y ₁ had to be maximized, while Y ₂ had to be minimized. The desirable ranges are from 0 to 1 (least to most desirable). Experimental design and results are shown in Table 2. To find the most important effects and interactions, analysis of variance (ANOVA) was calculated by statistical software, Design Expert trial version 8.03 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA). Two quadratic models were selected as suitable statistical model for optimization for two responses encapsulation efficiency and mean diameter. The results of ANOVA relating encapsulation efficiency as response were shown in Table 3, indicating that the model was significant for all factors investigated with F value of 12.81 (P < 0.05). In this case, X ₁ , X ₂ , X ₁ X ₂ , X ₁ X ₁ , X ₂ X ₂ were significant model terms (P < 0.05), demonstrating that the influences of the factors (X ₁ and X ₂ ) on encapsulation efficiency were not simply linear. The interaction terms were notably significant, indicating good interactions between the factors. On the contrary, the ANOVA results relating mean diameter as response (Table 3) indicated that the model was not significant for all factors investigated with F value of 1.9 (P> 0,05). In this case, X ₃ were significant model terms (P < 0.05), demonstrating that volume percentage of TBA have significant influence on mean diameter, while quantity of SPC (X ₁ ) and quantity of cholesterol (X ₂ ) do not have a significant effect (P> 0,05). Moreover, there were no significant interactions between the three variables.

In order to provide a better visualization of the effect of the independent variables on the two responses and desirability value, three-dimensional profiles of multiple non-linear regression models are depicted in Fig. 8. Figure 8a–f presented the interaction of X ₁ , X ₂ , and X ₃ under encapsulation efficiency and mean diameter as response respectively. The three-dimensional profiles demonstrated how three pairs of parameters affect the encapsulation efficiency and mean diameter of reconstituted liposomes. For encapsulation efficiency, all the three surfaces are upper convex (Fig. 8a–c), with a maximum point in the center of the experimental domain, which demonstrated that there are good interactions between the three variables. For mean diameter, the shape of Fig. 8d is similar to flat surface, indicating that X ₁ and X ₂ have less effect on mean diameter. The surface contours of Fig. 8e, f both showed a slope; the mean diameter was decreased by increasing the volume percentage of TBA, indicating that factor X ₃ had an obvious effect on mean diameter but there was no obvious interaction between X ₃ and the other two factors.

Three dimensional plots of the effect of X X (a ), X X (b ) and X X (c ) on encapsulation efficiency and the effect of X X (d), X X (e) and X X (f) on mean diameter

Based on the quadratic model, the optimal conditions for liposomes preparation calculated by software were as follows:508 mg phospholipid quantity, 151 mg cholesterol quantity, and 55% volume percentage of TBA. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were found to be 68.55% and 220 nm, respectively.

Selection of the Type and Dosage of Lyoprotectant

Competition for liquid water between the growing ice crystals and the hydrophilic substances (including the hydrophilic portion of the lipid membrane) during freezing leads to adhesion of ice crystals to the phospholipid groups. This can result in damage to the lipid membrane. Lipid membrane fusion following rehydration causes an increase in particle size and leakage of encapsulated drug. Lyoprotectant can reduce liposomal damage during the freeze-thaw process [32]. In this study, we investigated the effect of various types (lactose, sucrose, trehalose, mannitol) and dosage (lyoprotectant to SPC ratio was 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, and 6:1 w /w ) of lyoprotectant on scores of reconstituted liposome. Single-factor experiments were performed while maintaining all other variables constant:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, pre-freeze temperature of − 40 °C, pre-freeze time of 12 h. Experimental results are shown in Fig. 9. The encapsulation efficiency increases firstly and then decreases by decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio from 1:2 to 1:6, wherein lactose, sucrose, and mannitol are respectively used as lyoprotectant. However, the encapsulation efficiency of the trehalose group increases constantly with decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio (Fig. 9a). In terms of the mean diameter (Fig. 9b), it was found that the mean diameter was greater than 218 nm for lactose, sucrose, and mannitol group in the range from 1:2 to1:6. Nevertheless, the mean diameter of trehalose group can be reduced to less than 190 nm when lyoprotectant/SPC weight ratio is more than 4:1; obviously, the protective effect of trehalose is better than other lyoprotectants tested. Trehalose has a good protection ability for membrane, perhaps because of the formation of hydrogen bonds with the polar head groups of lipids, and disruption of the tetrahedral hydrogen bond network of water [33]. According to scores (Fig. 9c), the highest score (0.24) was obtained when trehalose/SPC weight ratio is 4:1 and 6:1. Finally, we choose trehalose and 4:1 (trehalose/SPC weight ratio) for following experiments from the perspective of cost and increasing drug loading.

The effect of mass ratio between cryoprotectant and SPC on encapsulation efficiency (a ), mean diameter (b ) and scores (c ) of reconstituted liposomes (mean ± SD, n =3)

Through the above Box-Benhnken design and lyoprotectant screening experiment, the experimental conditions were determinated:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, weight ratio of trehalose to SPC was 4:1. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were 74.87% and 191 nm, respectively.

Transmission Electron Microscopy

In this study, TEM of liposomes suspension was taken at the same time point (same hydration time). We have observed different states in the sample, which could explain the self-assembly behavior of the liposomes. Figure 10a shows the initial state of hydration; it can be seen that a large amount of GA (black dots) is wrapped in dispersed phospholipids (translucent material), and spontaneous aggregation of the phospholipid fragments occurs. Figure 10b shows the morphology of fully assembled liposomes (average diameter of about 200 nm), which were nearly spherical with a phospholipid bilayer structure (the light-gray portion). Moreover, the drug particles (dark gray dots) were entrapped in the lipid bilayer.

Transmission electron micrographs of reconstituted liposomes, (a ) initial state of hydration of proliposomes, (b ) fully assembled liposomes

Stability of GA Proliposome

After 6 months, the proliposome powders have a good mobility and an unaltered appearance. The liposome suspension formed automatically when in contact with purified water. The entrapment efficiency and particle size of the reconstituted liposome were 72.82% and 198 nm. There is no significant difference from the data of the reconstituted liposome 6 months before. Therefore, the GA proliposome could be considered stable at 25 °C for over 6 months.

In Vitro Drug Release Studies

Evaluation of in vitro drug release from encapsulated liposome was done by dialysis method. The in vitro release profiles of GA from GA-loaded liposomes at 37 °C in PBS (pH 7.4) and physiological saline solution are shown in Fig. 11. The release profile of both group showed a fast release (the larger slope) within 1 h, then curve slope becomes smaller after 1 h, the release rate begins to slow down. The drug-release curve shapes of physiological saline solution group are similar to PBS group. The in vitro release of GA from the GA-loaded liposomes was 65.25 ± 4.82% and 69.46 ± 4.32% from PBS and physiological saline solution in 12 h. No significant difference (P = 0.088, paired t test, SPSS software17.0) was found for the release of GA at different release medium over the entire study period, which demonstrated that the reconstituted liposomes have both sustained-release performance in two kinds of release medium.

In vitro dissolution profiles of GA from GA-loaded liposomes in a PBS and b physiological saline solution (mean ± SD, n = 3)

In Vitro Cell Uptake

Figure 12a showed that the uptake process of GA-liposomes by Hep G2 cells is time-dependent under the experimental concentrations. After incubation for 30 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) by Hep G2 cells were 1480 ng. In the range from 30 to 240 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) were gradually increased from 1480 to 2030 ng. Figure 12b–e showed fluorescence microscopy images of Hep G2 cells at 30, 60, 120, and 240 min after ingestion of drug-loaded liposomes, and it is observed that the fluorescence intensity is also gradually increased over time. This result indicates that the reconstituted liposomes prepared by monophase solution method can be effectively uptaken by the hepatoma cells.

In vitro cellular uptake of GA-loaded liposomes by Hep G2 cells. een The uptake amount versus incubation time. b –e Fluorescence microscopy images at 30, 60, 120, and 240 min

Conclusions

In the present work, preformulation investigation, formulation design along with in vitro characterization of GA-loaded liposomes by lyophilization monophase solution method have been done. After carrying out a preformulation study, we found that solubility of GA, cholesterol, and SPC in TBA/water co-solvent was substantially increased when temperature was over 40 °C. Sublimation rate of co-solvent gradually increased with increasing TBA volume percentage, which perhaps relate to surface morphology of the frozen co-solvent and saturated vapor pressure. After lyophilization using TBA/water co-solvent system, GA became amorphous structure; moreover, water solubility increased. This may have an effect on proliposome encapsulation during hydrated reconstruction. After optimization by Box-Benhnken design and screening of lyoprotectant, the optimum conditions (508 mg SPC, 151 mg cholesterol, 55% volume percentage of TBA, 4:1 trehalose/SPC weight ratio) for lyophilization monophase solution process were achieved. Under the optimum conditions, satisfactory encapsulation efficiency (74.87%) and mean diameter (191 nm) of reconstituted liposomes were obtained. The reconstituted liposomes resulted in initial assemble and final spherical shape, as confirmed by TEM analysis. The in vitro release profile of the produced GA-loaded liposome was investigated in the two media and it both showed prolonged release during 12 h. Cellular uptake studies showed that the uptake process of reconstituted liposomes by Hep G2 cells is time-dependent.

Afkortingen

BBD:: Box-Benhnken design
DSC:: Differentiële scanningcalorimetrie
EE:: Encapsulation efficiency
FTIR:: Fourier-transformatie infraroodspectroscopie
GA:: Glycyrrhetinic acid
MD:: Mean diameter
SPC:: Soybean phosphatidylcholine
TBA:: Tert-butyl alcohol
TEM:: Transmissie-elektronenmicroscopie
XRD:: Röntgendiffractie

Autofagie-remmer (LY294002) en 5-fluorouracil (5-FU) combinatie-gebaseerd nanoliposoom voor verbeterde werkzaamheid tegen slokdarm-plaveiselcelcarcinoom Olie-nano-inkapseling:ontwikkeling, toepassing en integratie in de voedselmarkt

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal