Door zirkoniumoxide veroorzaakte toxische effecten in osteoblastachtige 3T3-E1-cellen

Abstract

Zirkonia (ZrO₂ ) is een van de meest gebruikte metaaloxiden voor potentiële bio-toepassingen zoals biosensoren, kankertherapie, implantaten en tandheelkunde vanwege de hoge mechanische sterkte en minder toxiciteit. Vanwege hun wijdverbreide toepassingen is de potentiële blootstelling aan deze nanodeeltjes (NP's) toegenomen, wat veel aandacht heeft gekregen. Het is dus dringend noodzakelijk om het toxicologische profiel van ZrO₂ . te onderzoeken NP's. Titaandioxide (TiO₂ ) is een ander veelgebruikt nanomateriaal waarvan bekend is dat het zwak giftig is. In deze studie heeft TiO₂ NP's dienden als controle om de biocompatibiliteit van ZrO₂ . te evalueren NP's. We hebben de cytotoxiciteit van TiO₂ . gedetecteerd en ZrO₂ NP's in osteoblastachtige 3T3-E1-cellen en ontdekten dat reactieve zuurstofspecies (ROS) een cruciale rol speelden in de TiO₂ en ZrO₂ NP-geïnduceerde cytotoxiciteit met concentratieafhankelijke wijze. We lieten ook TiO₂ . zien en ZrO₂ NP's kunnen apoptose en morfologieveranderingen induceren na kweken met 3T3-E1-cellen in hoge concentraties. Bovendien, TiO₂ en ZrO₂ NP's bij hoge concentraties zouden celosteogene differentiatie kunnen remmen, vergeleken met die bij lage concentraties. Tot slot, TiO₂ en ZrO₂ NP's zouden in vitro cytotoxische reacties kunnen induceren op een concentratieafhankelijke manier, die ook osteogenese kan beïnvloeden; ZrO₂ NP's vertoonden krachtiger toxische effecten dan TiO₂ NP's.

Inleiding

In de afgelopen decennia is de toepassing van gemanipuleerde nanodeeltjes (NP's) uitgebreid op verschillende gebieden, zoals elektronica, biomedische toepassingen en farmaceutica. Zirkonia (ZrO₂ ) NP's zijn een van de belangrijkste nanomaterialen die worden gebruikt voor het synthetiseren van vuurvaste materialen, gietzand en keramiek. Vanwege de mechanische sterkte die de voorkeur heeft, wordt dit materiaal ook gebruikt op biomedisch gebied, waaronder biosensoren, kankertherapie, implantaten, gewrichtsprothesen en tandheelkunde [1, 2]. De brede toepassing van deeltjes heeft echter geleid tot bezorgdheid over hun potentiële risico's voor de gezondheid en het milieu, waarvan het waarborgen van de veiligheid op het werk en de consument een essentieel punt van zorg is. Tot dusver zijn toxicologische onderzoeken naar ZrO₂ NP's zijn beperkt en de resultaten waren controversieel.

Sommige onderzoeken hebben gemeld dat ZrO₂ NP's vertoonden een betere biocompatibiliteit in vergelijking met andere nanomaterialen, waaronder ijzeroxide, titaniumdioxide (TiO₂ ), en zinkoxide (ZnO) [3,4,5,6]. In overeenstemming met deze resultaten hebben anderen ZrO₂ . gerapporteerd NP kan milde [3, 7] of geen cytotoxische effecten [8,9,10] induceren, en slechts enkele onderzoeken wezen op een licht cytotoxisch potentieel. Echter, Stoccoro et al. [11] ontwikkelde de toxische effecten van ZrO₂ NP's en TiO₂ NP's gecoat of niet, ze ontdekten dat alle soorten NP's in verschillende mate toxische effecten vertoonden. Bovendien werden in een ander onderzoek na ZrO₂ celmorfologieveranderingen en scheuren op het celoppervlak waargenomen. NP-behandeling bij concentraties tot 1 mg/ml in de rode bloedcellen [12]. Daarom hebben we in deze studie de cytotoxische effecten van ZrO₂ . geëvalueerd NP's, die nuttig inzicht verschaffen voor hun toekomstige toepassing in vivo. Ondertussen behandelden we de cellen met TiO₂ NP's als de controlegroep, waarvan het toxicologische profiel goed is ontwikkeld [13].

Eerdere studies toonden aan dat NP's op grote schaal zijn gebruikt als weefsel-engineered materialen en het vermogen hebben om de osteogene differentiatie van osteoblast te verbeteren [14,15,16,17]. Eén rapport gaf aan dat silica (Si) NP's leeftijdsgebonden botverlies bij muizen zouden kunnen omkeren, waarschijnlijk als gevolg van de door Si NP geïnduceerde botvorming [16]. Liu et al. [14] ontdekte dat met zilver (Ag) NP's/poly (DL-melk-co-glycolzuur) gecoate roestvrijstalen legering een sterk antibacterieel vermogen heeft en de osteoblastische proliferatie en rijping van MC3T3-E1-cellen in vitro zou kunnen bevorderen. Bovendien werd gemeld dat koolstofnanobuisjes botverkalking induceren, hoogstwaarschijnlijk het gevolg van hun nanostructuren die vergelijkbaar zijn met de grootte van intracellulaire organellen [18].

ZrO₂ NP's zijn toegepast als het hoofdbestanddeel van biokeramische implantaten, vanwege de biocompatibiliteit en weerstand tegen biocorrosie [19]. Hoewel de meeste onderzoeken zich hebben gericht op de gunstige eigenschappen van ZrO₂ NP's kunnen de nadelige biologische effecten onmogelijk worden verwaarloosd. Daarom hebben we in deze studie TiO₂ . gebruikt , als controlegroep, een traditioneel nanomateriaal dat vergelijkbare fysisch-chemische eigenschappen vertoonde. We wilden de effecten van TiO₂ . onderzoeken en ZrO₂ NP's over cellevensvatbaarheid, oxidatieve stress, celmorfologie en osteogene reacties van MC3T3-E1-osteoblasten na co-cultuur en om zo de osteo-inductiviteit van TiO₂ te onthullen en ZrO₂ NP-behandeling.

Materialen en methoden

Voorbereiding en karakterisering van materialen

TiO₂ NP's (CAS-nummer 637262) en ZrO₂ NP's (CAS-nummer 544760) werden gekocht bij Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) en gekarakteriseerd door transmissie-elektronenmicroscoop (TEM, MFP-3D-S, Asylum Research, Santa Barbara, CA, VS) , Zeta-potentiaal en dynamische lichtverstrooiing (DLS) deeltjesgrootteanalysemetingen (Zetasizer Nano ZS, Malvern, VK). De NP's werden gedispergeerd in alcohol voor TEM-detectie, wat de morfologie en deeltjesgrootte van NP's duidelijker zou kunnen laten zien. Bovendien werd de geaggregeerde grootte van de deeltjes gedetecteerd via DLS, waarbij volledig kweekmedium werd gebruikt om in overeenstemming te brengen met deeltjeskarakters die in celkweek werden toegepast. Vóór de celbehandeling werd de voorraadoplossing gedurende 30 minuten gedispergeerd door Ultrasonic Cell Disruption System (Ningbo Xinzhi Biotechnology, China) vergezeld van ijskoeling en verdund tot verschillende concentraties met volledig kweekmedium voorafgaand aan celexperimenten.

3T3-E1 celcultuur

3T3-E1-cellijn (de celbank van de Shanghai-infrastructuur voor openbaar onderzoek en ontwikkeling van de Chinese Academie voor Medische Wetenschappen, Shanghai, China) werd gekweekt in minimaal essentieel medium-alfa (α-MEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA , VS) met 10% foetaal runderserum (FBS, Thermo Fisher Scientific, VS) en 1% antibioticum/antimycoticum (Thermo Fisher Scientific, VS). Cellen werden geïncubeerd bij 37 ° C met 5% CO₂ in een voor 95% bevochtigde atmosfeer en het kweekmedium werd om de dag vervangen.

Celproliferatietest

Cellulaire levensvatbaarheid werd gedetecteerd met behulp van de CCK-8-assay (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto city, Japan). Cellen werden gezaaid in platen met 96 putjes met 5000 cellen per putje. TiO₂ NP's en ZrO₂ NP's werden vervolgens aan de platen met 96 putjes toegevoegd in seriële concentraties van 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 en 150 μg / ml gevolgd door incubatie gedurende 24 en 48 uur bij 37 ° C met 5% CO₂ , vergezeld van N -acetyl-l-cysteïne (NAC) of niet, die werden gebruikt om de ROS-productie te remmen. De controlegroep bleef onbehandeld. Vervolgens werd de CCK-8-test uitgevoerd door 110 μL detectiereagentia aan elk putje toe te voegen, en de platen met 96 putjes werden vervolgens nog eens 2 uur bij 37 ° C geïncubeerd. Om te voorkomen dat NP's interfereren met deze analytische test, werden de reagentia die in de platen met 96 putjes moesten worden getest, na een reactietijd van 2 uur overgebracht naar een nieuwe plaat met 96 putjes; de afgezette NP's en cellen werden in de primaire plaat achtergelaten. De optische dichtheid (OD) van elk putje werd gemeten bij een enkele golflengte van 450 nm met de microplaatlezer (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, VS). Elke behandeling werd uitgevoerd in zes herhalingen.

Annexine V-apoptose-analyse door middel van flowcytometrie

Cellen werden gekweekt in een plaat met 12 putjes met een dichtheid van 30.000 cellen/putje voor confluentie. Na TiO₂ NP en ZrO₂ NP-behandeling gedurende 48 uur, cellen werden gewassen met PBS en verzameld met behulp van EDTA-vrije trypsinebuffer. Cellen werden opnieuw gesuspendeerd met PBS-buffer in een concentratie van 25.000 cellen/ml en gecentrifugeerd bij 1000×g . Vervolgens werden cellen gekleurd met FITC Annexin V en PI (InvitrogenTM, VS) bij kamertemperatuur zonder blootstelling aan licht. Ten slotte werden cellen gemengd met 400 μL bindingsbuffer en onmiddellijk geanalyseerd met flowcytometrie (BD FACSAria III, BD, Franklin Lakes, NJ, VS).

ROS-generatieanalyse

De vorming van intracellulaire ROS werd bepaald met behulp van de Reactive Oxygen Species Assay Kit (Beyotime, Shanghai, China). In het kort, na wassen met PBS werden de cellen uitgezaaid in een plaat met 6 putjes bij 20.000 cellen/putje in 2 ml kweekmedium en behandeld met TiO₂ NP's en ZrO₂ NP's in een concentratie van 0, 10, 50 en 100 μg/ml gedurende 48 uur, al dan niet vergezeld van NAC. Na behandeling met TiO₂ NP's en ZrO₂ NP's, cellen werden verzameld en geïncubeerd met 10 μM DCFH-DA gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO₂ . Fluorescerende intensiteiten werden geanalyseerd op een BD FACSAria III (BD, Franklin Lakes, NJ, VS).

Confocale microscopie

Omdat een groot deel van de cellen in apoptose-status is veranderd, hebben we 24 uur gekozen als het tijdstip om de veranderingen in de cytoskeletstructuur van de cellen in onze studie te observeren. 3T3-E1-cellen werden uitgezaaid op glazen dekglaasjes en gekweekt in aanwezigheid van TiO₂ NP's en ZrO₂ NP's gedurende 24 uur. Cellen werden onmiddellijk na de behandeling drie keer gewassen met PBS-buffer en gefixeerd met 4% paraformaldehyde, gepermeabiliseerd met 0,1% Triton X-100 en geblokkeerd met PBS dat 5% BSA bevat. Vervolgens werden de cellen 's nachts bij 4 ° C geïncubeerd voor α-tubuline (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS, 1:4000) en de volgende dag 1 uur geladen met het FITC-gebonden secundaire antilichaam bij 37 ° C. wassen met PBS voor drie keer. Bijgevolg werd het cytoskelet 1 uur in het donker gekleurd door rhodamine-phalloidin (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS, 1:1000) en werden de kernen 20 minuten gekleurd met Hoechst 33342 (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS). Dekglaasjes werden onderzocht met behulp van een FV10i confocale microscoop (Olympus, Tokyo, Japan).

Mineralisatie-inductiedetectie

3T3-El-cellen werden uitgezaaid in een plaat met 6 putjes met een dichtheid van 15.000 cellen/putje. De cellen werden behandeld met TiO₂ NP's en ZrO₂ NP's in concentraties van 10 en 100 g / ml, en het kweekmedium met de nanomaterialen werd om de andere dag vervangen; de cellen werden voorzichtig gewassen via PBS om de resterende nanomaterialen te verwijderen voordat elk kweekmedium verandert. Na 7, 14 en 21 dagen kweken in aanwezigheid van TiO₂ NP's en ZrO₂ NP's werden de cellen gekleurd met alizarinerood S. Kort gezegd werden de cellen 30 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde bij 4 ° C en nog eens 20 minuten gekleurd met alizarinerood S-oplossing (40 mM, pH 4,1) bij omgevingstemperatuur. Na drie keer wassen met gedestilleerd water werden gemineraliseerde knobbeltjes waargenomen met een lichtmicroscoop (Olympus, Japan).

RNA-extractie en RT-PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd via TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS). Vervolgens werd de RNA-concentratie geëvalueerd met behulp van een ultraviolet-spectrofotometer. Het geïsoleerde RNA werd omgekeerd getranscribeerd naar cDNA met behulp van een RT-reagenskit (TaKaRa Bio, Dalian, China). Realtime PCR werd uitgevoerd met behulp van SYBR groen reagens (TaKaRa Bio, Dalian, China). Osteogenese-gerelateerde genen werden gedetecteerd, waaronder runt-gerelateerde transcriptiefactor 2 (RUNX2), collageen 1α1 (Col1α1), alkalische fosfatase (ALP), osteopontine (OPN), osteocalcine (OC) en bot-sialoproteïne (BSP). De gegevens zijn geanalyseerd met behulp van de 2^−ΔΔ CT-methode. De gebruikte primers staan vermeld in tabel 1.

Statistische analyse

De resultaten werden weergegeven als de gemiddelden ± SEM. Alle gegevens werden statistisch geanalyseerd met een ANOVA-test. De homogeniteit van de variantietest werd uitgevoerd en de T3-tests van Bonferroni en Dunnett werden gebruikt wanneer respectievelijk de gelijke variantie werd aangenomen en wanneer er geen homogeniteit was. p waarde kleiner dan 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Karakterisering van de TiO₂ en ZrO₂ NP's

We hebben eerst de TiO₂ . gekarakteriseerd NP en ZrO₂ NP-poeders via transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en dynamische lichtverstrooiing (DLS) (Fig. 1a, b, Tabel 2). De TEM- en SEM-afbeeldingen onthulden de deeltjesvormen en -groottes. De TiO₂ NP's waren kleine staafvormige bollen met een gemiddelde grootte van 25,4 ±-2,8 nm. De ZrO₂ NP's waren kleine staafvormige bollen met een gemiddelde grootte van 31,9 ± 1,9 nm. Om de grootte van TiO₂ . te meten NP's en ZrO₂ NP's in oplossing, DLS werd gebruikt en de deeltjes van TiO₂ NP's en ZrO₂ NP's breidden zich uit tot respectievelijk 81,2 nm en 93,1 nm, wat op een agglomeratie-effect duidde. De zeta-potentialen van TiO₂ NP's en ZrO₂ NP's waren respectievelijk 32,9 ± 5,4 mV en 42,4 ± 7,4 mV.

Kenmerken van de TiO₂ en ZrO₂ NP's. TiO₂ (een ) en ZrO₂ (b ) NP-morfologie en -grootte werden gedetecteerd met behulp van TEM. (c ) De co-cultuursituatie van 3T3-cellen en nanomaterialen werd waargenomen na TiO₂ en ZrO₂ NP-behandelingsconcentraties van 10, 50 en 100 μg/ml. (d ) De TEM-resultaten werden verkregen na TiO₂ en ZrO₂ NP-behandeling gedurende 1 uur

Vervolgens observeerden we de foto van 3T3-cellen na TiO₂ NP en ZrO₂ NP-blootstelling bij verschillende concentraties. We ontdekten dat de NP's gelijkmatig over de cellen werden verdeeld of zich verspreidden. De NP's vertoonden een krachtig aggregatievermogen bij hoge concentraties als gevolg van een kleine fractie NP's met waargenomen microschaal, terwijl een grote massa NP's klein was met nanoschaal en waarschijnlijk transloceert naar cellen die moeilijk te zien waren (figuur 1c). Bovendien, TEM-resultaten van cellen na TiO₂ en ZrO₂ NP-behandeling gedurende 1 uur is verkregen; onze gegevens toonden aan dat NP's kunnen worden getransloceerd naar cellulaire blaasjes. Ondertussen worden ook enkele organelbeschadigingen waargenomen, bijvoorbeeld mitochondriale zwelling en vacuole opgetreden.

TiO₂ en ZrO₂ NP-geïnduceerde toxische effecten in 3T3-E1-cel

We hebben de levensvatbaarheid van de cellen beoordeeld na TiO₂ NP en ZrO₂ NP-behandeling in serieconcentraties (10, 20, 40, 60, 80, 100, 150 g/ml). Voor TiO₂ NP's (Fig. 2a), na 24 uur incubatie, vonden we dat TiO₂ NP's waren niet-toxisch bij lagere doses (≤ 20 μg/ml), terwijl een duidelijke afname van de levensvatbaarheid van de cellen werd waargenomen bij hogere concentraties (> 20 μg/ml) (p < 0,001). Een meer dramatische afname van de levensvatbaarheid van de cellen in de behandelingsgroep van 20 g/ml werd waargenomen na 48 uur incubatie; TiO₂ NP's bij een concentratie van 20 μg/ml veroorzaakte afname van de levensvatbaarheid van de cellen (p < 0.01). Bovendien, hogere doses TiO₂ NP's (> 20 μg/ml) vertoonden een significante afname van de levensvatbaarheid van de cellen na 48 uur (p < 0,001). De levensvatbaarheid van de cellen bleef echter stabiel bij behandeling met 10 μg/ml TiO₂ NP's gedurende 48 uur. Bovendien, voor ZrO₂ NP's (Fig. 2b), werden vergelijkbare resultaten waargenomen in vergelijking met TiO₂ NP's; hogere toxische effecten werden waargenomen bij een concentratie van 150 μg/ml gedurende 48 uur, waarbij de levensvatbaarheid van de cellen onder de 50% daalde. Deze resultaten gaven aan dat TiO₂ en ZrO₂ NP's waren biocompatibel bij lagere doses. Deze twee nanomaterialen vertoonden echter een lichte cytotoxiciteit bij hoge toxische concentraties.

TiO₂ en ZrO₂ Door NP geïnduceerde afname van de levensvatbaarheid van cellen in 3T3-E1-cellen. 3T3-E1-cellen werden behandeld met TiO₂ (een ) en ZrO₂ (b ) NP's in concentraties van 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 en 150 μg / ml gedurende 24 en 48 uur, en vervolgens werd de levensvatbaarheid van de cellen gedetecteerd via de CCK-8-assay. Ondertussen werden de veranderingen in de levensvatbaarheid van de cellen gedetecteerd na NAC-behandeling, wat intracellulaire ROS zou kunnen elimineren. De resultaten vertegenwoordigen de gemiddelden ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001, vergeleken met de controle

NAC-remmingseffecten op de TiO₂ en ZrO₂ Door NP's geïnduceerde cytotoxiciteit

Vervolgens hebben we de remmende effecten gedetecteerd van NAC, een ROS-opruimingsmiddel. De resultaten toonden aan dat NAC mogelijk TiO₂ . remde (Fig. 2a) en ZrO₂ NP's (Fig. 2b) induceerden de levensvatbaarheid van de cellen na behandeling van 24 uur en 48 uur. Na NAC-remming werd de levensvatbaarheid van de cellen 24 uur gehandhaafd bij alle concentraties TiO₂ en ZrO₂ NP-behandeling behalve de hoogste concentratie (150 μg/ml). Hoewel het remmende effect enigszins was verminderd in cellen die werden behandeld met hoge concentraties TiO₂ (100 en 150 μg/ml) en ZrO₂ NP's (80, 100 en 150 g/ml) op een tijdstip van 48 uur werden geen krachtige veranderingen in de levensvatbaarheid van de cellen waargenomen voor concentraties lager dan 80 μg/ml, waar de levensvatbaarheid van de cellen significant hoger was dan die zonder NAC.

TiO₂ en ZrO₂ NPs-geïnduceerde ROS-generatie in 3T3-E1-cel

We hebben verder de ROS-generatie gedetecteerd na TiO₂ en ZrO₂ Blootstelling aan NP's in 3T3-E1-cellen (Fig. 3). Onze resultaten toonden aan dat TiO₂ en ZrO₂ NP's induceerden ROS-generatie na 24 uur, wat het meest significant was bij een concentratie van 100 μg / ml. Er was geen significante ROS-generatie voor TiO₂ NP's in een concentratie van 10 μg/ml, terwijl ZrO₂ NP's induceerden krachtige ROS-generatie bij dezelfde concentratie. Ondertussen zou NAC TiO₂ . aanzienlijk kunnen remmen en ZrO₂ NP-geïnduceerde ROS-generatie in 3T3-E1-cellen bij alle concentraties.

TiO₂ en ZrO₂ NP-geïnduceerde ROS-generatie in 3T3-E1-cellen. 3T3-E1-cellen werden behandeld met TiO₂ en ZrO₂ NP's in verschillende concentraties gedurende 48 uur en NAC (10 mM) werden gelijktijdig geïncubeerd en vervolgens werden de ROS-niveaus in de 3T3-E1-cellen gedetecteerd. De resultaten vertegenwoordigen de gemiddelden ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001, vergeleken met de controle

TiO₂ en ZrO₂ Door NP's geïnduceerde apoptose en necrose in 3T3-E1-cel

Celapoptose en necrose werden gedetecteerd na verschillende concentraties TiO₂ en ZrO₂ NP-blootstelling na 48 uur (Fig. 4). De rode stippen in het derde kwadrant vertegenwoordigden normale cellen, terwijl de rode stippen in het eerste kwadrant en het vierde kwadrant respectievelijk de vroege apoptotische cellen en late apoptotische of necrotische cellen vertegenwoordigden. Interessant genoeg gaven onze resultaten aan dat TiO₂ en ZrO₂ NP's kunnen apoptose induceren op concentratie- en tijdsafhankelijke manieren. De TiO₂ . volgen NP-blootstelling gedurende 48 uur werd geen significante celapoptose gedetecteerd bij concentraties van 10 μg/ml; bij concentraties van 50 en 100 μg/ml bereikte het percentage late apoptotische of necrotische cellen echter hoge niveaus. De ZrO₂ . volgen NP-blootstelling gedurende 48 uur vonden we ook geen celapoptose bij de concentratie van 10 g/ml, maar het percentage late apoptotische of necrotische cellen was 43,7% bij een groep van 50 μg/ml. Het meest interessante is dat significante vroege apoptose werd waargenomen (34,1%) bij een concentratie van 100 μg/ml na 48 uur behandeling. We ontdekten dat de vroege apoptoseniveaus van TiO₂ NP's waren significant hoger dan ZrO₂ NP's; de late apoptotische of necrotische niveaus waren echter in vers.

TiO₂ en ZrO₂ NP-geïnduceerde apoptose in 3T3-E1-cellen. een Nadat de 3T3-E1-cellen waren behandeld met de TiO₂ en ZrO₂ NP's bij verschillende concentraties gedurende 48 uur werden de niveaus van celapoptose gedetecteerd. b De apoptotische niveaus inclusief vroege apoptose en late apoptose niveaus werden berekend, en vervolgens voerden de gegevens de statistieken uit. De resultaten vertegenwoordigen de gemiddelden ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001, vergeleken met de controle

TiO₂ en ZrO₂ NP-geïnduceerde morfologische veranderingen in 3T3-E1-cellen

Om de morfologische veranderingen van 3T3-E1-cellen te bestuderen na blootstelling aan TiO₂ en ZrO₂ NP's, voerden we fluorescentiekleuring uit gevolgd door confocale microscopie (figuren 5 en 6). In vergelijking met onbehandelde controlecellen was er geen morfologische verandering na 10 μg/ml TiO₂ en ZrO₂ NP-behandeling na 24 uur, terwijl cellen rond en kleiner werden na 100 μg/ml TiO₂ en ZrO₂ NP behandeling. Het meest interessante is dat een lichte afname van het celoppervlak werd waargenomen na 50 μg/ml TiO₂ en ZrO₂ NP-behandeling, waarbij TiO₂ toonde een sterkere afname van het celoppervlak. Consequent bevestigden kwantitatieve resultaten een significante afname van het celoppervlak na 100 μg/ml TiO₂ en ZrO₂ NP-behandeling (Fig. 5).

TiO₂ en ZrO₂ Door NP geïnduceerde veranderingen in het celgebied in 3T3-E1-cellen. Nadat de 3T3-E1-cellen waren behandeld met de TiO₂ (een ) en ZrO₂ (b ) NP's bij concentraties van 10 en 100 μg / ml gedurende 24 uur, de cellen werden geladen met tubuline (groen), actine (rood) en Hoechst 33342 (blauw). De celmorfologie werd waargenomen op basis van de veranderingen van de actine (rood) en tubuline-systemen (groen), en de veranderingen in de verdeling van het celgebied werden berekend

TiO₂ en ZrO₂ NP-geïnduceerde cytoskeletveranderingen in 3T3-cellen. Nadat de 3T3-E1-cellen waren behandeld met de TiO₂ (een ) en ZrO₂ (b ) NP's bij concentraties van 10 en 100 μg/ml gedurende 24 uur, de veranderingen in het cytoskelet werden beoordeeld op basis van de veranderingen van de actine (rood) en tubuline-systemen (groen)

We bestudeerden verder de veranderingen in het cytoskelet in zowel actinefilamenten als microtubuli-niveaus (Fig. 6). Evenzo werd er geen significant verschil aangetoond tussen de controlegroep en 10 μg/ml TiO₂ en ZrO₂ NP-behandeling en cellen in beide groepen onthulden expliciete structuren van actinefilamenten en microtubuli-systeem. Daarentegen 100 μg/ml ZrO₂ NP-behandeling induceerde een krimp van 3T3-E1-cellen, samen met een pyknosis-achtige kernen en gecondenseerde onduidelijke actinefilamenten en microtubulusstructuren. Voor TiO₂ NP's, er werden zoveel actinestippen waargenomen en de actinefilamenten op het celmembraan waren mistig en ruw. Voor ZrO₂ NP's, er werd een sterkere verstoring van het cytoskelet gedetecteerd en de structuur van actine en microtubuli was ruw en defect.

TiO₂ en ZrO₂ NP-geïnduceerde mineralisatie in 3T3-cellen

Vervolgens hebben we de mineralisatiestatus van 3T3-cellen gedetecteerd door kleuring met alizarinerood en de vorming van gemineraliseerde knobbeltjes waargenomen onder lichtmicroscopie (Fig. 7). Cellen werden gekleurd na osteogene inductie gedurende 7, 14 en 21 dagen in aanwezigheid van verschillende concentraties TiO₂ en ZrO₂ NP's. We ontdekten dat gemineraliseerde knobbeltjes zichtbaar werden na 14 en 21 dagen inductie. Er was geen significant verschil op mineralisatie na 14 en 21 dagen inductie tussen de controlegroep en TiO₂ en ZrO₂ NP-behandeling bij 10 μg/ml. Echter, afname van mineralisatie werd waarschijnlijk waargenomen na TiO₂ en ZrO₂ NP-behandeling bij 100 μg/ml, vanwege de gemineraliseerde knobbel die kleiner en waziger werd.

TiO₂ en ZrO₂ NP-geïnduceerde mineralisatie-effecten in 3T3-cellen. Nadat de 3T3-E1-cellen waren gedifferentieerd met behulp van gemineraliseerde oplossing voor 7 d, 14 d en 21 d, vergezeld van TiO₂ (een ) en ZrO₂ NP's (b ) in verschillende concentraties. De kleuring met alizarinerood werd gebruikt om de gemineraliseerde knobbel te detecteren (zwarte pijl)

TiO₂ en ZrO₂ NP-geïnduceerde expressie van osteogenese-gerelateerde genen in 3T3-cellen

Om het mechanisme van TiO₂ . te onderzoeken en ZrO₂ NP-geïnduceerde osteogenese in 3T3-cellen, we hebben de niveaus van osteogenese-gerelateerde genen in 3T3-cellen gedetecteerd na TiO₂ en ZrO₂ NP-behandeling, inclusief genen die bij voorkeur werden opgereguleerd tijdens de vroege (Runx2 , Kol1α1 , en Alp ) en laat (Opn , Ocn , en Bsp ) fasen van osteogenese (Fig. 8). We hebben vastgesteld dat 10 μg/ml TiO₂ en ZrO₂ NP's induceerden het hoogste expressieniveau van Runx2 na 3 dagen behandeling, terwijl op dag 7 Runx verlaagd tot het laagste niveau na ZrO₂ NP-behandeling bij 100 μg/ml. Kol1α1 verhoogd na 10 μg/ml TiO₂ en ZrO₂ NP-behandeling zowel op dag 3 als op dag 7, terwijl voor cellen behandeld met 100 μg/ml TiO₂ en ZrO₂ NP's, Kol1α1 eerst aanzienlijk opgereguleerd op dag 3, maar drastisch afgenomen na 7 dagen. We ontdekten ook een significante afname van Alp uitdrukking na TiO₂ en ZrO₂ NP-behandeling met 100 μg/ml gedurende 3 dagen.

TiO₂ en ZrO₂ NP-geïnduceerde osteogenese-gerelateerde genenveranderingen in 3T3-cellen. Nadat de 3T3-E1-cellen waren gedifferentieerd met behulp van een gemineraliseerde oplossing gedurende 3, 7, 14 en 21 dagen, vergezeld van TiO₂ en ZrO₂ NP's in verschillende concentraties. De osteogenese-gerelateerde genveranderingen werden gedetecteerd met behulp van RT-PCR. De resultaten vertegenwoordigen de gemiddelden ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001, vergeleken met de controle

Voor genen die zijn opgereguleerd in de late fase van osteogene inductie, zijn de expressieniveaus van Opn , Ocn , en Bsp aanzienlijk toegenomen na 10 μg/ml TiO₂ en ZrO₂ NP-behandeling gedurende 14 dagen, en Opn continu opgereguleerd naar een hoger niveau op dag 21. Deze resultaten suggereerden dat in vergelijking met Ocn en Bsp , Opn was een later stadium marker van TiO₂ en ZrO₂ NP-geïnduceerde osteogenese. Interessant is dat 100 μg/ml TiO₂ en ZrO₂ NP's konden de expressie van Opn . niet verbeteren , Ocn , of Bsp op dag 14; bovendien vertoonden deze genen een significante neerwaartse regulatie op dag 21.

Discussie

ZrO₂ NP's waren belangrijke componenten in vuurvaste materialen, keramiek en biomedische apparaten, waaronder implantaten, gezamenlijke endoprothesen en tandheelkundige materialen. Tot nu toe, TiO₂ NP's als een van de andere NP's met vergelijkbare fysisch-chemische eigenschappen, hebben veel onderzoeken zich gericht op de toxicologische gegevens ervan. Ze ontdekten dat TiO₂ NP's konden in cellen transloceren en vertoonden mogelijke celbeschadiging als gevolg van verschillende fysisch-chemische kenmerken [20, 21]. Ondertussen ontbraken de toxicologische gegevens voor ZrO2 NP's. In onze studie beschouwden we TiO₂ NP's als controlegroep en onderzochten de toxicologische effecten van TiO₂ en ZrO₂ NP's op 3T3-E1-cellen. Van fysisch-chemische eigenschappen van NP's, met name grootte en morfologie, is bekend dat ze de bioveiligheid effectief beïnvloeden. Sommige onderzoeken hebben aangetoond dat deeltjes op nanoschaal significant giftiger waren dan deeltjes op microschaal [22, 23]. In de meeste gevallen werd ook gemeld dat de deeltjesmorfologie de toxiciteit beïnvloedt [24,25,26]. In onze studie hebben we aangetoond dat TiO₂ en ZrO₂ NP's waren staafvormige bollen. Vergeleken met eerdere rapporten [5, 27, 28], is onze TiO₂ en ZrO₂ NP's hadden een relatief zwakker agglomeratie-effect in water waar de deeltjes vergrootten tot 81,2 en 93,1 nm in grootte, terwijl we ook enkele microschaalmaterialen in kweekmedium konden waarnemen na NP-blootstelling op een concentratieafhankelijke manier, wat het agglomeratie-effect in deze studie zelfs bevestigt na gebruik van ultrasone dispersietechnologie. Het agglomeratie-effect kon de NP-translocatie naar het cytoplasma echter niet remmen, omdat krachtige NP's werden gedetecteerd in intracellulaire blaasjes. Organellen, zoals mitochondriën, waren waarschijnlijk een van de belangrijkste doelwitten.

We hebben de levensvatbaarheid van 3T3-E1-cellen gedetecteerd bij verschillende concentraties TiO₂ en ZrO₂ NP behandeling. Onze resultaten toonden aan dat 10 μg/ml TiO₂ en ZrO₂ NP's is een bioveiligheidsconcentratie voor 3T3-E1-cellen. De levensvatbaarheid van de cellen nam af op tijd- en concentratieafhankelijke wijze, wat impliceerde dat TiO₂ en ZrO₂ NPs were potentially cytotoxic after longer exposure of higher doses compared with other oxide metal nanoparticles, such as silicon dioxide and ZnO [4, 28, 29]. Moreover, ZrO₂ NPs showed more potent toxic effects than TiO₂ NPs in our study at high toxic concentrations.

Oxidative stress, a byproduct of outpaced ROS generation and decreased antioxidant factors, is known as one crucial factor in nanomaterial-induced cytotoxicity, and it is reported to trigger cell apoptosis through distinct mechanism [30, 31]. Furthermore, Kozelskaya et al. [12] observed that ZrO₂ NPs induced the increase of membrane microviscosity, cell morphology changes, and surface cracks on the red blood cells due to the oxidative stress. In agreement with these studies, we detected the ROS levels in 3T3-E1 cells after TiO₂ and ZrO₂ NP treatment and found that TiO₂ and ZrO₂ NPs could induce significant ROS generation in concentration-dependent manners, and ZrO₂ NPs induced more potent oxidative stress effects. Moreover, the elevated ROS levels could be eliminated by NAC which is a ROS scavenger. These results suggested the important role of ROS in TiO₂ and ZrO₂ NP-induced cell cytotoxicity.

Apoptosis is a type of cell death which clears the senescent and abnormal cells, so as to sustain the cell biological functions [32]. Some studies have reported that apoptosis was one of the main toxic responses after treating with oxide metal nanomaterials, such as TiO₂ , ZnO, Si, and Ag [33,34,35,36]. In our study, we found that TiO₂ and ZrO₂ NPs could induce apoptotic/necrotic body formation in 3T3-E1 cells in time/concentration-dependent manners, which was correlated with the decreased cell viability shown previously. Moreover, we found that when large parts of late apoptotic or necrotic cells were observed after ZrO₂ NP treatment, the cell status for TiO₂ NPs largely was early apoptosis. These phenomena applied that ZrO₂ NPs induced more rapid and potent apoptosis effects. Similarly, other studies also showed that ZrO₂ NPs induced significant apoptotic and necrotic processes in MSTO cells [4, 11].

The cytoskeleton metabolism is a dynamic biological process involving polymerization and depolymerization, which could sustain cell morphology and promote cell function. Some studies have shown that nanomaterials could affect the cell morphology and cytoskeleton system [37,38,39]. We found 3T3-E1 cells became smaller and rounded in the high-dose group of TiO₂ and ZrO₂ NPs (100 μg/mL), along with decreased cell area due to cytoskeleton disruptions. These findings were also supported by previous reports that ZrO₂ NP treatment could induce cell morphology changes in MSTO cells at higher concentration [4]. Another study showed the disrupted blood cell morphology after ZrO₂ NP treatment [12].

Alizarin red staining is a key indicator of osteogenic responses. In our study, no impact on osteogenic induction has been shown by TiO₂ and ZrO₂ NP treatment (10 μg/mL), except that cells treated with a cytotoxic dose of TiO₂ and ZrO₂ NPs (100 μg/mL) had a significant decrease of mineralized nodules due to the potential inhibition of osteoinductive properties. In addition, the expression level of osteogenesis-related genes was important biomarkers. Our results showed that lower concentration (10 μg/mL) of TiO₂ and ZrO₂ NPs promoted the expression of osteogenesis-related genes; however, TiO₂ and ZrO₂ NPs at high concentrations (100 μg/mL) could significantly inhibit gene expression for both early- and late phases of mineralization, indicating that TiO₂ and ZrO₂ NPs at high concentrations indeed inhibited osteoinductive properties. Other studies also obtained similar results; they claimed that TiO₂ NPs inhibited the osteogenesis of osteoblasts in a size-dependent manner while potentially promoted osteoclastogenic process [33]. Sengstock et al. [40] found that sub-toxic concentrations of Ag NPs and Ag ions could significantly impair the osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. More ongoing or newly initiated researches are focused on developing nanoparticles with acceptable biosafety and osteogenic potential to promote osseointegration for in vivo application [18, 41].

Conclusion

In conclusion, our data indicated that ZrO₂ NPs were nanoparticles with good biocompatibility, just like TiO₂ NPs, while they could induce toxic effects at high toxic concentrations on 3T3-E1 cells. ROS played a key role on TiO₂ and ZrO₂ NP-induced cytotoxicity, including cell viability, apoptosis and necrosis, and changes in cell morphology. Moreover, TiO₂ and ZrO2 NPs at high concentrations showed inhibitory effects on osteogenic differentiation of 3T3-E1 cells. Our findings could provide deep insights into the biocompatibility and potential application of ZrO2 NPs.