Zure micro-omgevingen in liposomen verbeteren curcumine-stabiliteit en antikanker-effectiviteit significant

Samenvatting

Liposomen bieden een veelzijdig platform voor het leveren van bioactieve verbindingen, doch de intrinsieke onstabiele van pH-gevoelige geneesmiddelen in fysiologische omstandigheden blijft een uitdaging. We hebben een liposomale formulering ontworpen die een zuur micro-omgeving creëert binnen zijn waterige kern, daarbij de geencapsuleerde lading beschermend. Curcumine-geladen liposomen (Cur-LPs) met interne pH-waarden van 2,5, 5,0 en 7,4 werden gefabriceerd, allemaal met vergelijkbare deeltjesgroottes (~300 nm), smalle polydispersiteit (<0,2) en vergelijkbare in-vitro vrijgaveprofielen. Opvallend was dat de chemische integriteit van curcumine in 50 % fetaal kalfserum (FBS) en de cytotoxiciteit tegen HepG2-cellen sterk afhingen van de interne pH: Cur-LP-2,5 > Cur-LP-5,0 > Cur-LP-7,4. Deze bevindingen tonen aan dat een zuur kern binnen liposomen een praktische en efficiënte strategie is om pH-gevoelige therapeutica te stabiliseren.

Achtergrond

Kunstmatige lipide vesikels, of liposomen, namaken cellulaire membranen met een fosfolipide dubbellaag die een waterig interieur omringt, wat hoge geneesmiddellading, biologische afbreekbaarheid en biocompatibiliteit biedt [1‑5]. Hun amfifiele architectuur maakt oplossing van hydrofobe geneesmiddelen mogelijk terwijl ze beschermd worden tegen de harde extracellulaire omgeving [6‑9]. Oppervlaktemodificatie verlengt de systemische circulatie of stuurt lading naar specifieke weefsels [10‑14], en diverse liposomale formuleringen hebben klinische goedkeuring bereikt [15‑18].

Ondanks deze voordelen, blijft het leveren van geneesmiddelen die onstabiel zijn bij neutrale pH problematisch. Conventionele liposomen worden typisch bereid in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) bij pH 7,4, waardoor pH-gevoelige ladingen blootgesteld worden aan een ongunstige omgeving. Curcumine, een lipofiele polyfenol met krachtige anti-inflammatoire en antikankereigenschappen, illustreert dit probleem: de slechte wateroplosbaarheid en pH-gemediëerde degradatie beperken klinische vertaling [19‑23]. Daarom kan het creëren van een zuur micro-omgeving binnen de liposomale kern de integriteit van dergelijke geneesmiddelen bewaren.

In deze studie benutten we de binnenste waterige compartiment van liposomen om een instelbare zuurgraadient te genereren en beoordeelden de impact op curcumine-encapsulatie, stabiliteit en antikankeractiviteit.

Methoden

Materialen

Fosfatidylcholine uit sojalechitine (injectiegraad) werd bezorgd van Shanghai Tai‑Wei Pharmaceutical Co., Ltd.; cholesterol aangeschaft van Amresco; poloxamer 188 (F68) gedoneerd door BASF (China); curcumine (≥ 98 %) geleverd door Sigma; fetaal kalfserum (FBS) van HyClone. Alle reagentia waren van analytische graad.

Bereiding van Curcumine-geladen Liposomen

Cur-LPs werden geproduceerd via de dunne-film verdampingsmethode [27,28] met modificaties. Fosfolipiden (75 mg) en cholesterol (5 mg) werden opgelost in 0,5 mL ethanol bevattende 2 mg/mL curcumine. De oplossing werd gemengd met 5 mL 0,001 M PBS (pH 2,5, 5,0 of 7,4) bevattende 1 % (w/v) F68 om de groottedistributie te vernauwen. Na 1 min magneetroeren bij 35 °C werd het mengsel onder vacuüm en in duisternis 30 min geëvaporeerd om ethanol te verwijderen. Vervolgens lage-snelheid centrifugatie (3.000 toeren/min, 5 min) verwijderde vrije curcumine; het pellet werd daarna hoge-snelheid gecentrifugeerd (16.000 toeren/min, 10 min) en heropgelost in PBS (pH 7,4). De resulterende formuleringen werden aangeduid als Cur-LP-2,5, Cur-LP-5,0 en Cur-LP-7,4; lege liposomen werden identiek bereid.

Karakterisering

Dynamische lichtverstrooiing (DLS) meet hydrodynamische grootte en polydispersiteitsindex (PDI); zetapotentiaal werd beoordeeld door elektroforetische lichtverstrooiing (ELS) met een Malvern Zetasizer Nano ZS90 bij 25 °C. Encapsulatie-efficiëntie (EE) werd berekend via fluorescentie na scheiding van geencapsuleerde van vrije curcumine door hoge-snelheid centrifugatie [29].

Scanning Elektronenmicroscopie

SEM-afbeeldingen (FEI INSPECT F) werden verkregen na 100-voudige verdunning in gedestilleerd water, druppelen op glas, aan de lucht drogen en goudcoating.

Fysieke Stabiliteit

Colloidale stabiliteit werd geëvalueerd door grootteveranderingen en transmissie (550 nm) over 72 uur bij 37 °C te monitoren. Aggregatie (thermodynamisch) en sedimentatie (kinetisch) werden respectievelijk gekwantificeerd.

In Vitro Vrijgave

Curcumine-vrijgave uit Cur-LPs werd gemeten met een 10 kDa dialysezak in PBS (pH 7,4, 0,1 % Tween 80) bij 37 °C met 100 toeren/min roeren. Monsters werden op vooraf bepaalde intervallen verzameld, vervangen met vers medium, en geanalyseerd door fluorescentie (Ex 458 nm, Em 548 nm).

Chemische Stabiliteit in Serum

Cur-LPs (10-voudig gedilueerd) werden gemengd met 1 mL 50 % FBS en geïncueerd bij 37 °C, 100 toeren/min. Op ingestelde tijden werden aliquots geëxtraheerd, gemengd met ethanol, gecentrifugeerd, en de overgebleven curcumine gekwantificeerd door fluorescentie.

In Vitro Antikanker Effectiviteit

HepG2-cellen werden gezaaid bij 10.000 cellen/put in 96-putplaten, 24 uur gekweekt in PRIM‑1640 + 10 % FBS, gewassen met PBS, en vervolgens behandeld met 4 µg/mL curcumine (vrij of geencapsuleerd) in serumvrij medium. Cellevensvatbaarheid werd beoordeeld na 1 en 3 dagen met de CCK‑8-test. Levensvatbaarheid werd uitgedrukt als % ten opzichte van onbehandelde controle.

Statistiek

Data worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 3). Tweezaagse Student's t‑test bepaalde significantie; p < 0,05 werd als significant beschouwd.

Resultaten en Discussie

Karakterisering van Liposomen

Alle Cur-LPs vertoonden vergelijkbare deeltjesgroottes (~300 nm) en PDI < 0,2 (Figuur 1a). Zetapotentialen waren negatiever voor Cur-LP-5,0 en Cur-LP-2,5 (~ −18 mV) vergeleken met Cur-LP-7,4 (−9 mV), wat de invloed van interne zuurheid op oppervlaktelading weerspiegelt (Figuur 1b). De hogere EE waargenomen voor Cur-LP-2,5 (74 %) versus Cur-LP-5,0 (45 %) en Cur-LP-7,4 (64 %) suggereert dat verzurde interieurs curcumine-lading verbeteren, mogelijk door gewijzigde oplosbaarheidsdynamica bij lage pH [33].

SEM-imaging bevestigde spherische morfologie over alle formuleringen (Figuur 2). Kleine aggregatie werd genoteerd voor Cur-LP-7,4, consistent met de lagere zetapotentiaal, en de waargenomen SEM-diameters waren kleiner dan DLS-waarden door dehydratatie-effecten.

Fysieke Stabiliteit

Over 72 uur bij 37 °C toonden geen van de formuleringen significante grootte-toename of transmissieverandering (< 10 %), wat robuuste thermodynamische en kinetische stabiliteit aangeeft ongeacht interne pH (Figuur 3).

In Vitro Vrijgave

Curcumine werd snel vrijgemaakt uit vrije oplossing (> 80 % binnen 6 uur), wat bevestigt dat de dialysemembraan diffusie niet belemmerde. Cur-LPs vertoonden continue, bijna nulde-orde vrijgave, met ~30 % cumulatieve vrijgave over 72 uur (Figuur 4). Lineaire regressie (R² > 0,99) benadrukte de consistente vrijgavekinetiek, een voordelig kenmerk voor het handhaven van therapeutische niveaus.

Effect van Interne pH op Chemische Stabiliteit

Serum-incubatie onthulde een duidelijke pH-afhankelijkheid: na 6 uur behield Cur-LP-2,5 55 % van curcumine, vergeleken met 43 % (Cur-LP-5,0) en 34 % (Cur-LP-7,4) (Figuur 5). Deze trend spiegelt de bekende pH-gevoeligheid van vrije curcumine [26]. De zuur kern onderdrukt waarschijnlijk enzymatische activiteit en beschermt curcumine binnen de lipide dubbellaag, die, tegen de verwachting in, door een klein waterig volume doordrongen kan worden dat de geneesmiddelstabiliteit beïnvloedt.

In Vitro Antikanker Effectiviteit

Lege liposomen bevorderden matig HepG2-proliferatie na 1 dag, wat een nutritioneel effect suggereert [27]. Vrije curcumine vertoonde beperkte cytotoxiciteit door slechte oplosbaarheid. In tegenstelling remden Cur-LPs celdeling significant in een pH-afhankelijke manier: na 1 dag was levensvatbaarheid 80 % (Cur-LP-2,5 & Cur-LP-5,0) versus 90 % (Cur-LP-7,4); na 3 dagen daalde levensvatbaarheid tot 24 % (Cur-LP-2,5), 21 % (Cur-LP-5,0) en 39 % (Cur-LP-7,4) (Figuur 6). De superieure prestaties van Cur-LP-2,5 stemmen overeen met de hogere EE en stabiliteit.

Conclusies

Moduleren van de interne zuurheid van liposomen biedt een eenvoudige maar krachtige strategie om de chemische stabiliteit en therapeutische effectiviteit van pH-gevoelige geneesmiddelen te verbeteren, zelfs voor hydrofobe moleculen die in de lipide dubbellaag resideren. De zuur micro-omgeving gecreëerd in Cur-LP-2,5 bewaarde niet alleen curcumine tegen serum-degradatie maar versterkte ook de antikankeractiviteit in HepG2-cellen. Deze benadering kan gemakkelijk uitgebreid worden naar andere labil therapeutica, potentiëel hun klinische prestaties verbeterend.