Een nieuwe magneto-elastische immunosensor voor ultragevoelige detectie van carcino-embryonaal antigeen

Abstract

Er is een nieuwe draadloze immunosensor ontwikkeld voor de ultragevoelige detectie van carcino-embryonaal antigeen. De optimale afmeting van de microchips, als magneto-elastische gevoelige eenheden, werd geëvalueerd door simulatie en experimenten. De unieke effecten signaalversterking en biocompatibiliteit van gouddeeltjes dragen bij aan de stabiliteit en gevoeligheid van de sensor. Om de gevoeligheid te verhogen, worden de werkconcentraties van antilichaam en BSA bovendien gekozen op respectievelijk 50 mg/ml en 0,1%. Atom Force Microscoop-beeldvorming werpt licht op de biologische analyse. De nano-magneto-elastische immunosensor vertoont een lineaire respons op de logaritme van carcino-embryonaal antigeen (CEA) -concentraties variërend van 0,1 tot 100 ng/ml, met een detectielimiet van 2,5 pg/ml. De ontworpen biosensor heeft uitstekende stabiliteit en gevoeligheid voor CEA.

Achtergrond

Kanker is een van de dodelijke ziekten in de wereld [1]. De kanker bij patiënten kan klinisch worden opgespoord wanneer de concentratie van tumorbiomarkers een bepaalde hoeveelheid in het serum bereikt [2]. Daarom is het zeer noodzakelijk om gevoelige, snelle en nauwkeurige tests uit te voeren voor tumormarkers, die een effectieve strategie bieden voor de diagnose van kanker [3]. Carcino-embryonaal antigeen (CEA) behoort tot een familie van glycoproteïnen op het celoppervlak met een molecuulgewicht van 180-200 kDa. Het werd voor het eerst ontdekt in menselijk darmkankerweefsel in 1965 [4, 5]. CEA presenteert zich meestal in zeer lage niveaus (0~5 ng/mL) in het bloed van gezonde volwassenen [6]. Over het algemeen kan een abnormaal niveau van CEA worden beschouwd als een teken van kanker, zoals maagcarcinoom [7], pancreascarcinoom [8], colorectaal carcinoom [9], longcarcinoom [10] en borstcarcinoom [11]. Het betekent dat CEA als tumorbiomarker kan worden gebruikt. Het monitoren van het CEA-niveau in het bloed kan worden gebruikt om kanker vooraf te waarschuwen, te screenen en te diagnosticeren. Ondertussen kan het CEA ook gebruikt worden voor vervolgonderzoek van degenen die klinisch behandeld zijn. De gevoeligheid van CEA voor tumorrecidief is meer dan 80%, wat eerder is dan bij klinisch en pathologisch onderzoek. De continue observatie van het CEA vormt dus een belangrijke basis voor de diagnose en prognose van de genezende effecten [12].

Biosensoren reageren door een bepaalde discipline op specifieke herkenningen van meetbare signalen van biologische moleculaire output, waardoor snelle reacties, hoge gevoeligheid en lage kosten mogelijk zijn. Onlangs zijn immunologische biosensoren intensief bestudeerd, zoals enzymimmunoassay [13], fluoro-immunoassay [14] en elektrochemische immunoassay [15,16,17]. Vanwege de uitstekende specificiteit en gevoeligheid boden immunosensoren veelbelovende middelen voor de analyse van tumorbiomarkers, zelfs wanneer de doelverbindingen in zeer lage concentraties zijn [18,19,20,21].

De nanotechnologie biedt nieuwe methoden voor de toepassing van nanodeeltjes (NP's) in biosensing-technologie. Metalen NP's vertonen veel speciale kenmerken, die opmerkelijke platforms bieden voor het koppelen van bio-herkenningselementen [22, 23]. Immunoassays op basis van NP's hebben veel aandacht getrokken voor de onderzoekers [24,25,26]. De magneto-elastische biosensoren worden niet beïnvloed door de omgevingstemperatuur en pH met een hoge responsgevoeligheid. Daarom hebben we in deze studie een magneto-elastische immunoassay-methode voorgesteld op basis van gouden nanodeeltjes (AuNP's) en magneto-elastische microchips. Er is met succes een immunosensor ontwikkeld voor het detecteren van CEA-biomarkers.

Resultaten en discussie

Gezien de lintachtige vorm van de magneto-elastische (ME) microchip is de magnetische permeabiliteit het grootst over de lengte [27]. De voorlopige resultaten hebben aangetoond dat de optimale breedte en dikte van de ME-chip respectievelijk 1 mm en 28 m waren [28]. Simulatie werd gebruikt om de lengte van de chip te optimaliseren, zoals aangetoond in Fig. 1b.

Optimale lengte van de ME-chip. een De relatieve verplaatsing is anders met de variatie in lengte. b Simulatie werd gebruikt om de lengte van de chip te optimaliseren

De relatieve verplaatsing is anders met de lengtevariatie in figuur 1a. De maximale relatieve verplaatsing wordt verkregen wanneer de lengte 6 mm is onder de eerste-orde modale analyse. Het betekent de theoretisch hoogste gevoeligheid. Daarom zijn in dit artikel de optimale afmetingen van de chip ontworpen als 6 mm × 1 mm × 28 m.

Een schematisch diagram van de Nano-ME-biosensor wordt geïllustreerd in Fig. 2. Ten eerste werd de Nano-ME-chip chemisch behandeld met cysteïne om de zelf-assemblerende moleculaire (SAM) films op het oppervlak te fabriceren, als een functionele laag voor immobilisatie van CEAAb. Vervolgens bevordert runderserumalbumine (BSA) de prestaties van CEAAb door niet-specifieke binding en sterische hindering te verminderen. Atom Force Microscoop (AFM) beelden werden uitgevoerd voor het observeren van de oppervlaktemorfologie van de chip. Zoals aangegeven in Fig. 3a, was de dikte van de SAM-laag 120 nm. De beeldvorming in Fig. 3b onthult dat de CEAAb covalent was gehecht aan de SAM-laag met toenemende ruwheid. In figuur 3c werd duidelijk weergegeven dat de CEA specifiek werd herkend en effectief werd gecombineerd, met een hoogte van ongeveer 200 nm en groter.

Schema van de geconstrueerde Nano-ME-biosensor

AFM-afbeeldingen van SAM-laag (a ). CEAAb-SAM-laag (b ). Complex van CEA-CEAAb(c )

In een bepaalde dimensie van de chip is de concentratie van antistoffen een belangrijke factor die verband houdt met de gevoeligheid van de immunosensor. Daarom was het noodzakelijk voor het evalueren van de responssignalen van verschillende concentraties CEAAb (20, 50, 70 en 100 g / ml, zoals weergegeven in Fig. 4a). De resultaten laten zien dat de optimale respons werd verkregen bij ongeveer 448 Hz (Fig. 4b), wanneer de concentratie van CEAAb 50 g/ml is. Als de concentratie CEAAb toenam tot 70 g/ml, begon de respons af te nemen als gevolg van de sterische hindering en de elektrostatische afstoting [29].

een De curve van frequentierespons versus CEAAb. b Frequentiehistogram

In principe wordt de CEA specifiek herkend met antilichaam, wat leidt tot een afname van de responsfrequentie. Figuur 5a toont de real-time responscurve van de immunosensor richting CEA. Ondertussen verkrijgen we een lineaire fittingcurve in Fig. 5b.

Realtime reactie (a ) en pascurves (b ) van de biosensor versus CEA

Over het algemeen werd de stabiele respons van de sensor bereikt na 40 minuten (figuur 5a). De verandering van de resonantiefrequentie werd geregistreerd met overeenkomstige concentraties CEA. De verandering van Hz is lineair afhankelijk van de logaritme van CEA-concentraties variërend van 0,1 tot 100 ng/ml (R ² = 0,9688), met een detectielimiet van 2,5 pg/ml (Fig. 5b). Voor zover wij weten, zijn het lineaire bereik en de detectielimiet duidelijk lager dan die van de vorige methoden [28]. De resultaten toonden aan dat een draadloze en zeer gevoelige methode voor CEA met succes werd opgezet.

Conclusies

In deze bijdrage werd met succes een Nano-ME-immunosensor voor zeer gevoelige detectie van CEA ontwikkeld op basis van ME-chip. AuNP's en BSA verbeterden effectief de gevoeligheid en stabiliteit. De voorgestelde Nano-ME-immunosensor vertoont brede bepalingsbereiken van CEA van 0,1 tot 100 ng/ml met een lage detectielimiet van 2,5 pg/ml. Daarom werd de nauwkeurige bepaling van CEA door de als voorbereide immunosensor bereikt met bevredigende resultaten. Het voorgestelde platform profiteert van zijn specificiteit, eenvoud en reproduceerbaarheid en toont een veelbelovende toepassing in de ontwikkeling van niet-invasieve kankerdetectie.

Methoden

Onder het in de tijd variërende magnetische veld trilt de ME-microchip over de lengte. In het gemoduleerde magnetische veld om de ME-microchip te laten trillen, wordt de energie van het magnetische veld omgezet in elastische potentiële energie om de maximale waarde te bereiken. Door de vorm van de lintachtige sensorchip is de magnetische permeabiliteit over de lengte het grootst; vandaar dat een invallend magnetisch veld longitudinale trillingen in de sensor genereert vanuit bijna elke oriëntatie behalve normaal op het basale vlak van de sensor. Gegeven door vgl. (1):

$$ {f}_0=\frac{1}{2L}\sqrt{\frac{E}{\rho \left(1-{\nu}^2\right)}} $$ (1)

waar E geeft de elasticiteitsmodulus aan, v is de verhouding van Poisson, ρ is de dichtheid van het sensormateriaal, en L is de lengtemaat van de chip. Wanneer de testtemperatuur, vochtigheid en andere omgevingsparameters constant zijn, hangt de resonantiefrequentieverandering van de magneto-elastische sensor gevoelig alleen af van de massaverandering (△m ) op het oppervlak, zoals gegeven door Vgl. (2)

$$ \frac{\triangle f}{\triangle m}=-\frac{f_0}{2M} $$ (2)

Gebaseerd op vgl. (2), de verandering van de resonantiefrequentie is evenredig met de hoeveelheid CEA. Daarom kunnen de CEA-concentraties worden bereikt door de verandering van frequentie, waarbij f ₀ is de initiële resonantiefrequentie, M is de initiële massa, △m is de massaverandering, en △f is de verschuiving in de resonantiefrequentie van de sensor. Vergelijking 2 laat zien dat sensorgevoeligheid (△f /△m ) is omgekeerd evenredig met de initiële magneto-elastische massa (M) van de sensor. Sensoren met kleinere fysieke afmetingen hebben een lagere initiële massa, wat resulteert in een hogere gevoeligheid. Het minteken in de vergelijking staat voor een afname in frequentie (△f ) aan een toevoeging van niet-magneto-elastische massa (△m ) op de sensor. Daarom veroorzaakt binding van de doelorganismen aan het oppervlak van de biosensor een massatoename met een overeenkomstige afname van de fundamentele resonantiefrequentie.

Magneto-elastische basen van Metglas-legering 2826MB (Fe40Ni38Mo4B18) werden verwerkt door Honey well Corporation (Morristown, NJ, VS). CEA, CEA-antilichaam, runderserumalbumine (BSA, 99%) en met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH =-7.4) werden gekocht bij Sangon (Shanghai, China). Aceton, isopropanol, ethanol, 1-ethyl-3-carbodiimide (EDC) en N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) werden gekocht bij Sigma-Aldrich Corporation (Saint Louis, MO, VS). Alle andere reagentia waren van analytische kwaliteit. Het ultrazuivere water werd verkregen van het Mill-Q-systeem (Milli-pore, VS). AFM Park System (ND-100, Korea), Plasma (P3C, Shanghai, China), Gauss-ohmmeter (GM500), ZNB Vector Network Analyzer (R&S, Duitsland), lasersnijder (AV3620A, Qingdao, China) en HT20-gaussmeter (Hengtong, Shanghai) werden gebruikt.

De legering ME-basis werd met een laser gesneden tot microchips van 6 mm × 1 mm × 28 m, vervolgens ultrasoon gereinigd met aceton, isopropanol, ethanol en gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten en gedroogd met stikstof. De activering van de oppervlaktemodificatie van de gereinigde microchips wordt verwerkt door een plasmamethode. Beide zijden van de microchip werden gesputterd met een chroomlaag (100 nm), gevolgd door een coating met een AuNP-laag (40 nm) om Nano-ME-chips te fabriceren. De Nano-ME-chip behandelt plasma met zeer zuivere zuurstof (0,9999) en vervolgens ondergedompeld in 40 mM cysteamine-oplossing en gedurende 12 uur bij kamertemperatuur bewaard. Daarna werden de Nano-ME-chips biologisch gemodificeerd en geïncubeerd met verschillende concentraties CEAAb gedurende 1 uur bij 37 °C in aanwezigheid van 1-ethyl-3-carbodiimide (EDC) en N -hydroxysulfosuccinimide (NHS). De CEAAb werd eerst geactiveerd met 10 mg/ml EDC en 10 mg/mL NHS. Ten slotte werd de Nano-ME-chip, gemodificeerd door CEAAb, gedurende 30 minuten verder uitgevoerd met 0,1% BSA.

De Nano-ME-biosensor werd als volgt geconstrueerd:een glazen buis werd om de spoel gewikkeld en verbonden met een vectornetwerkanalysator. Ondertussen zorgde het toevoegen van een magnetisch veld voor wisselstroom om de spoel een wisselend magnetisch veld te laten produceren. De resonantiefrequentie van de Nano-ME-biosensor kan worden verkregen door een vectornetwerkanalysator. Verschillende concentraties CEA (0-100 ng/ml) werden aan de reageerbuis toegevoegd en de frequentieverschuiving werd elke 5 minuten tot 40 minuten geregistreerd. Daarna werd de Nano-ME-chip gespoeld met PBS voor AFM-karakterisering.

Afkortingen

AFM:: Atoomkrachtmicroscoop
AuNP's:: Gouden nanodeeltjes
BSA:: Bovine serum albumine
CEA:: Carcino-embryonaal antigeen
CEAAb:: CEA antilichaam
EDC:: 1-Ethyl-3-carbodiimide
Hz:: Frequentie
ME:: Magneto-elastisch
NHS:: N -Hydroxysulfosuccinimide
PBS:: Fosfaatgebufferde zoutoplossing
SAM :: Zelfassemblerend moleculair

Voorbereiding en karakterisering van in oplossing verwerkte nanokristallijne p-type CuAlO2 dunne-filmtransistoren Gemakkelijke synthese en verbeterde fotokatalytische activiteit van zichtbaar licht van nieuwe p-Ag3PO4/n-BiFeO3-heterojunctie-composieten voor degradatie van kleurstoffen

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal