Effect van Nano-SiO2 op expressie en afwijkende methylering van ingeprente genen in long en testis

Achtergrond

Siliciumdioxide is een oxide van silicium met de chemische formule SiO₂ , het meest aangetroffen in de natuur als kwarts en in verschillende organische omgevingen [1]. Engineered nanodeeltjes zijn wijdverbreid in de snelle groei en toepassing van nanotechnologie in high-tech industrieën. Dit specifieke nanodeeltje wordt veel gebruikt in een reeks consumentenproducten, waaronder elektronica, plastic producten, medische, cosmetische en coatingmaterialen vanwege hun fysisch-wetenschappelijke eigenschappen, zoals een groot specifiek oppervlak, overvloedige reactieve plaatsen, hoge oppervlakte-energie, onverzadigde chemische bindingen, sterk adsorptievermogen en een sterke neiging tot interactie met metalen en organisch materiaal, waardoor verontreinigingen en hun transport in het milieu veranderen [2]. De aanwezigheid van SiO₂ nanodeeltjes (NP's) in een groot aantal verbruiksgoederen vergroten de kans dat ze in het milieu terechtkomen en in contact komen met de menselijke bevolking.

Eerdere experimentele onderzoeken hebben aangetoond dat een intratracheale instillatie met een enkele dosis of meerdere intraperitoneale injecties van een metaal- en metaaloxide-nanodeeltjessoort toxische effecten veroorzaken van cellulair tot systemisch en organismisch niveau [3]. Behandeling van SiO₂ NP's onderdrukt de groei van borstkankercellijnen door apoptose te verhogen en celmotiliteit te verminderen. Bovendien kan blootstelling aan SiO₂ NP's verstoren de epidermale groeifactorreceptor (EGFR) aanzienlijk [4]. Toen rattenmodellen werden behandeld met drie verschillende maten TiO₂ NP's en vergeleken met controles, veroorzaakte behandeling met bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) met grote agglomeraat (> 100 nm) aërosolen een acute ontstekingsreactie, terwijl kleine agglomeraat (< 100 nm) aerosolen significante schade door oxidatieve stress en cytotoxiciteit veroorzaakten [5].

De studie van de toxiciteit van nanodeeltjes op de voortplanting is een groeiend veld. Eén onderzoek heeft aangetoond dat Ni NP's bij dezelfde behandelingsdosis een hogere reproductietoxiciteit bij C induceerden. elegans dan Ni MP's (microdeeltjes). Deze reproductietoxiciteiten waargenomen in C. elegans inclusief verminderde broedgrootte, bevruchte eicel en spermatide-activering [6]. Er zijn steeds meer aanwijzingen dat bepaalde milieu-effecten kunnen worden doorgegeven aan het nageslacht via vaderlijke paden zonder veranderingen in het sperma-genoom [7, 8]. Vaderlijke informatie bestaat niet alleen in het genoom, maar ook in gerelateerde specifieke epigenetische markers, mRNA-inhoud en niet-coderend RNA.

Oxidatieve stress is een belangrijk mechanisme bij de toxiciteit van nanodeeltjes, die DNA-schade, ontsteking, eiwitdenaturatie en lipideperoxidatie kan veroorzaken [9]. Deze biologische effecten worden beïnvloed door de fysiochemische eigenschappen van nanodeeltjes, waaronder hun grootte, oppervlakte, vorm, oppervlaktechemie, functionalisering en oplosbaarheid [10, 11]. Er is groeiend bewijs dat duidelijk aantoont dat blootstelling aan nanodeeltjes epigenetische veranderingen in weefsels en cellen kan veroorzaken, zelfs bij lage, niet-cytotoxische doses [12, 13]. Epigenetica is de studie van erfelijke veranderingen in genfunctie die geen veranderingen in de DNA-sequentie met zich meebrengen, waaronder methylering van DNA, genimprinting, histonmodificaties en regulatie door niet-coderende RNA's [14]. Dergelijke epigenetische veranderingen worden geassocieerd met de ontwikkeling en progressie van talrijke pathologische toestanden en ziekten [15]. Daarom zijn epigenetische effecten een cruciaal onderdeel van screening op het risico van patiënten op cellulair niveau.

Het met Dlk1/Dio3 bedrukt domein bevat drie bekende differentieel gemethyleerde regio's (DMR's) die vaderlijk gemethyleerd zijn:intergene DMR (IG-DMR), maternale tot expressie gebrachte 3-DMR (Gtl2-DMR) en Dlk1-DMR [16]. Eerdere studies suggereren dat de IG-DMR de allelische methyleringsstatus van de Gtl2 dicteert promotor DMR, die vervolgens de genexpressie over het hele cluster regelt [17]. Het muizengenoom heeft een groot aantal ingeprinte genen op het Dlk1/Dio3-domein in het distale gebied van chromosoom 12. De IG-DMR bevindt zich tussen het ingeprinte gen Dlk1 en Gtl2 is specifiek gemethyleerd in de mannelijke kiembaan en reguleert de ouderlijke allel-specifieke expressie van het ingeprinte gengebied [18]. De IG-DMR-methylatiestatus wordt vóór de geboorte vastgesteld en wordt dus gedurende het hele leven van een man in de mannelijke kiembaan gehandhaafd tijdens mannelijke kiemceldifferentiatie, wat betekent dat IG-DMR-methylatie wordt gehandhaafd in spermatogonia en spermatocyten van rijpe testis.

Ons doel was om de veranderingen in mannelijke kiemlijngenexpressie te vinden tijdens spermatogenese voorafgaand aan transcriptionele en translationele silencing om de vaderlijke invloed op nakomelingen te verklaren door de veranderingen in de omgeving. Omgevingsfactoren kunnen transcriptionele modificaties van sperma wijzigen, wat kan leiden tot veranderingen in de ontwikkeling van het nageslacht. Om dit onderzoek in ons werk uit te voeren, gebruikten we cellijnen en muizen als modellen voor het screenen van de toxische effecten van SiO₂ NP's. Voor zover wij weten, is dit de eerste studie die de epigenetische mechanismen van de met Dlk1/Dio3 ingeprinte regio's aantoont dat nanodeeltjes schade veroorzaken in zowel long- als testisweefsel.

Methoden

Experimenteel dier

De behandeling van dieren werd uitgevoerd in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren onder het overeenkomstige protocol voor diergebruik aan de Nanjing Medical University. Muizen werden verkregen van Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Alle dieren werden gehuisvest bij 23 ° C met een lichtcyclus van 12 uur. Gesteriliseerd water en knaagdiervoer werden naar believen door de muizen geconsumeerd. De activiteit en het gedrag van muizen werden dagelijks gecontroleerd. Na 2 weken kregen muizen SiO₂ . van nanoformaat geïnjecteerd 12,5 mg/kg.

Chemische stoffen

Nano-formaat SiO₂ (99,5% sporenmetaalbasis, deeltjesgrootte 10-20 nm) werden verkregen van Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, VS). Nanodeeltjes werden gesuspendeerd in RPMI 1640 Medium om een ​​voorraadoplossing te creëren, gedispergeerd door ultrasone trillingen gedurende 20 minuten, verdund tot geschikte concentraties en gedispergeerd gedurende nog eens 20 minuten.

Kenmerken van SiO₂ NP's

De grootte en het zeta-potentieel zijn vastgelegd met een Malvern Zetasizer Nano ZSP.

RNA-extractie en qRT-PCR

De long- en testismonsters werden snel ingevroren in vloeibare stikstof en vervolgens na ongeveer 4 uur bij 80 ° C bewaard. We hebben de monsters ontdooid voordat we de monsters hebben geëxtraheerd.

Het totale RNA werd uit de monsters geïsoleerd met behulp van 1 ml TRIzol-reagens (Invitrogen Life Technologies Co, VS). Het mengsel werd gedurende 5 minuten bij 80% vermogen aan ultrasoon geluid onderworpen, er werd 0,2 ml chloroform toegevoegd en vervolgens gecentrifugeerd bij 12.000g /min bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Vervolgens werden drie stappen van fenol/chloroform-zuivering toegevoegd om eiwitten kwijt te raken. Vervolgens gebruikten we UV-absorptie om het RNA-gehalte en de kwaliteit van elk monster te meten bij 260 en 280 nm. De primersequenties van mRNA's worden weergegeven in aanvullend bestand 1:Tabel S1 en S2. qRT-PCR werd uitgevoerd met behulp van de instructies van de fabrikant, zoals eerder beschreven [19]. Real-time PCR werd uitgevoerd met SYBR Green (Vazyme). De PCR-cyclus was als volgt:initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 30 seconden, gevolgd door 40 denaturatiecycli bij 95 ° C gedurende 15 seconden, uitgloeien bij 60 ° C gedurende 15 seconden en verlenging bij 72 ° C gedurende 30 seconden. De hoeveelheid doelwitgenen werd geanalyseerd met behulp van de 2^-ΔCt-methode na normalisatie met β-actine.

DNA-extractie, bisulfietbehandeling en bisulfietsequencing PCR

DNA werd geïsoleerd uit testikel- en longweefsel met behulp van een DNA-kit (QIAamp DNA Mini Kit; Qiagen. No.51304; VS) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Bisulfietconversie van 500 ng van al het genomische DNA werd bereikt met behulp van een kit (EpiTect® Bisulfite-kit; Qiagen. No. 59104; VS) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Verschillende CpG-methylatie-oligonucleotiden werden ontworpen met behulp van Methyl Primer Express v1.0-software en de sequenties zijn P1-F 5'-TTGGGTTTTGAGGAGT AGTA-3', P1-R 5'-ACATCCTATTCCCTAATAAAAATT-3'; P2-F 5′-TATTGGTTTGGTATATATGGATGTA-3′, P2-R 5′-ATAAAACACTTAACTCRTACCRTA-3′; P3-F 5′- TTTGTGTAGTTGTGTTATGGTATATTT-3′, P3-R 5′- ACCCATAACAAACCACAACA-3′; P4-F 5′-TTGTGGTTTGTTATGGGTAAGTT-3′, P4-R 5′-TCAAAACATTCTCCATTAACAAAA-3′.

Elk DNA-monster werd als volgt geamplificeerd door PCR:2,5 μl 10 × PCR buffer PCR-reactiemengsel met 500 ng het met bisulfiet behandelde DNA, 0,5 μl voorwaartse en achterwaartse primers, 0,5 μl dNTP Mix, 0,5 μl rTaq (500 U, dNTP , Mg ²⁺ ) (Takara Bio, Tokyo, Japan), toevoeging van ddH₂ O tot een volume van 25 μl. Na activering van polymerase bij 94 °C gedurende 10 minuten, werd het gevolgd door 40 cycli van de volgende volgorde:30 s bij 94 °C, 30 s bij 58 °C, 1 minuut bij 72 °C en uiteindelijke verlenging bij 72 ° C gedurende 10 min.

Celcultuur en behandeling

A549-cellen werden gekocht bij ATCC (Manassas, VA, VS) en werden in 1640 gekweekt, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C en 5% CO₂ in een bevochtigde incubator. De cellen werden uitgeplaat op platen met 96 putjes, geïncubeerd met verschillende concentraties SiO₂ NP's:62,5, 125, 250, 500, 1000 en 2000 μg/ml gedurende 24 uur.

Cell Viability Assay

Cellulaire levensvatbaarheid werd geëvalueerd met de CCK8-proliferatietest. Cellen werden uitgeplaat met een dichtheid van 1,5 × 10 ⁴ per putje in een plaat met 96 putjes en een nacht geïncubeerd. Na blootstelling aan SiO₂ NP's in verschillende concentraties, 100 μl CCK8 werd aan elk putje toegevoegd en de cellen werden 30 minuten bij 37 ° C geïncubeerd om CCK8-metabolisme mogelijk te maken. Uiteindelijk werd de absorptie bepaald bij 450 nm. De celremmende snelheden werden berekend en omgezet in de IC₅₀ met SPSS 15.0.

Statistische analyse

Alle berekeningen zijn uitgevoerd met behulp van de SPSS 15.0-software. Vergelijkingen tussen groepen werden gemaakt met behulp van niet-gerelateerde t tests en een Pearson chikwadraattest voor BSP. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde  ± SD. In alle gevallen een waarde van p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Karakterisering van SiO₂ NP's

We karakteriseerden SiO₂ NP's onder experimentele omstandigheden. De gemiddelde hydrodynamische straal en zeta-potentiaal van SiO₂ NP's in kweekmedium waren respectievelijk 371,77 ± 18,46 nm en 18,83 ± 2,12 mV (Fig. 1).

Karakterisering van SiO₂ NP's in schorsing. Deeltjes werden gesuspendeerd in celkweekmedium met 10% FBS. a, b Grootte en zeta-potentieel van SiO₂ NP's werden beoordeeld door Zetasizer Nano ZSP. c De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald door CCK8-assay na blootstelling aan verschillende concentraties SiO₂ NP's gedurende 24 uur. Gemiddelden ± SD van dubbele experimenten, elk bestaande uit drie technische replica's. *** p < 0,001

Effect van SiO₂ NP's op de A549-cellijn

Om de toxiciteit van SiO₂ . te bepalen NP's, we hebben een proliferatietest uitgevoerd met A549-cellen om de IC₅₀ te bepalen van SiO₂ NP's op A549-cellen. Zoals geïllustreerd in Fig. 1c, SiO₂ NP's verminderen de levensvatbaarheid van A549-cellen op een concentratieafhankelijke manier. De vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen is significant bij SiO₂ NP-concentratie hoger dan 62,5 μg/ml (p < 0,001). De IC₅₀ 24 uur van een chemische stof wordt gedefinieerd als een concentratie die 50% van de cel aantast na 24 uur blootstelling. De IC₅₀ 24 uur bepaald voor SiO₂ NP's waren 4942 μg/ml.

Effecten van SiO₂ NP's op muizenlong en testis

We hebben vastgesteld of blootstelling aan SiO₂ NP's bij een dosis van 12,5 mg/kg lichaamsgewicht zouden in ons muismodel leiden tot beschadiging van de longmembranen en zelfs tot beschadiging van de testis. Zoals weergegeven in de afbeeldingen, SiO₂ Blootstelling aan NP leidde tot een verstoord lamellair lichaam in histologische secties van de long (Fig. 2a, b) en mitochondriale cristae-schade in vergelijking met de controlegroep in de testis (Fig. 2c, d). Vervolgens onderzochten we de long- en testiseffecten van SiO₂ NP's over de activering van imprinting op de Dlk1/Dio3-imprinted regio.

TEM-beelden van long- en testisweefsels van ratten blootgesteld aan SiO₂ NP's. een Morfologie werd beoordeeld in longweefsels door SEM in controles. b Morfologie werd beoordeeld in longweefsels door SEM in behandelde groep. c Morfologie werd beoordeeld in testisweefsels door SEM in controles. d Morfologie werd beoordeeld in testisweefsels door SEM in behandelde groep. Schaalbalken vertegenwoordigen 2,0 μm

Expressie van de ingeprente genen op de muizenlong en testis

Om de veranderingen in long en testis te illustreren, hebben we de ingeprinte genen in deze weefsels gedetecteerd. We kiezen de 24 ingeprinte genen; ze waren Dio3 , Ddc , Dlk1 , Gpr1 , Gtl2 , H19 , Igf2, Igf2as , Igf2r , Inpp5f , Magel2 , Magi2 , Meest , Mir296 , Mir298 , Ndn , Nnat , Peg10 , Plagl1 , Pwcr1 , Rasgrf1 , Rtl1 , Snrpn , en Snurf. Dertien van deze genen komen tot expressie in zowel de longen als de testis:Dio3 , Dlk1 , Gpr1 , Gtl2 , Igf2r , Igf2 , Inpp5f , Peg10, Ndn , Nnat , Rasgrf1 , Rtl1 , en Snrpn (Fig. 3a, b). De differentieel tot expressie gebrachte genen van primaire focus waren op het met Dlk1/Dio3 bedrukt gebied, dat Dlk1 bevat. , Gtl2 , Rtl1 , en Dio3 .

Expressie van ingeprinte genen in long en testis. een De expressie van ingeprente genen in de longen. b De expressie van ingeprente genen in testis. *P < 0.05. **P < 0,01. Studenten t testen

Uitdrukking van de Dlk1/Dio3 Imprinted Region

Het ingeprinte Dlk1/Dio3-gebied bevat drie eiwitcoderende genen (Dlk1 , Gtl2 , Rtl1 , en Dio3 ) op het overgeërfde allel [20] (Fig. 4c). Om de rol van het Dlk1/Dio3-gebied in de long- en testisweefselrespons op SiO₂ op te helderen NP-behandeling, analyseerden we het methylatiepatroon van DMR in vergelijking met de controles. Verschillende genen zijn het doelwit van methylering in de long en de testis. De uitdrukking van de Dlk1 en Dio3 werden opgereguleerd in zowel de longen als de testis, terwijl Rtl1 werd alleen opgereguleerd in de testis (Fig. 4a, b).

De uitdrukking van het met Dlk1 / Dio3 bedrukt gebied. een De genen van het Dlk1/Dio3-gebied die in de long tot expressie worden gebracht. b De genen van het Dlk1/Dio3-gebied komen tot expressie in de testis. c Schema van de Dlk1/Dio3-regio. *P < 0.05. **P < 0,01. Studenten t testen

De methylering van Dlk1/Dio3 DMR-regio's

Om verder te onderzoeken of de expressie van genen verandert als reactie op DNA-methylatie, hebben we de methyleringsstatus van dit gebied in de muizenlong en testis aangepakt. In DNA-methylatie-analyse bepaalden we de sequenties van de drie secties van CpG-eilanden. In de testis zijn ze gehypomethyleerd; op CpG-eiland 1 zijn ze echter significant gehypermethyleerd (Fig. 5). In de long is de hele methylering hetzelfde als in de testis, terwijl het CpG-eiland 2 hypermethylering vertoonde (Fig. 6).

De methylering van Dlk1/Dio3 DMR-regio's in testis. een De methylering van CpG-eiland 1 in de controle- en behandelde weefsels. b De methylering van CpG-eiland 2 in de controle- en behandelde weefsels. c De methylering van CpG-eiland 3 in de controle- en behandelde weefsels

De methylering van Dlk1/Dio3 DMR-regio's in de longen. een De methylering van CpG-eiland 1 in de controle- en behandelde weefsels. b De methylering van CpG-eiland 2 in de controle- en behandelde weefsels. c De methylering van CpG-eiland 3 in de controle- en behandelde weefsels

Discussie

Het toenemende gebruik van nanomaterialen heeft geleid tot bezorgdheid over mogelijke gevolgen voor de menselijke gezondheid en het milieu. Eerdere studies hebben aangetoond dat SiO₂ NP's kunnen long- en cardiovasculaire schade veroorzaken, zoals longontsteking en myocardiale ischemische schade bij oude ratten [21]. Bovendien kunnen nanodeeltjes een effect hebben op kiembanen, aangezien dergelijke cellen gevoeliger bleken te zijn voor de toxische effecten van Ag NP's en nadelige effecten vertoonden na blootstelling aan lagere doses. Blootstelling aan Ag NP verhoogde het aantal afwijkingen dat werd waargenomen in de zaadcellen van ratten en verminderde de integriteit van zowel het acrosoom als het plasmamembraan naast het verminderen van de mitochondriale activiteit [22]. Ons onderzoek maakt deel uit van een reeks onderzoeken waarbij een experimenteel platform wordt gebruikt om het potentieel van nanodeeltjes te evalueren om mannelijke organismen en zelfs hun niet-blootgestelde nakomelingen aan te vallen.

In ons vorige in vitro-onderzoek rapporteerden we dat kortdurende blootstelling aan sommige nanodeeltjes leidt tot celapoptose en afwijkende expressie van ingeprinte genen in TM-4 Sertoli-cellen. Deze bevindingen tonen aan dat abnormale expressie van ingeprinte genen een onderliggend mechanisme kan zijn voor nanodeeltjes om reproductietoxiciteit te induceren [23]. Bovendien bevorderen sommige omgevingsfactoren, zoals hormoonontregelaars, in ons vorige in vivo onderzoek ook een fenotype of ziektetoestand, niet alleen bij het blootgestelde individu, maar ook bij opeenvolgende generaties nakomelingen. Epimutaties in de kiembaan die permanent worden geprogrammeerd, kunnen de overdracht van epigenetische transgenerationele fenotypes mogelijk maken [19]. Het doel van deze studie was om veranderingen in de epigenetische toestand door SiO₂ . te onderzoeken NP-behandeling in een muizenmodel om de mechanistische basis te leggen voor mannelijke transgenerationele effecten.

Epigenetische toestand is een term die wordt gebruikt om chemische modificaties te definiëren die plaatsvinden binnen een genoom zonder de DNA-sequentie te veranderen [24]. Epigenetische mechanismen, waaronder DNA-methylatie, ingeprinte genen, histonmodificaties en niet-coderende RNA-expressie, kunnen de genomische functie in een exogene omgeving beïnvloeden [25]. Voor zover wij weten, is onze studie de eerste die SiO₂ . heeft onderzocht NP's die long- en testistoxiciteit induceren op epigenetisch niveau.

We onderzochten eerst de acute toxiciteit van de SiO₂ NP's in A549-cellen, een menselijke longepitheelcellijn. Onze bevindingen bij experimentele muizen onthulden echter letsel in laminaire long type II epitheelcellen en testiculaire mitochondriale kamletsel na contact met SiO₂ NP's bij milieuconcentraties [26]. Om het mechanisme van de long- en testispathologie beter te begrijpen, hebben we ingeprente genen tot expressie gebracht. Genomische imprinting verwijst naar het tot zwijgen brengen van één ouderallel in zygoten van gameten, afhankelijk van de ouder van oorsprong; deze silencing vindt plaats via epigenetische processen zoals DNA-methylatie en/of histonmodificatie [27]. Eerdere studies hebben aangetoond dat ingeprente genexpressie in het Dlk1/Dio3-domein belangrijk is voor de groei van de foetus [28], de timing van de menselijke puberteit [29] en de gevoeligheid voor metabole ziekten [30]. Studies hebben gesuggereerd dat de IG-DMR de allelische methyleringsstatus van de Gtl2-promotor DMR dicteert, die vervolgens de genexpressie over het gehele Dlk1/Dio3-gebied regelt [17]. De belangrijkste functie van dit ingeprinte controlegebied is het erven van door kiemcellen aangestuurde DNA-methylatie als een gametisch signaal, en later om de daaropvolgende allel-specifieke DNA-methylatiepatronen in somatische cellen te behouden [31]. Onze studie toonde aan dat SiO₂ NP's induceren veranderingen in de expressie van het Dlk1/Dio3-gebied, zowel in long- als testisweefsels. In het Dlk1/Dio3-gebied, de door de vader tot expressie gebrachte genen (Dlk1 , Rtl1 , en Dio3 ) zijn bijzonder abnormaal in vergelijking met de controles na NP-behandeling. De resultaten van de bisulfietsequencing laten verschillende niveaus van hypomethylering in de long en de testis zien. De methyleringstoestand van IG-DMR is over het algemeen lager in behandelde weefsels, en deze hypomethylering kan het mechanisme van differentiële expressie van ingeprente genen vertegenwoordigen.

Conclusies

Concluderend geven onze resultaten aan dat SiO₂ NP-blootstelling kan belangrijke DNA-methylatieveranderingen induceren die cellulaire schade veroorzaken en dat deze veranderingen zeer belangrijk zijn voor de expressie van het met Dlk1 / Dio3 bedrukt gencluster. Belangrijk is dat de veranderingen in DNA-methylatie zowel de longen als de testisweefsels beïnvloeden. Deze resultaten spelen een belangrijke rol in ons toekomstig onderzoek naar de epigenomische effecten van de nanodeeltjes die worden geërfd door nakomelingen van blootgestelde modellen en de opheldering van de moleculaire mechanismen die dergelijke epigenetische veranderingen bemiddelen.

Afkortingen

BALF:

Bronchoalveolaire spoelvloeistoffen

CCK-8:

Celtelkit-8

DMR's:

Differentieel gemethyleerde regio's

EGFR:

Epidermale groeifactorreceptor

IG-DMR:

Intergene DMR

Kamerleden:

Microdeeltjes

NP's:

Nanodeeltjes