Frequentie-gemoduleerde golfdiëlektroforese van blaasjes en cellen:periodieke U-bochten bij de crossover-frequentie

Theoretisch model. Schematische weergave van de FM-DEP-kracht die wordt uitgeoefend op een cel die is gemodelleerd als een homogeen bolmodel met de permittiviteit en geleidbaarheid van ε _in en σ _in , respectievelijk. De bol is omgeven door een elektrolytmedium met zijn permittiviteit en geleidbaarheid van ε _uit en σ _uit , respectievelijk. Het homogene bolmodel is de vereenvoudiging van het bolvormige enkele schaalmodel dat de cel beschouwt als een uitgesmeerd cytoplasma omgeven door een membraan [9]

waar K _H en Δ τ worden als volgt gedefinieerd:K _H =(ε _in −ε _uit )/(ε _in +2ε _uit ), en \(\Delta \tau ^{-1}=\tau _{0}^{-1}-\tau ^{-1}\) met de straal R van het bolvormige object en twee karakteristieke tijden van τ ₀ =(ε _in −ε _uit )/(σ _in −σ _uit ) en τ =(ε _in +2ε _uit )/(σ _in +2σ _uit ).

Vervanging van het elektrische wisselstroomveld E _AC (r ,t )=A (r ) cos(2π f _AC t ) in vergelijkingen. (3) tot (5), we verkrijgen de gemiddelde DEP-kracht <F _DEP (r ,t )> dat is gemiddeld over cycli van het AC-veld [9, 15, 20]:

waar A _RMS geeft de RMS-vector (root mean squared) aan die voldoet aan \(\boldsymbol {A}_{\text {RMS}}^{2}=\boldsymbol {A}^{2}/2\), en χ (f _AC )≡2π R ³ ε _uit Re[K (f _AC )] hangt af van de toegepaste frequentie f _AC vanwege Re[K (f _AC )], het reële deel van de CM-factor [9, 15, 20]:

waar K _L =(σ _in −σ _uit )/(σ _in +2σ _uit ) en K _H , hierboven gedefinieerd, komen overeen met de echte CM-waarden in respectievelijk de lage en hoge frequentiegrenzen, en deze grenswaarden, K _L en K _H , moeten tegengestelde tekens hebben zodat f _X gedefinieerd door χ (f _X )=0 kan bestaan ​​[9, 15, 20].

Vergelijkingen (6) en (7) geven aan dat het AC elektrische veld de DEP-kracht creëert waarvan de richting afhangt van de toegepaste frequentie f _AC via χ (f _AC ) gegeven door Vgl. (7), waarin de stuiterende diatomeeëncel in Aanvullend bestand 1:Film S4 als volgt wordt uitgelegd (zie ook Fig. 3). Wanneer de toegepaste frequentie het plusteken geeft van het reële deel van de CM-factor (d.w.z. χ (f _AC )>0), kunnen we cellen waarnemen die worden aangetrokken door de uiteinden van de elektrodenaald (de positieve DEP) waarop de sterkte van het AC-veld, aangebracht via een paar elektrodenaalden, het grootst is. Het teken van de reële CM-factor kan worden omgekeerd naar het negatieve bij f _X , de verdwijnfrequentie van de echte CM-factor (d.w.z. χ (f _X )=0), waarbij we de diëlektroforetische kracht nul hebben zoals gevonden in Vgl. (6). In het negatieve teken van de CM-factor (d.w.z. χ (f _AC )<0), worden individuele colloïden afgestoten van het elektrodenaaldpaar (de negatieve DEP). De driehoekige diatomeeëncel in aanvullend bestand 1:film S2 stuiterde vanwege de tegengestelde richting van de AC-DEP's die werden veroorzaakt door de AC-velden met hun frequenties van 100 en 500 kHz; combineren vgl. (6) en de waargenomen diëlektroforetische richtingen, vinden we dat χ (100 kHz)>0 en χ (500 kHz)<0.

Vervolgens beschouwen we de FM-DEP door de fase die wordt gegeven door Vgl. (1) en (2) in Vgl. (3) tot (5). Zoals bewezen in aanvullend bestand 2, valideert de WBL-conditie van de FM-golf de geschatte vorm van de integratie in Vgl. (5), waardoor

die dezelfde vorm krijgt als die van de AC-DEP wanneer de tijdsafhankelijke frequentie f (t ) wordt vervangen door een constante frequentie van f _AC . We verkrijgen dus de beperkende vorm van de gemiddelde DEP-kracht <F _DEP (r ,t )> dat is gemiddeld over cycli van θ (t ) in het FM-veld (zie Vgl. (A1), (A13) en (A14) in aanvullend bestand 2):

van een soortgelijke vorm als Vgl. (6) voor de AC-DEP. Het verschil is of de coëfficiënt van χ {f (t )} hangt af van t via f (t ), die cyclisch verandert volgens de frequentiemodulatie met de periode van T _m =1/f _m .

Gebaseerd op de eenvoudige uitdrukking (9) van de FM-DEP, illustreren we met Fig. 4 het mechanisme van de bovenstaande U-bochten als gevolg van de FM-golf. Figuur 4 toont een schema van de DEP die wordt geïnduceerd door de FM-golf in de WBL wanneer het bereik van f (t ) dekt de crossover-frequentie f _X zodat f _c −Δ f ≤f _X ≤f _c +Δ f . In figuur 4 wordt verondersteld dat de frequentie-afhankelijkheid van het reële deel van de CM-factor, of χ {f (t )}, geeft de alternatieve tekenwijzigingen als volgt:minteken (χ {f (t )}<0) voor f (t )<f _X en plusteken (χ {f (t )}>0) voor f (t )>f _X , wat het geval is met onze experimenten. De vorige periode die voldoet aan f (t )<f _X heeft een tijdsduur, terwijl de laatste f (t )>f _X is behouden tijdens de rust van de periode:één cyclus wordt ingedeeld in twee perioden die respectievelijk rood en blauw zijn gemarkeerd in Fig. 4.

Krachtrichting gerelateerd aan de frequentiemodulatie. Een illustratie van de periodieke U-bochten als gevolg van de FM-golf met zijn tijdsafhankelijke frequentie van f (t ) met een crossover-frequentie f _X

Net als bij de AC-DEP, Vgl. (9) houdt in dat het minteken (χ {f (t )}<0) creëert een afstotende DEP-kracht tussen de cel en de micro-elektroden terwijl wordt voldaan aan dat f (t )<f _X . Hierdoor verlaat de cel het gebied rond de naaldpunten van de micro-elektrode waartussen de grootte van het elektrische veld het grootst is:de cel ervaart de negatieve DEP tijdens de roodperiode van Δ t _n in Fig. 4. Op het moment t _X als een oplossing van f (t _X )=f _X , χ (f ) verdwijnt, gevolgd door het teken verandert in χ (f )>0 while f (t )>f _X , en dienovereenkomstig wordt de DEP-kracht omgeschakeld naar de aantrekkende kracht bij t _X . Na het maken van een U-bocht bij t _X als gevolg van de omkering in de richting van de DEP-kracht, begint de beoogde cel de micro-elektrode te naderen die in de tegenovergestelde richting migreert en wordt uiteindelijk gevangen tussen de uiteinden van de elektrodenaalden of vastgemaakt aan een van de elektroden:de cel ervaart de positieve DEP tijdens de blauwe periode van Δ t _p in Fig. 4. Figuur 4 geeft aan dat de cyclus van het verlaten, naderen en blijven op de micro-elektrode herhaald moet worden met de modulatieperiode van T _m , in overeenstemming met Fig. 2:Δ t _n +Δ t _p =T _m . Het diëlektroforetische mechanisme afgebeeld in Fig. 4 kan dus de periodieke U-bochten verklaren die zijn waargenomen in Aanvullend bestand 1:Films S5 en S6 evenals Fig. 2.

Laten we eens kijken naar de periodieke oplossing van de vergelijking, f (t _X )=f _X . Zoals te zien is in Fig. 4, t _X wordt uitgedrukt als t _X =n T _m +0.5Δ t _p =n T _m +0.5(T _m −Δ t _n ) met een geheel getal van n =0, ±1, ±2,⋯, wat verder luidt als

Vervanging van Eq. (10) in Vgl. (2), we hebben voor n =0 dat

verduidelijken dat de FM-DEP-methode de crossover-frequentie bepaalt als de tijdsduur Δ t _n van het verlaten van de micro-elektrode tot het maken van de U-bocht kan nauwkeurig worden gemeten.

Vergelijking van crossover-frequenties van een enkele MLV bepaald op basis van de FM- en AC-DEP's

We onderzochten de experimentele nauwkeurigheid van Vgl. (11). Experimenteel is het vaak nodig dat de biologische cellen in een elektrolyt worden gedispergeerd. Voor MLV's is het gebruik van gedeïoniseerd water echter toegestaan ​​tijdens het bereidingsproces van rehydratatie en verdunning. We hebben dus de zoutvrije MLV-suspensie gebruikt om de crossover-frequenties te vergelijken die zijn bepaald op basis van zowel AC- als FM-DEP's.

De diëlektroforetische U-bochten van een gerichte MLV werden veroorzaakt door de FM-golf in het bereik van 10 kHz ≤f (t )≤ 50 kHz (d.w.z. f _c =30 kHz en Δ f =20 kHz) met een instelling die f _m =0,1 Hz, en dienovereenkomstig heeft de FM-DEP een periode van 10 s. In de experimenten duurt het minder dan 30 s om een ​​paar U-bochten van de beoogde MLV te observeren van het verlaten tot het naderen van micro-elektroden. Uit het traject hebben we de gemiddelde vertrektijd verkregen die \(\overline {\Delta t_{n}}=5.8\pm 0.2\) s. Omdat de WBL-voorwaarde van toepassing is op het huidige experiment dat voldoet aan de voorwaarde dat f _m /Δ f /f _m , f _, m /f (t )<10 ⁻⁵ , werd de crossover-frequentie beoordeeld als f _X =35±1 kHz door \(\overline {\Delta t_{n}}=5.8\pm 0.2\) s te vervangen door Eq. (11).

For comparison, we made use of the programmable manipulator in the AC-DEP method that tries to evaluate the crossover frequency of the same targeted MLV to which the sinusoidal electric field with a frequency in the range of 30 to 100 kHz was applied via the electrode needle pair for inducing the AC-DEP. Because the programmable manipulator carries the electrode needle pair at a constant speed in one direction, we can measure the dielectrophoretic force similarly to the laser-trapping experiments [39]. Attaching the MLV on an electrode tip that undergoes uniform linear motion, not only the AC-DEP force but also the hydrodynamic force caused by the one-dimensional motion are exerted on the MLV. With the gradual increase of electrode velocity, F _DEP eventually becomes smaller than the hydrodynamic force. As a result, the MLV initially attached to the moving electrode, owing to the DEP attraction, is desorbed by the hydrodynamic force. Defining the critical value, v _c , by the maximum velocity value of the microelectrode pair prior to the desorption, the force balance equation between the DEP and hydrodynamic forces reads [39]

waar F _DEP (f _AC )e ≡<F _DEP> with the unit vector e defined by \(\boldsymbol {e}=\nabla {\boldsymbol {A}}^{2}_{\text {RMS}}/|\nabla {\boldsymbol {A}}^{2}_{\text {RMS}}|\), η the water viscosity at 25 °C and 2R the diameter of the MLV.

Additional file 1:Movies S7 and S8 demonstrates the force measurement using the above AC-DEP method at the applied frequency of f _AC =60 kHz. In Additional file 1:Movie S7, the velocity of the electrode pair controlled by the programmed manipulator is 110 μ m/s, which is lower than v _c ; therefore, the MLV remains attached to one part of the electrode pair owing to the dielectrophoretic attraction. Additional file 1:Movie S8, on the other hand, shows the higher electrode speed of 120 μ m/s, under which the dielectrophoretic force becomes smaller than the hydrodynamic force that is exerted on the MLV, thereby desorbing the MLV from the electrode. Accordingly, v _c is evaluated to be 110 μ m/s ≤v _c ≤ 120 μ m/s, and we can calculate F _DEP (60 kHz) using Eq. (12).

We can determine f _X from the experimental results of F _DEP at various external frequencies. Figure 5 shows the frequency dependence of F _DEP , indicating that the DEP force experienced by the MLVs was reduced by lowering the applied frequency. It is found from Eqs. (6) and (7) that the fitting function of F _DEP (f _AC ) can be expressed as

Frequency dependence of F _DEP . The FM-DEP force (F _DEP ) as a function of external frequency (f _AC ) of applied AC field where F _DEP has been evaluated from Eq. (12), the balance equation between the FM-DEP and hydrodynamic forces exerted on a single MLV. It can be seen that F _DEP is increased and saturated as f _AC is higher, reflecting a typical behavior of the relaxation spectrum of the real CM factor. The solid line represents the best-fit result of Eq. (13)

implying that

Equation (13) is depicted by the solid line in Fig. 5 that has been fitted to the experimental data using the best-fit results of three parameters:L =−21.02 pN, H =19.03 pN, and τ =4.9 μ s. Substituting these results into Eq. (14), we evaluate that f _X =34.15 kHz, which coincides with the result of f _X =35±1 kHz evaluated from the FM-DEP method. The FM-DEP method is thus validated in terms of the consistency with the direct force measurement using the AC-DEP method.

Conductivity Dependencies of the Crossover Frequencies for Biological Cells

Let us return to the dielectrophoretic U-turns of biological cells mentioned in Fig. 2 to assess the practical reliability of the crossover frequencies when the FM-DEP method is applied to cell suspensions. Recently, an elaborate theory [40] has investigated, in more detail than before, the relationship between the homogeneous sphere model (see Fig. 3) and the single-shell model where the inner structure of cell is represented by a smeared-out cytoplasm surrounded by a membrane. As a result, the relation between f _X and the suspension conductivity σ _uit has been formulated using radius R of a cell, membrane capacitance C _m , and cytoplasmic conductivity σ _cyt [40]:

waar f _{X 0} is the extrapolated value to the crossover frequency at σ =0 mS/m and will be treated as a fitting parameter herein. The elaborate treatment adds the squared term, the second term on the right hand side of Eq. (15), to the conventional linear relation which has mainly been used for evaluating C _m from f _X [40–45]. Theoretically, it has still been claimed [40] that Eq. (15) is valid within a lower range of σ _uit such that σ _uit <10 mS/m; however, it should be better to include the squared term in the evaluation of C _m , considering that our range of σ _uit is relatively high compared with previous results in the range of 10 mS/m ≤σ _uit ≤ 100 mS/m [40–45]. Hence, we determined σ _cyt as well as C _m from fitting Eq. (15) to the experimental results of f _X as an increasing function of σ _uit .

There are three kinds of biological cell used:TL and BL cells of human leukemia and RB cells of three human volunteers. In all the experiments using any species of cell, the conductivities were within the range of 60 to 160 mS/m, and the modulation frequency was set to be 0.25 Hz. Regarding the instantaneous frequency, most of the experiments adopted the range from 100 to 1.5 MHz (i.e., f _c =800 kHz and Δ f =700 kHz); exceptionally for leukemia cells, the frequency range was extended to 50 kHz ≤f (t )≤1550 kHz (i.e., f _c =800 kHz and Δ f X =750 kHz) in the conductivity range of 60 mS/m≤σ ≤80 mS/cm because f _X in this σ -range has been found to be lower than 100 kHz, and we were unable to observe the DEP U-turns in the range of 100 kHz ≤f (t )≤1500 kHz. Both of these frequency sets satisfy the WBL condition of Δ f /f _m , f (t )/f _m <10 ⁻⁵ as before.

Each time we measured the leaving times of cells dispersed in a suspension, we looked for an appropriate spot at which a few cells having a similar size could simultaneously experience the FM-DEP above the substrate, and the microelectrode tips were placed at the measurable position using the micromanipulator. We continued such scanning inside the cell suspensions until the FM-DEP trajectories of 10 cells were collected in total at a couple of appropriate positions. For each kind of cell, the measurement of 10 cells was repeated twice using different drops of the same cell suspension. As mentioned, it is indispensable for the implementation of the FM-DEP measurement at each spot to suppress the electrically induced solvent flows as much as possible. Hence, we traced only two cycles of the U-turn path so that the duration time of applying the electric field could be adjusted to be less than 10 s, and, correspondingly, the leaving time of each cell is given as the average of each trajectory, including the two U-turns. The mean leaving time \(\overline {\Delta t_{n}}\) of each cell suspension is thus obtained from averaging the leaving times of 20 cells. Particularly for human RB cells, we further averaged three sets of the mean crossover frequencies obtained for three RB cell suspensions of three human beings, supposing that cells of the same species are similar in C _m en σ _cyt as well as in R . The two-step averaging of Δ t _n will be denoted by \(\left <\overline {\Delta t_{n}}\right>\). Substituting into Eq. (10) the experimental data of either \(\overline {\Delta t_{n}}\) or \(\left <\overline {\Delta t_{n}}\right>\), the mean crossover frequency <f _X > was obtained.

Figure 6 shows the σ _uit -dependencies of <f _X > measured for the above three kinds of biological cells using the FM-DEP method. The solid lines in Fig. 6 depict the best-fit results of Eq. (15). We evaluated C _m en σ _cyt from the best fitting of Eq. (15) into which the observed radii (R _obs ) were inserted. Table 1 lists the fitting results of C _m en σ _cyt , where we used the observed radii of 10 μ m ≤ 2R _obs ≤ 15 μ m for TL and BL cells, and 7.5 μ m ≤ 2R _obs ≤ 10 μ m for RB cells in evaluating C _m . It is to be noted from Table 1 that different species have different membrane capacitances, which are in good agreement with those reported in the literature [40–47]; the C _m values of RB cells with stationary whole blood samples from normal (healthy) donors are in excellent agreement with our value [46, 47], but are substantially higher than those of washed RB cells in isotonic buffered saline as noted in [47]. The best-fit results simultaneously provided cytoplasmic conductivities, which were consistently similar as seen from Table 1, but were slightly lower than the range of previous reports that 0.2 S/m ≤σ _cyt ≤1 S/m [40, 45, 48–51]. These results support that the FM-DEP method retains the practical reliability needed for the treatment of living cells.

Conductivity dependences of crossover frequencies. Mean crossover frequency, <f _X >, of TL cells (blue triangles), BL cells (green diamonds), and RB cells (red circles) varying with increase of solution conductivity σ _uit . The best-fit results of Eq. (15) are delineated by the solid lines