Onderzoek naar fysisch-chemische kenmerken van een op nanoliposoom gebaseerd systeem voor dubbele toediening van geneesmiddelen

Resultaten en discussie

Effect van voorbereidingsprocessen op nanoliposoomkenmerken

Dual drug-ingekapselde nanoliposomen werden bereid door ERL in te kapselen in een lipide dubbellaags membraan en DOX in het binnenste compartiment van de nanoliposomen. Liposomen ingekapseld met alleen ERL werden bereid met hydraterend ERL-opgenomen lipidemembraan met een waterige AS-oplossing. Tijdens deze processen worden ERL-moleculen via hydrofobe attracties in het lipidemembraan opgenomen en vervolgens spontaan ingekapseld in het lipidedubbellaagmembraan van de liposomen. Na de hydratatie werd de liposoomsuspensie ultrasoon behandeld met behulp van de sonde-sonicator van het hoorntype om de liposoomdiameter te verkleinen. Om de effecten van de ultrasone trillingen en de koelmethoden op de liposoomdiameter te onderzoeken, werden de liposomen behandeld met een toename van de ultrasoonapparaattijd onder verschillende koelomstandigheden en de resultaten worden getoond in Fig. 2. Figuur 2a geeft het effect weer van de ultrasone geluidsgolven op de diameter en polydispersiteitsindex (PDI) van de liposomen die zijn behandeld onder de koelconditie van een ijswaterbad. De diameter van in ERL ingekapselde liposomen die niet werden behandeld met ultrasone trillingen was 759 ± 44 nm. Tot 10 min ultrasone trillingen nam de liposoomdiameter echter opmerkelijk af tot 222 ±   40 nm, en na 10 min was er geen significante verandering van de diameter naarmate de ultrasone tijdsduur toenam. Deze resultaten geven aan dat in ERL ingekapselde liposomen gevormd door de hydratatie meestal multilamellaire blaasjes (MLV's) zijn. De hoge energie die via de ultrasone trillingen aan liposomen van het MLV-type wordt geleverd, exfolieert de meerlaagse MLV's en demonteert de grote liposomen. In waterige oplossing worden de lipiden die van de MLV's zijn gescheiden, door hydrofobe attracties zelf geassembleerd en zo omgezet in grote unilamellaire blaasjes (LUV) - of kleine UV (SUV) -type nanoliposomen. Naarmate deze verschijnselen zich herhalen, neemt de gemiddelde diameter van het nanoliposoom geleidelijk af [24,25,26]. Zoals getoond in Fig. 2a, was de diameter van de liposomen opmerkelijk verminderd in een korte periode van ultrasone trillingen. Er wordt gedacht dat tijdens deze periode de meeste liposomen van het MLV-type werden omgezet in liposomen van het LUV- of SUV-type [27]. De ultrasone trillingen langer dan 10 min veroorzaakten een lichte afname van de liposoomdiameter, wat wijst op minder transformatie van het vesikeltype met de ultrasone trillingen. De PDI van de liposoomdiameter nam af met een toename van de ultrasone trillingen, wat suggereert dat de liposoomdiameter met de tijd uniform werd ondanks een lichte toename van de PDI na 20 minuten. Figuur 2b geeft het effect weer van de tijd met ultrasone trillingen op de diameter en PDI van de liposomen die worden behandeld onder afkoeling van een waterbad. De diameter van de liposomen die niet werden behandeld met ultrasone trillingen was 1433 ± 143 nm. De liposoomdiameter nam significant af tot 337 ± 67 nm tot 5 minuten ultrasone trillingen, en na 5 minuten was er een geleidelijke afname van de diameter tot 15 minuten, gevolgd door een kleine verandering in de diameter. De PDI van de liposoomdiameter varieerde met de ultrasone trillingen tot 15 min en bereikte daarna een plateau. Onder de waterbadconditie was de tijd die werd besteed aan het verminderen van de liposoomdiameter tot onder 30% van de diameter van onbehandelde liposomen korter dan de tijd die werd besteed onder de ijswaterbadconditie. Aangenomen wordt dat de reductie van de liposoomdiameter werd gemaakt door overdracht van de thermische energie gegenereerd door de ultrasone trillingen naar liposomen van het MLV-type. Vergeleken met de ijswaterbadconditie was de temperatuur van de liposoomsuspensie die onder de waterbadconditie werd gesoniceerd, te hoog verhoogd, wat impliceert dat de warmte van de liposoomsuspensie die plaatsvond als gevolg van een bulkverwarming door ultrasone cavitatie minder efficiënt werd afgegeven. Om de liposoomsuspensie te beschermen tegen bijwerkingen zoals een gemiddelde verdamping en een mogelijke verslechtering van lipidemoleculen veroorzaakt door oververhitting, werd het ijswaterbad gekozen als de koelconditie voor de ultrasone trillingen. Aan de andere kant werden de ultrasone liposomen gedialyseerd om niet-ingekapseld AS te verwijderen. De ERL- en AS-ingekapselde nanoliposomen bereid met behulp van ultrasone trillingen en de dialyse hadden ongeveer 140 nm van de gemiddelde nanoliposoomdiameter, wat wijst op een lichte afname van de nanoliposoomdiameter door de dialyse. De ERL- en AS-ingekapselde nanoliposomen werden gebruikt voor DOX-inkapseling in het binnencompartiment van de nanoliposomen met behulp van de AS-gradiëntmethode.

Effecten van sonde-sonicatietijd op diameter en polydispersiteitsindex van ERL-ingekapselde nanoliposomen:een ijswaterbad (a ) of een waterbad (b ) koeling van liposoomsuspensie in een container tijdens ultrasone trillingen (n = 3, de gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM)

Figuur 3 toont de diameter van DOX- en ERL-ingekapselde nanoliposomen volgens de tijd van ultrasone trillingen met behulp van een badsonicator tijdens een DOX-laadproces. Lage variaties van de diameter waren vergelijkbaar met die na 10 minuten ultrasone trillingen van ERL-ingekapselde nanoliposomen zoals weergegeven in figuur 2a. Ondanks de toename van de tijd voor ultrasone trillingen, veranderde de diameter van de nanoliposoom niet significant tot 45 minuten ultrasone trillingen. Deze resultaten kunnen worden toegeschreven aan het feit dat DOX- en ERL-ingekapselde nanoliposomen LUV's of SUV's zijn [27]. Ondertussen, toen de ultrasone tijd langer was dan 45 min, trad de toename van de SEM van de gemiddelde nanoliposoomdiameter op, wat wijst op een toename van verschillen tussen de liposoommonsters. De PDI van de diameter nam af naarmate de ultrasone tijdsduur toenam. Deze resultaten suggereren dat de uniformiteit van de liposoomdiameter toenam met de ultrasone trillingen, ondanks een lichte toename van de PDI na 60 minuten ultrasone trillingen. Kortom, de verandering in nanoliposoomdiameter door ultrasone trillingen was de hoogste in de transformatiefase waarin de liposomen zouden worden omgezet van MLV's naar LUV's of SUV's. Daarom was de ultrasone trillingen voor het verminderen van de liposoomdiameter het meest effectief wanneer de behandeling werd uitgevoerd tussen de hydratatie van het lipidemembraan en de DOX-inkapseling in het binnencompartiment van ERL-ingekapselde nanoliposomen voor een relatief korte duur.

Effecten van badsonicatietijd op diameter en polydispersiteitsindex van DOX- en ERL-ingekapselde nanoliposomen (n = 3, de gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM)

Effect van methode voor het laden van medicijnen op EE

De dual-medicijn-ingekapselde nanoliposomen werden bereid met behulp van DOX-lading in ERL-ingekapselde nanoliposomen met ongeveer 30% EE van ERL en 140 nm van de nanoliposoomdiameter. De hoeveelheid ingekapseld DOX of ERL in de liposomen werd gemeten na vernietiging van de liposomen met een oppervlakteactieve stof voor volledige afgifte van de geneesmiddelen uit de liposomen. De fluorescentie-intensiteit van DOX en de absorptie van ERL werden respectievelijk gemeten met spectrofluorometrie en UV-Vis-spectrometrie. Om de effecten van DOX-laadmethoden op EE van DOX in ERL- en DOX-ingekapselde nanoliposomen te onderzoeken, werd een actieve laadmethode zoals pH-gradiënt of AS-gradiëntmethode gebruikt voor DOX-inkapseling in de liposomen. Het verschil in EE tussen de twee methoden voor het laden van geneesmiddelen werd onderzocht en de resultaten worden getoond in Fig. 4. De EE's van DOX met behulp van de AS-gradiëntmethode waren 90% of meer, en de EE met behulp van de pH-gradiënt was ongeveer 17%, wat aangeeft dat de AS-gradiëntmethode veel effectiever was in DOX-inkapseling dan de pH-gradiëntmethode [28].

Inkapselingsefficiëntie van DOX in dual drug-ingekapselde nanoliposomen volgens DOX-laadmethoden en ammoniumsulfaat (AS) concentraties:CA citroenzuur (n = 3, de gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM)

Toen de veranderingen in de EE's van DOX volgens de AS-concentraties werden vergeleken, was de EE de hoogste en de SEM van de EE de laagste bij 350 mM AS. De AS-gradiënt- of pH-gradiëntmethode maakt gebruik van een geneesmiddeltranslocatiemechanisme, dat ervoor zorgt dat de medicijnen buiten de nanoliposomen migreren naar het binnenste compartiment van de nanoliposomen vanwege een drijvende kracht die wordt gegenereerd door een transmembraan-ionconcentratiegradiënt van de nanoliposomen [29, 30]. De EE van DOX volgens de AS-gradiëntmethode was echter behoorlijk hoger dan die van de pH-gradiëntmethode. Deze resultaten kunnen worden toegeschreven aan het feit dat de AS-gradiëntmethode effectiever is in het ontwikkelen van kristallijne complexen dan de pH-gradiëntmethode vanwege de hogere kristalliseerbaarheid tussen de geïoniseerde DOX en de tegenionen in de nanoliposomen [31, 32].

Effect van het laden van medicijnen op EE

Om het effect van behandelingsomstandigheden voor een mengsel van DOX-oplossing en ERL-ingekapselde nanoliposomen op DOX's EE tijdens het DOX-laadproces te onderzoeken, werden vier experimentele groepen getoond in Fig. 5a ontworpen en geëxperimenteerd volgens de verschillende behandelingsomstandigheden. Groep 1 was het mengsel dat werd behandeld in de volgorde van een incubatie, een ultrasoonapparaat en een nachtelijke dialyse. In groep 2, om het effect van een equilibratie van het gesoniceerde mengsel op de EE te onderzoeken, werd het mengsel geïncubeerd, gesoniceerd, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geëquilibreerd en vervolgens een nacht gedialyseerd. Als een groep voor het onderzoeken van het effect van een langdurige sonicatie op de EE, werd groep 3 het mengsel geïncubeerd, 15 minuten bij 65 ° C gesoniceerd en vervolgens een nacht gedialyseerd. Bovendien, als een groep voor het onderzoeken van effecten van een langdurige sonicatie en een equilibratie op de EE, werd groep 4 het mengsel geïncubeerd, 15 minuten gesoniceerd bij 65 ° C, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geëquilibreerd en vervolgens 's nachts gedialyseerd. In alle groepen werd DOX-laden uitgevoerd met behulp van de AS-gradiëntmethode. Zoals weergegeven in figuur 5b, waren de EE's van DOX van de groepen 1, 2, 3 en 4 respectievelijk 93 ± 7.8, 98 ± 2.5, 83 ± 4.9 en 59 ± 4.2%. In vergelijking met de EE van groep 3 was de EE van groep 1 hoger, wat aangeeft dat een kortere duur van badsonicatie een effectievere behandeling is om de EE in de nanoliposomen te verhogen. In vergelijking met de EE van groep 1, had groep 2 een hogere EE van DOX. De EE van groep 4 was de laagste van alle geëxperimenteerde groepen. In tegenstelling tot de EE-verbetering door de equilibratie na een kortdurende sonicatie toegepast op groep 2, was de equilibratie na een langdurige sonicatie toegepast op groep 4 niet effectief voor de EE-verbetering. Deze resultaten kunnen te wijten zijn aan de overmatige hoeveelheid energie die aan de suspensie wordt geleverd, wat de nanoliposomen zou kunnen verstoren tijdens de hierboven beschreven badsonificatie. Er wordt ook gedacht dat door langdurige badsonicatie in groepen 3 en 4, de EE werd verlaagd vanwege een afname van het AS-gehalte in de nanoliposomen. Omdat de temperatuur van de nanoliposoomsuspensie ver boven de faseovergangstemperatuur (T _c ) door de langdurige sonicatie van het bad, nam de vloeibaarheid van de lipidedubbellaag toe en induceerde daarom de AS-afgifte uit de liposomen. De nanoliposoommonsters van groep 3 werden onmiddellijk na de badsonificatie gedialyseerd, wat een snelle afkoeling van de monsters suggereert. Daarentegen werden de nanoliposoommonsters van groep 4 behandeld door de langdurige badsonicatie gevolgd door de equilibratie, die de AS-afgifte zou kunnen ondersteunen, de vorming van DOX-sulfaatcomplex buiten de liposomen zou kunnen verhogen en daarom de EE zou verlagen. Hoewel het evenwicht na de langdurige sonicatie niet effectief was, suggereren deze resultaten dat het DOX-laadproces, zoals een opeenvolgende behandeling van een mengsel van de DOX-oplossing en de ERL-ingekapselde nanoliposomen - een incubatie boven T _c van fosfolipide, een badsonicatie, een evenwicht onder de T _c , bijvoorbeeld bij kamertemperatuur en een nachtelijke dialyse - is een effectievere methode om de EE te verhogen dan andere processen zonder de evenwichtsbehandeling [33,34,35].

Inkapselingsefficiëntie van DOX in dubbele medicijn-ingekapselde nanoliposomen volgens verschillende omstandigheden voor het laden van geneesmiddelen:omstandigheden voor het laden van geneesmiddelen voor elke experimentele groep (a ) en de efficiëntie van de inkapseling van geneesmiddelen van de experimentele groepen (b ) (n = 3, de gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM)

Morfologie en fysieke stabiliteit van duale geneesmiddel-ingekapselde nanoliposomen

Figuur 6 toont de morfologie van de nanoliposomen waargenomen door TEM. De monsters voor TEM-waarneming werden bereid met behulp van drop-casting van de ERL- en DOX-co-ingekapselde nanoliposomen op een met koolstof gecoat koperen rooster en drogen aan de lucht bij kamertemperatuur. Om de kenmerken van de dual-medicijn-ingekapselde liposomen te vergelijken met de single-medicament-ingekapselde liposomen, werd de morfologie van de ERL-ingekapselde of de DOX-ingekapselde nanoliposomen waargenomen door TEM. Zoals te zien is in figuur 6a, was de diameter van de dubbele met medicijnen ingekapselde nanoliposomen minder dan 200 nm en was de vorm bijna bolvormig. De door TEM-analyse waargenomen liposoomdiameter viel samen met de waarde die werd gemeten met behulp van een deeltjesgrootte-analysator die gebruikmaakt van dynamische lichtverstrooiing. Figuur 6b toont het beeld van een enkel nanoliposoom met DOX-sulfaatcomplexen in het liposoom. Aangenomen werd dat de complexen de kristallen waren die werden gevormd door aantrekking tussen geprotoneerde DOX-kationen en tweewaardige sulfaatanionen [36]. Figuur 6c toont een TEM-beeld met hoge resolutie (HR-) dat de medicijnkristallen vertoonde in het buitenste gebied van het nanoliposoom dat aanwezig is in figuur 6b. Het beeld onthulde dat een sterk kristallijn rooster in het binnenste compartiment van het nanoliposoom en een minder kristallijn domein een amorf domein hebben dicht bij de koolstof op het rooster [37]. Het amorfe domein in het buitenste gebied van het nanoliposoom kan te wijten zijn aan instabiliteit van de lipidedubbellaag bij blootstelling aan de elektronenstraal met hoge energie. Geselecteerd gebied elektronendiffractie (SAED) patroon aanwezig in figuur 6d vertoonde een regelmatigheid van heldere diffractievlekken, wat aangeeft dat de kristallen getoond in figuur 6c een sterk geordend kristallijn rooster hebben [38]. Om de TEM-analyseresultaten van de dual-medicijn-ingekapselde nanoliposomen te vergelijken met die van de single-medicament-ingekapselde nanoliposomen, werd het ERL-ingekapselde nanoliposoom waargenomen door TEM en het beeld wordt getoond in Fig. 6e. The outermost region of the nanoliposome present in Fig. 6e was observed by HR-TEM, and the result is shown in Fig. 6f. From the result, it was found that the outermost region was composed of a number of small crystals and amorphous domains adjacent to the carbon on the grid. Figure 6g shows a SAED pattern of the crystals shown in Fig. 6f. The SAED pattern exhibited a ring made up of small spots arising from the individual crystals. Therefore, it is considered that the ERL intercalated between the lipid bilayer are present as small crystals with less ordered orientation [39]. On the other hand, as the other comparison, TEM analysis of the DOX-encapsulated nanoliposomes was carried out and the result is shown in Fig. 6h. The morphology and the diameter of the nanoliposome observed by TEM were similar to those of the dual drug-encapsulated nanoliposome. The HR-TEM image shown in Fig. 6i confirmed the crystalline lattice of the DOX-sulfate formed inside of the DOX-encapsulated liposome. The SAED pattern shown in Fig. 6j suggest that the crystals inside the liposome have a highly ordered crystalline lattice. These results verify that the diffractions of the ERL- and DOX-encapsulated nanoliposome by the electron beam were originated predominantly not by the ERL crystals in the lipid bilayer but by the DOX-sulfate crystals inside the nanoliposome. In summary, the morphology of the dual drug-encapsulated nanoliposomes and the crystals of each drug formed in the liposomes were identified by TEM, HR-TEM, and SAED analyses [40].

Transmission electron microscopy (TEM) and selected area electron diffraction (SAED) analyses of dual drug- or single drug-encapsulated nanoliposomes:ERL- and DOX-encapsulated nanoliposomes (scale bar, 200 nm) (a ), a single nanoliposome containing ERL and DOX-sulfate complexes (scale bar, 50 nm) (b ), a high resolution- (HR-) TEM image representing DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome and ERL crystals in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (c ), a SAED pattern of DOX-sulfate crystals and ERL crystals present in a nanoliposome (d ), a single nanoliposome encapsulated with ERL (scale bar, 50 nm) (e ), a HR-TEM image representing small crystals of ERL and amorphous domains in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (f ), a SAED pattern of ERL crystals present in an outermost region of the nanoliposome (g ), a single nanoliposome encapsulated with DOX (scale bar, 100 nm) (h ), a HR-TEM image representing crystalline lattices of DOX-sulfate inside the nanoliposome (sale bar, 5 nm) (i ), and a SAED pattern of DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome (j )

As a result of a physical stability study on the dual drug-encapsulated nanoliposomes, Fig. 7 shows the percent change in diameter of the nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at 4, 25, and 37 °C, respectively, as a function of the time. When incubated at 4 °C, in comparison with the initial diameter at day 0, the diameter of the nanoliposomes increased by 14.8% on day 5 and varied thereafter in a smaller extent of change in the diameter. The overall change of the diameter, however, was in a range of ± 15.0% during the stability test period. At 25 °C, the diameter of the nanoliposomes increased by 10.9% on day 5 and then decreased − 8.0% on day 19, indicating that the overall change was in a range of ± 10.0% during the test period. In addition, at 37 °C, the overall change in the diameter of the nanoliposomes was in a range of ± 6.0% during the test period, showing the smallest degree of change compared with the other test conditions. Based on the fact that in all three conditions tested, there was no significant change in the diameter of the nanoliposome, it is considered that the nanoliposomes prepared in our study have the physical stability in PBS (pH 7.4) for at least 3 weeks without aggregation or flocculation, which can affect therapeutic efficacy, targeting, and toxicity of the drug(s) encapsulated in the nanoliposomes. It has been acknowledged that the two important factors determining physical stability of nanoliposomes are T _c of phospholipid(s) and a content of cholesterol constituting the nanoliposomes [41]. The high stability of the nanoliposomes at 37 °C may be due to the low probability of phase transition of the phospholipid bilayer made up of DSPC, which has a high T _c and is utilized in general as a main lipid component in various liposome formulations. Also, a high composition ratio such as 40 wt% of cholesterol in the nanoliposomes seems to contribute to enhance the physical stability of the nanoliposomes [42]. On the other hand, nonetheless a low T _c (− 2 °C) of POPG having a double bond in its one acyl chain, a very low composition ratio such as 3 wt% of POPG had little effect on the stability of the nanoliposomes.

Stability of dual drug-encapsulated nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at different temperatures of 4, 25, and 37 °C, respectively:percent change in nanoliposome diameter relative to initial diameter as a function of incubation time

Time-Differential Drug Release

There are a number of systems that can carry two kinds of drugs with different physicochemical properties on one vehicle. The representative examples are a micelle system containing the two drugs in the same compartment of the system, a polymer matrix system composed of different compartments containing each drug, and a liposome or a polymersome system containing each drug in the core and shell of the system, respectively [43,44,45,46]. In particular, when sequential actions of the two drugs are essential to cause a synergistic effect of the drugs, the time-differential release of each drug from the dual drug-encapsulated carrier is highly important. The in vitro time-differential release of DOX and ERL from the dual drug-encapsulated nanoliposomes was investigated, and the results are shown in Fig. 8. The releases of DOX and ERL from the nanoliposomes were monitored against a test medium, PBS (pH 7.4), under continuous stirring. The released amount of DOX or ERL after designated release test period was calculated measuring the fluorescence intensity of DOX and the absorbance of ERL with the fluorescence spectrometer and the UV-Vis spectrometer, respectively.

In vitro release profiles of ERL and DOX from dual drug-encapsulated nanoliposomes:time-differential release (a ) and release rates of ERL and DOX (b ) (n  = 3, the data are presented as mean ± SEM)

As shown in Fig. 8, the ERL release was 36 ± 0.01%, while the DOX release was less than 10% until 8 h of the release test period. In particular, during this period, the release rate of ERL was much faster than that of DOX. By 48 h, 65 ± 0.07% of ERL were released from the nanoliposomes in contrast to 30 ± 0.01% release of the DOX. The release rates of ERL and DOX are shown in Fig. 8b. Until 8 h, the release rate of ERL was more than 4% per hour in contrast to less than 1% per hour of the DOX release rate. After 8 h, the release rate of ERL was slowed down. Compared with the release of ERL, DOX showed a slow release and had an almost zero-order release rate. These results suggest that during the initial period of release test, much more amounts of ERL were released from the liposomes than those of DOX and there was a time-differential release between ERL and DOX. The sequential release of the drugs was thought to be originated from the difference between the physicochemical states of each drug in the liposomes [28, 32, 47]. These results on the dual drug-encapsulated nanoliposome system can contribute to translation of in vitro synergistic effects of two kinds of drugs into the clinic through overcoming both the difference between PK properties of each drug and the difficulty in targeting the same cancer cells in proper temporal sequence.