Met mierikswortelperoxidase ingekapselde holle silica-nanosferen voor intracellulaire waarneming van reactieve zuurstofsoorten

Resultaten en discussie

Ontwerp en synthese van HSN's en HRP@HSN's

Typisch werden HSN's en HRP@HSN's gesynthetiseerd via een door ammoniak gekatalyseerd sol-gelproces gecombineerd met een water-in-olie (w/o) micro-emulsiesysteem volgens onze vorige methode [27, 28]. Schema 1 illustreert de synthese van HRP@HSN's. Volgens TEM-afbeeldingen (Fig. 1) vertoonden HSN's met en zonder ingekapselde HRP een gemiddelde diameter van 45 nm (aanvullend bestand 1:figuur S1). UA-kleuring vertoonde duidelijk een verhoogde elektronendichtheid in de HRP@HSN's, maar er werd geen kleuring waargenomen buiten de HRP@HSN's (Fig. 1b), wat aangeeft dat de HRP-enzymen met succes waren opgesloten in de binnenholte van HRP@HSN's.

Stroomschema van de synthese van met mierikswortelperoxidase ingekapselde holle silica-nanobolletjes (HRP@HSN's). APTMS, 3-aminopropyltrimethoxysilaan; TEOS, tetraethylorthosilicaat; SSN, vast silica nanodeeltje

TEM-afbeeldingen van a holle silica nanosferen (HSN's), b HSN's gekleurd met uranylacetaat, c met mierikswortelperoxidase ingekapselde HSN's (HRP@HSN's), en d HRP@HSN's gekleurd met uranylacetaat. Inzet:een vergrote weergave

De DLS-metingen en zeta-potentiaalanalyses die bij kamertemperatuur zijn uitgevoerd, worden weergegeven in tabel 1. DLS-gegevens toonden aan dat zowel HSN's als HRP@HSN's positieve zeta-potentialen gaven in water (pH ~ -6,5) met hydrodynamische diameters van 188 ± 4 en 184 ± 6 nm respectievelijk in het water. Toen de nanodeeltjes echter werden gedispergeerd in serumvrij DMEM, namen de hydrodynamische diameters toe tot 1767 ± 94 nm voor HSN's en 1598 ± 127 nm voor HRP@HSN's. Deze duiden op een kleine mate van aggregatie van HSN's, maar ze waren nog steeds goed gesuspendeerd in de media. Ondertussen impliceerden de negatieve zeta-potentialen van beide nanodeeltjes gemeten in media dat sommige ionen en biomoleculen uit het biologische milieu mogelijk zijn geadsorbeerd op de nanodeeltjesoppervlakken [30, 31]. Onder deze omstandigheden werden de positief geladen oppervlakken van nanodeeltjes bedekt met negatief geladen stoffen, die door elektrostatische interacties snel aggregatie van de nanodeeltjes veroorzaakten. Om niet-specifieke aggregatie te verminderen en de colloïdale stabiliteit van nanodeeltjes te bevorderen, werd runderserumalbumine (BSA) in de biologische media geïntroduceerd [28]. Vervolgens vertoonden de hydrodynamische diameters van HSN's en HRP@HSN's aanzienlijk verminderde hydrodynamische diameters tot respectievelijk 197 ± 43 en 195 ± 19 nm.

HRP-efficiëntie en laadcapaciteit van HRP@HSN's

Om de efficiëntie en het laadvermogen van HRP-insluiting te onderzoeken, werd met fluorescerende kleurstof (RITC) gelabelde HRP bereid (aangeduid als RITC-HRP). De fluorescentie-intensiteit van de RITC-HRP@HSN's werd gemeten door de nanodeeltjes te suspenderen in 1 M NaOH, en de hoeveelheid ingekapseld RITC-HRP werd bepaald volgens een kalibratiecurve die werd vastgesteld door de fluorescentie-intensiteit uit te zetten tegen de concentratie van natuurlijk RITC-HRP onder dezelfde voorwaarden (Aanvullend bestand 1:Afbeelding S2). Om de effecten van de enzymconcentratie op de invangefficiëntie en laadcapaciteit te bestuderen, werden drie verschillende hoeveelheden HRP (11,1, 22,2 en 33,3 nmol) in de synthese geïntroduceerd. Het is vermeldenswaard dat in dit concentratiebereik, ongeacht hoeveel enzym werd geïntroduceerd, de invangefficiëntie van enzymen voor elk van de drie gevallen ongeveer 6% was. Deze lage efficiëntie kan te wijten zijn aan het feit dat slechts een fractie van de micro-emulsiedruppels kiemde en groeide tot HSN; de meeste micro-emulsiedruppels waren niet genucleëerd en bleven in hun kleine omvang van ~ -8 nm [25]. Toekomstig werk kan nodig zijn om de laadefficiëntie te verhogen. De HRP-laadcapaciteit van HRP@HSN's nam echter geleidelijk toe tot 12,5 ± 1,2 μg HRP/mg HSN's wanneer 33,3 nmol HRP werd gebruikt (aanvullend bestand 1:tabel S1). Dit geeft aan dat de HRP-laadcapaciteit kan worden gecontroleerd door de hoeveelheid enzym die in de reactie aanwezig is.

Cytotoxiciteit en cellulaire opname van HSN's en HRP@HSN's

Om de in vitro cytotoxiciteit van HSN's en HRP@HSN's te evalueren, werd de levensvatbaarheid van de cellen onderzocht met WST-1-assays. Zoals weergegeven in Aanvullend bestand 1:Figuur S3, werd er geen significante verandering in RAW264.7-celproliferatie waargenomen na behandelingen van nanodeeltjes gedurende 2 uur of 2 uur gevolgd door nog eens 24 uur kweken. Er werd geen duidelijk effect op de cellulaire mitochondriale functie veroorzaakt door de silica-nanodeeltjes gevonden op de aangegeven tijdstippen, ongeacht de aanwezigheid of afwezigheid van HRP in HSN's.

Vervolgens werden respectievelijk FITC-geconjugeerde HSN's en HRP@HSN's bereid om het concentratie-effect van nanodeeltjes op RAW264.7-labeling te onderzoeken. Flowcytometrische resultaten (aanvullend bestand 1:figuur S4) toonden aan dat RAW264.7-cellen met succes werden gelabeld met FITC-HSN's en HRP@FITC-HSN's in verschillende concentraties gedurende 2 uur in serumvrije media. In beide gevallen werden dosisafhankelijke verhogingen van de labelingsefficiëntie gevonden en meer dan 80% van de RAW264.7-cellen werd gelabeld door blootstelling aan nanodeeltjes in een concentratie van>  50 g/ml gedurende 2 uur. Eigenschappen zoals zeer efficiënte intracellulaire labeling met een korte incubatietijd, een relatief lage dosis nanodeeltjes en niet-cytotoxiciteit maken HRP@HSN's geschikt voor intracellulaire detectie van ROS.

Reactiviteit van HRP@HSN's op verschillende ROS

Volgens HRP-enzymactiviteitstest met gebruik van TMB als substraat, bleef ongeveer 40% van de initiële enzymactiviteit over na daaropvolgende inkapseling van HRP in HSN's. Deze afname van de waargenomen specifieke activiteit van het ingekapselde enzym (mol substraat omgezet per eenheid enzym per tijdseenheid) zou het gevolg kunnen zijn van beperkingen in de massaoverdracht, die optreden wanneer substraten de silica-schaal naar de HRP kruisen [32]. Desalniettemin biedt de inkapselingsstrategie extra functies, bijvoorbeeld de poreuze silicaschil kan HRP beschermen tegen proteolyse terwijl het transport van kleine moleculen van reactanten en producten mogelijk maakt [26, 27]. Alles bij elkaar genomen zou de waargenomen reactiviteit van HRP@HSN's op ROS, geëvalueerd door het inbouwen van een fluorescerende probe (DHR123), het resultaat kunnen zijn van een combinatie van de affiniteit van de nanodeeltjes en de intrinsieke eigenschap van HRP voor ROS.

Celvrije systemen werden gebruikt om een ​​verscheidenheid aan biologisch relevante ROS te genereren, waaronder waterstofperoxide (H₂ O₂ ), TBHP, hydroxylradicalen (•OH), tert-butoxyradicalen (•OtBu) en superoxide (O₂ • ⁻ ). Eerst werd DHR123 geïncubeerd met een panel van ROS in de afwezigheid en aanwezigheid van HRP of HRP@HSN's, gevolgd door het meten van de fluorescentie-intensiteit van het product rhodamine 123 (R123). Zoals weergegeven in Fig. 2, ongeacht welk type ROS werd gebruikt, werd de fluorescentie-intensiteit op een tijdafhankelijke manier gemeten (30, 60, 90 en 120 min). Schijnbare verschillen in intensiteit tussen verschillende ROS hangen echter af van de intrinsieke eigenschappen van DHR123. Aan de ene kant, in overeenstemming met een eerdere studie [33], laat figuur 2a zien dat noch H₂ O₂ noch O₂ • ⁻ zou DHR123 kunnen oxideren tot R123. Bovendien vertoonde DHR123 een hogere reactiviteit voor •OtBu- en •OH-radicalen ten opzichte van andere ROS. Met de katalytische activiteit van HRP werden opmerkelijke verhogingen van de fluorescentie-intensiteit waargenomen in de aanwezigheid van natuurlijke HRP en HRP@HSN's zoals getoond in Fig. 2b, c. Er werd opgemerkt dat de hogere fluorescentie-intensiteit die werd gevonden in het geval van natieve HRP in vergelijking met HRP@HSN's op dezelfde reactietijd positief gecorreleerd was met hun waargenomen enzymactiviteiten.

een –c Tijdsafhankelijke fluorescentie-intensiteit van de reactie van geselecteerde reactieve zuurstofspecies (ROS) met a dihydrorhodamine 123 (DHR123), b DHR123 + mierikswortelperoxidase (HRP), en c In DHR123+-mierikswortelperoxidase ingekapselde HSN's (HRP@HSN's). d Verbeterde intensiteitsverhouding van de reactie van geselecteerde ROS met DHR123 + HRP en DHR123 + HRP@HSN's na 1 uur. De getoonde gegevens zijn voor 20 M DHR123, 400 ng/mL HRP, 50 μg/mL HRP@HSN's en 100 μM ROS. (*p < 0,05 versus de controlegroep op overeenkomstige tijdstippen)

Om een ​​directe vergelijking tussen verschillende ROS mogelijk te maken, werden gegevens met een tijdsinterval van 60 minuten geselecteerd en gerapporteerd als relatieve fluorescentie-intensiteit genormaliseerd naar de controle (aanvullend bestand 1:figuur S5). Daaropvolgende analyse van de verbeterde intensiteitsverhouding werd getoond door de relatieve fluorescentie-intensiteit van DHR123 + HRP of DHR123 + HRP@HSN's te delen door DHR123 (Fig. 2d). In beide HRP-bevattende gevallen, een vergelijkbare trend van de verbeterde intensiteitsverhouding over verschillende ROS en een significante toename van de reactiviteit van DHR123 op H₂ O₂ en O₂ • ⁻ werden waargenomen, wat aantoont dat het ingekapselde HRP een hoge mate van intrinsieke enzymactiviteit gaf, en dat de silica-omhulsels van HRP@HSN's transport van kleine moleculen mogelijk maakten om selectieve biokatalyse uit te voeren.

Intracellulaire ROS-detectie met HRP@HSN's

Om de ROS-detectiefunctionaliteit van HRP@HSN's in cellen te beoordelen, werden RAW264.7-macrofagen 2 uur geïncubeerd met HRP@HSN's, gevolgd door wassen en vervolgens 30 minuten incuberen met DHR123 (20 μM). Vervolgens werden de cellen gewassen en nog 1 uur behandeld met PMA (1 μg / ml). Het is bekend dat het stimuleren van macrofagen met PMA resulteert in de productie van superoxide, dat wordt omgezet in waterstofperoxide door superoxide-dismutase of door spontane dismutatie [34,35,36]. PMA kan dus fungeren als een stimulerend middel om H₂ . te genereren O₂ in RAW264.7 macrofagen om de intracellulaire H₂ . te evalueren O₂ - detectievermogen van HRP@HSN's. Zoals getoond in Fig. 3a, vertoonden beide gevallen van RAW264.7-macrofagen die alleen waren gekweekt en gekweekt met HSN's een zwakke fluorescentie in de flowcytometrische analyse, wat aangeeft dat niet-gestimuleerde cellen een zwak basaal ROS-niveau produceerden, waar geen significante ROS werden geïnduceerd in de aanwezigheid van HSN's. Bovendien vertoonden cellen die waren behandeld met HRP@HSN's een significante toename van de intensiteit (Fig. 3a), wat suggereert dat de afgeleverde HRP@HSN's extra katalytische activiteit in cellen gaven.

een Flowcytometrie-analyses van RAW264.7-macrofagen gestimuleerd met en zonder forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) in aan- en afwezigheid van nanodeeltjes. b PMA en c mierikswortelperoxidase-ingekapselde HSN's (HRP@HSN's) concentratie veranderde afhankelijk van de fluorescentie van RAW264.7-macrofagen. d De representatieve fluorescentiebeelden van RAW264.7-macrofagen onder de aangegeven omstandigheden. Schaalbalken 50 μm

Voor stimulatie-experimenten genereerden met PMA behandelde cellen typisch meer dan twee keer hogere niveaus van R123-fluorescentie in vergelijking met niet-gestimuleerde cellen. Bovendien hadden cellen die waren behandeld met HRP@HSN's het hoogste niveau van fluorescentie, gevolgd door HSN's en vervolgens cellen alleen. Er werd opgemerkt dat het behandelen van de gestimuleerde RAW264.7-macrofagen met HSN's resulteerde in een kleine toename van de fluorescentie-intensiteit in vergelijking met die van de controle. Dit resultaat suggereerde dat cellulaire stressreacties extreem snel worden geactiveerd en gevoelig zijn voor externe stimuli, waaronder blootstelling aan nanodeeltjes [37]. Bovendien induceerden zowel PMA (0,1, 0,25, 0,5, 1 en 2 g/ml) als HRP@HSN's (50, 100 en 200 μg/ml) de expressie van R123 op een dosisafhankelijke manier, zoals blijkt uit Fig. . 3b, ca.

In overeenstemming met de flowcytometrische analyse, toont Fig. 3d de representatieve fluorescentiebeelden van RAW264.7-macrofagen gestimuleerd met en zonder PMA in de aanwezigheid en afwezigheid van nanodeeltjes. Het systeem was in staat endogene H₂ . te visualiseren O₂ generatie in RAW264.7-cellen, en de zwakste fluorescentie-intensiteit werd waargenomen in cellen die waren behandeld met HRP@HSN's gevolgd door PMA-stimulatie. Zoals getoond in Fig. 4a, is de cellevensvatbaarheid van RAW264.7-macrofagen in aanwezigheid van het stimulerende PMA of exogene H₂ O₂ werd onderzocht met WST-1-assays. Terwijl ROS betrokken zijn bij apoptose [38], werd op het aangegeven tijdstip slechts een klein effect op de levensvatbaarheid van de cellen gevonden, waardoor de volgende semi-kwantitatieve analyse praktisch en zinvol is.

een WST-1-assay van RAW 264.7-macrofagen na behandelingen van exogeen H₂ O₂ of stimulatie met forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) gedurende 1 uur. b Detectie van de concentratie van H₂ O₂ endogeen geproduceerd door RAW264.7-macrofagen onder verschillende concentraties van het PMA-stimulant in aanwezigheid van met mierikswortelperoxidase ingekapselde holle silica-nanobolletjes (HRP@HSN's) en dihydrorhodamine 123 (DHR123). Inzet:een kalibratiecurve verkregen uit de externe standaarden van H₂ O₂ gemengd met HRP@HSN's en DHR123

Application of HRP@HSNs In Vitro for Quantitative Analysis of H₂ O₂

To evaluate the capacity of HRP@HSNs for quantifying endogenous hydrogen peroxide produced in PMA-stimulated RAW264.7 cells, a calibration curve from the exogenous H₂ O₂ experiment, with a detection range of 0.625~15 μM, was established by microplate measurements (Fig. 4b, inset). The standard calibration curve appears to be linear as expected. Then, RAW264.7 cells were treated with 100 μg/mL of HRP@HSNs for 2 h, followed by co-incubation with various concentrations of PMA and 20 μM of DHR123 at 37 °C for 1 h. After that, the concentration of H₂ O₂ endogenously produced by PMA-stimulated RAW264.7 cells was determined by measuring the fluorescence intensity, followed by conversion using the established calibration curve. Notably, because most of the HRP@HSNs were uptaken within the cells, the H₂ O₂ -triggered fluorescence of R123 could be attributed to intracellular enzyme-catalyzed reactions rather than the extracellular contribution. Although H₂ O₂ is able to diffuse across biomembranes, due to its limited diffusion and rapid enzymatic consumption inside cells, concentration gradients of H₂ O₂ are formed across membranes [39, 40]. Typically, under normal physiological conditions, H₂ O₂ has an extracellular concentration estimated at 10 ^− 7 ~10 ^− 6  M, which is about 10-fold higher than that observed in intracellular fluid [1, 41, 42]. In pathological conditions, extracellular concentrations of H₂ O₂ are in the range of 10~50 μM and are additionally elevated to as high as 10 ^− 4  M in apoptosis [1]. As shown in Fig. 4b and Additional file 1:Table S2, endogenous hydrogen peroxide caused by PMA-stimulated RAW264.7 cells was created in a dose-dependent manner and produced at levels of about 10 μM when the concentration of PMA used exceeded 0.25 μg/mL. Taken together, these results indicate that HRP@HSNs were capable of detecting semi-quantitatively endogenous the concentration of hydrogen peroxide of RAW264.7 macrophages under oxidative stress conditions.