Gouden nanobiosensor gebaseerd op de gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie kan menselijke brucellose diagnosticeren, wat een snelle en betaalbare methode introduceert

Methoden

Bacteriële cultuur en LPS-extractie

De gladde stammen van B. melitensis en B. abortus werden gekweekt in Luria–Bertani [3] agar. In de volgende stap werden bacteriën geoogst en werd LPS geëxtraheerd met behulp van een gemodificeerde methode met heet fenolwater [25]. Om de kwaliteit van geëxtraheerde LPS te bevestigen, werd natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, VS) met zilvernitraatkleuring toegepast. LPS-kwantificering werd uitgevoerd met behulp van 1,9-dimethylmethyleenblauw (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, VS) met behulp van Salmonella typhimurium als standaard. Om de eiwit- en nucleïnezuurcontaminatie te beoordelen, werden de Bradford-methode en absorptie bij 260 nm gebruikt.

Synthese van sferische gouden nanodeeltjes

Een chemische reductie van goudzout (HAuCl₄ ) werd gebruikt om de gouden nanodeeltjes te synthetiseren, wat een snelle, goedkope en groene syntheseprocedure is voor Au-nanodeeltjes bij kamertemperatuur [26]. Volgens de beschreven methode werd 15 mg natriumcitraat (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, VS) opgelost in 50 ml gedestilleerd gedeïoniseerd water en in een ijsbad gehouden en gemengd op een magnetische roerder (150 RPM) . Tegelijkertijd werd 600 µl goudzoutoplossing (17,3 mM) toegevoegd. Vervolgens werd 1,2 ml natriumboorhydride-oplossing (20 mM) toegevoegd. De oplossing werd gedurende 2 uur onder vergelijkbare omstandigheden gemengd en vervolgens bij 4 ° C bewaard voor latere toepassing. Volgens eerdere studies werkt natriumcitraat bij dit type synthese tegelijkertijd als een reductiemiddel (dat de reductie van AuIII tot Au0 stimuleert), afdekmiddel (elektrostatisch stabiliseert de colloïdale oplossing van gouden nanodeeltjes) en pH-mediator (modificatie van de reactiviteit van Au soorten die bij de reactie betrokken zijn). In deze test toont de productie van een roodgekleurde oplossing van een geelgekleurde oplossing van HAuCl4 de vorming van goud in een oxidatievrije toestand.

Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) werd gebruikt om de morfologie van gouden nanodeeltjes te bestuderen, en Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, VK) werd gebruikt om de grootteverdeling te beoordelen. Dynamische lichtverstrooiing (DLS), bij een verstrooiingshoek van 90º, werd gebruikt als basisprincipe voor het meten van de deeltjesgrootte. Zetasizer Nano gebruikte een laser met een golflengte van 633-nm. Met deze techniek wordt de verspreiding van deeltjes veroorzaakt door Brownse beweging gemeten en omgezet in grootteverdeling door de Stokes-Einstein-relatie [27]. Zeta-potentiaal werd ook toegepast om de elektrische oppervlaktelading van nanodeeltjes te bepalen. De absorptiespectra van nanodeeltjes werden geregistreerd door een Cary 500 UVeviseNIR (ultraviolet-zichtbaar nabij-infrarood) spectrofotometer (Varian, Australië).

Bouw van nanosonde (biosensor)

Carboxylering van gouden nanodeeltjes

Gouden nanodeeltjes werden gecoat met thioglycolzuurlinkers voor het voorbereiden van het oppervlak van BNP's voor het laden van LPS. Kortom, 1 ml TGA-oplossing (1 mM) werd gemengd met 1 ml gouden nanodeeltjesoplossing en 24 uur op kamertemperatuur gehouden. Voor isolatie van gecoate gouden nanodeeltjes werd de oplossing 15 minuten bij 12.000 g gecentrifugeerd. Daarna werden twee wasstappen met dubbel gedestilleerd gedeïoniseerd water gebruikt om overmaat TGA te verwijderen. Ten slotte werd spectrofotometrie gebruikt om de coating van thioglycolzuur op het oppervlak van de BNP's te beoordelen.

Het optimaliseren van de coating van thioglycolzuur op gouden nanodeeltjes

De coating van TGA werd op verschillende tijdstippen uitgevoerd, waaronder 12, 18, 24, 36 en 48 uur om de coatingverhouding van TGA op gouden nanodeeltjes te optimaliseren. Vervolgens werd de optische dichtheid gemeten en grafisch weergegeven om de beste incubatietijd te verkrijgen.

Covalente hechting van LPS aan TGA-gemodificeerde gouden nanodeeltjes

Om de covalente hechting tussen de carboxylgroep van TGA en de aminegroep van LPS te stimuleren, werden de carboxylgroepen geactiveerd door EDC (de meest populaire nul-lengte crosslinker voor biochemische conjugaties) en N-hydroxysuccinimide (NHS) moleculen [28]. Gesedimenteerde gouden nanodeeltjes werden gesuspendeerd in 0,1 mM EDC/NHS-oplossing en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. In de volgende stap werd 2 ml fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) met 0,05% Tween-20 (PBST) (pH 7,4) toegevoegd. Na een krachtige vortex werden nanodeeltjes gedurende 15 minuten bij 12.000 tpm gecentrifugeerd. Na centrifugeren werd de LPS-oplossing toegevoegd na verwijdering van het supernatant. Vervolgens werd het mengsel gedurende 10 minuten in een ultrasoonbad geïncubeerd, gevolgd door 3 uur incubatie bij kamertemperatuur. Daarna werd 2 ml PBST toegevoegd en krachtig gevortext, gevolgd door 15 minuten centrifugeren bij 12.000 tpm, en het supernatant werd verwijderd. Ten slotte werden nanosondes vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 500 µl PBS en werden LSPR-spectra gemeten met een spectrofotometer. Na de bevestiging van LPS-hechting aan de gouden nanodeeltjes, werd de oplossing voor verder onderzoek op 4 ° C gehouden. Afbeelding 1 toont de chemische interactievergelijkingen, de TGA-gemodificeerde synthese van gouden nanodeeltjes en LPS-aanhechting.

Chemische interacties van LPS-hechting aan de gouden nanodeeltjes. A TGA-molecuul, B EDC + NHS-interactie, en C Covalente hechting van LPS aan TGA-gemodificeerde gouden nanodeeltjes. Nummer 1:nanodeeltjes; nummer 2:LPS

De LPS-concentratie optimaliseren

Om de binding van LPS aan geactiveerde TGA-carboxylgroepen te maximaliseren, werd de LPS-tot-Au-nanodeeltjesverhouding geoptimaliseerd door de piekverschuiving in LSPR-spectra te evalueren als een functie van LPS-concentraties (100, 150, 200, 300 en 560 µg /ml) in een vaste hoeveelheid van de Au-nanodeeltjes.

Detectie van anti-LPS-antilichamen door nanoprobe

100 µl van de verdunde monsters (1:50 in PBS) werd gemengd met 200 µl van de biosensor en gemengd door pipetteren. In de volgende stap werden de biosensoren 15 minuten gecentrifugeerd bij 12.000 g na 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur. Ten slotte werden de biosensoren gesuspendeerd in 200 µl PBS en werd de absorptie gemeten zoals eerder beschreven. Om de functie van de nanobiosensor te valideren, werden ook positieve en negatieve controles geleverd uit een in de handel verkrijgbare ELISA-kit (Pishtazteb Zaman, Iran).

Ethische verklaring

Het gebruik van menselijke sera is goedgekeurd door de ethische commissies van Fasa University of Medical Sciences Fasa, Iran (IR.FUMS.1396.324). Identiteiten van seradonoren werden gecodeerd en aan niemand die bij deze studie betrokken was, onthuld. Bovendien werden alle procedures uitgevoerd onder ethische richtlijnen volgens de nationale voorschriften. Bovendien waren alle monsters afkomstig van proefpersonen die de schriftelijke geïnformeerde toestemming hadden ondertekend.

Evaluatie van de functie van de ontworpen methode

Veertig monsters met 20 gevallen (echte positieven) en 20 controles (echte negatieven) werden verstrekt om de functionaliteit van de ontworpen methode te evalueren. Om deze reden werden de prestaties van de ontworpen methode in de huidige studie vergeleken met de kweekresultaten. Bovendien werden beschikbare commerciële kits (Pishtaz Teb, Teheran, Iran) gebruikt om de serumniveaus van IgM- en IgG-antilichamen te beoordelen. De monstervoorbereiding en de evaluatie van de antilichamen werden uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant (specificiteit:99,85%, gevoeligheid:99,4%). Bovendien werd de standaard buisagglutinatietest uitgevoerd op alle seramonsters om de prestatie van de op LSPR gebaseerde methode te vergelijken en te valideren. Om de prestaties van de ontworpen methode te evalueren, werden de verkregen resultaten van de op LSPR gebaseerde methode vergeleken met de genoemde conventionele tests met de berekening van de gevoeligheid, specificiteit, positief voorspellende waarde en negatief voorspellende waarde op basis van de algemene formule als volgt:

Statistische analyse

Deze studie werd geanalyseerd als een klassiek diagnostisch prestatie-experiment door de overeenstemming van een voorgestelde test, de LSPR-nanosensor, en een referentiestandaardtest, de kweek en enkele conventionele tests, waaronder ELISA en SAT, te evalueren om hun vermogen om een ​​doelconditie te identificeren te bepalen. . Afkapwaarden werden berekend door het gemiddelde van de controlesera (echt negatief) plus tweevoudige standaarddeviatiewaarden (2SD). De Kolmogorov-Smirnov-test werd uitgevoerd om de normaliteit te bepalen en de gegevensdistributie te evalueren. Op basis van de normaliteitsresultaten, die de parametrische verdeling aan het licht brachten, werd de ANOVA-test gebruikt om groepen te vergelijken. Alle statistische analyses zijn uitgevoerd met GraphPad Prism voor Windows versie 8 en SPSS voor Windows versie 9.

Resultaten

Analyse van extractie van lipopolysachariden

SDS-PAGE toonde aan dat de opbrengst van LPS-extractie ongeveer 1 procent was van het natte gewicht van de gebruikte bacteriën. Bovendien was de concentratie van nucleïnezuur  ≤ 0,2% van de LPS-concentratie. Belangrijk is dat de Bradford-methode de afwezigheid van eiwitverontreinigingen aantoonde.

Karakterisering van gouden nanodeeltjes

De grootteverdeling van de nanodeeltjes bepaalt de kwaliteit van een biosensor. Volgens de eerdere studies moeten nanodeeltjes een bepaalde grootte hebben. In dit opzicht resulteert de geschikte kleine omvang van de nanodeeltjes in geschikte colloïdale stabiliteit, hoge oppervlakte-tot-volumeverhoudingen en snelle beweging voor hoge bindingssnelheden resulteert in hoge affiniteit, hoge gevoeligheid en hoge selectiviteit in interactie met biologische doelen. Verder moeten de nanodeeltjes zo groot mogelijk zijn om de aanwezigheid van verschillende liganden op het oppervlak van het deeltje mogelijk te maken en ook om multivalente interacties te verkrijgen [29,30,31]. Zoals Gu et al. gerapporteerd, is de vergelijkbaarheid van de grootte van nanodeeltjes met de grootte van biologische doelen bijzonder belangrijk bij de interactie van eiwitten [32]. Volgens de grootte van anti-Brucella-antilichamen, die 2-5 nm [33] is, bereidde deze studie gouden nanodeeltjes met een gemiddelde grootte van 10 nm en voerde de bepaling van de grootteverdeling van nanodeeltjes uit door een Zetasizer NanoZS90-instrument, dat gebruik maakt van een laser met een golflengte van 633-nm. Deze techniek profiteert van de Stokes-Einstein-vergelijking die de diffusie van deeltjes, veroorzaakt door Brownse beweging, kan omzetten in een grootteverdeling. Volgens figuur 2 waren de BNP's uniform verdeeld op een schaal van 10 nm. Zeta-potentiële waarden onthulden details over de oppervlaktelading en stabiliteit van de BNP's. De deeltjes waren negatief geladen en hun zeta-potentiaal was ongeveer -28 mV. Verder toont tabel 1 de maximale absorptiegolflengte van BNP's. Visuele en ultraviolette golflengten werden gemeten met een spectrofotometer en de maximale absorptie was 530 nm. We gebruikten de Turkevich-methode om gouden nanodeeltjes te produceren. De voordelen van deze methode zijn de productie van gouden nanodeeltjes, waaronder een eenvoudig en goedkoop productieproces, het vermogen om de grootte van nanodeeltjes te regelen en een goede colloïdale stabiliteit [34].

Structuur van gouden nanodeeltjes onder SEM. De gelijke verdeling van gouden nanodeeltjes wordt goed weergegeven in de figuur

Karakterisatie van de Nano-bio-Probe

Zoals hierboven vermeld, gebruikte deze studie TGA-moleculen om de gouden nanodeeltjes te verbinden met LPS, wat resulteerde in een lichte afname van 4,55% van de LSPR-piek bij 530 nm. Bovendien heeft de huidige studie verschillende incubatietijden uitgevoerd om de maximale TGA-trouw aan de gouden nanodeeltjes te bepalen. Volgens de resultaten getoond in Fig. 3 resulteerde 24 uur TGA-incubatie met BNP's in de maximale TGA-coating op het oppervlak van de gouden nanodeeltjes.

Optimalisatie van de coating van thioglycolzuur op gouden nanodeeltjes. Zoals de figuur laat zien, is er geen significante verandering in absorptie na 24 uur incubatie, ondanks de verlenging van de aangrenzende tijd. Daarom werd 24 uur geselecteerd als de geoptimaliseerde tijd voor het coaten van thioglycolzuur op BNP's. De J -as toont de absorptie-intensiteit bij 530 nm (maximale absorptie van nanodeeltjes). De experimenten werden in drievoud uitgevoerd. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde   ±  SEM. a.u.:Absorptie-eenheid

Met betrekking tot de bepaling van de geoptimaliseerde concentratie van LPS, onderzocht de huidige studie concentraties van 100, 150, 200, 300 en 560 ug/ml. Zoals weergegeven in figuur 4, neemt de absorptie af naarmate de concentratie was toegenomen. Volgens de resultaten selecteerde de huidige studie een concentratie van 300 ug/ml LPS om het oppervlak van TGA-gemodificeerde BNP's te coaten, omdat er geen noemenswaardige afname was in de intensiteit van de absorptiepiek door de LPS-concentratie te verhogen.

Optimalisatie van de LPS-concentratie. Naarmate de concentratie van LPS toenam, nam de absorptie aanzienlijk af. Bij de toename van de LPS-concentraties van meer dan 300 mg/ml was er echter geen significante vermindering van de LSPR-absorptie. Daarom werd de genoemde concentratie gekozen als de geoptimaliseerde concentratie. De J -as toont de absorptie-intensiteit bij 530 nm (maximale absorptie van nanodeeltjes). De experimenten werden in drievoud uitgevoerd. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde   ±  SEM. a.u.:Absorptie-eenheid

Beoordeling van de Nano-bio-Probe-functies

Aangezien de LSPR-techniek een oppervlaktegevoelige optische methode is, kan deze de interactie tussen anti-LPS-antilichamen en antigenen in het oppervlak van de gouden nanodeeltjes detecteren door middel van het beeld van veranderingen in de LSPR-absorptiepiek die wordt veroorzaakt door elektrostatische interactie tussen antilichaam en antigeen. Om de correcte werking van de biosensor te bevestigen, bereidde deze studie een positieve controle voor bestaande uit anti-Brucella LPS-antilichamen met een titer van 1:80 en negatieve controle, en registreerde het LSPR-spectrum van de biosensor na incubatie met de controles. Zoals weergegeven in figuur 5, had incubatie met negatieve controle geen invloed op de absorptie van LSPR. Incubatie met positieve controle veroorzaakte echter een verschuiving in de maximale absorptie van LSPR, die voorheen bekend stond als roodverschuiving. Daarom beperkt de binding van anti-Brucella-antilichamen aan de LPS-antigenen de incidentie van licht op het oppervlak van nanosondes.

Piek van LSPR-nanoprobe in aanwezigheid van positieve en negatieve controles. Controles werden geleverd uit in de handel verkrijgbare ELISA-kits

Afkapwaarde bepalen

Voor dit doel verkreeg deze studie 40 sera van echt positieve en negatieve proefpersonen op basis van de kweek en klinische observaties. Zoals weergegeven in Fig. 6, was het roodverschuivingsgemiddelde in echt negatieve monsters (controles) 1,70 nm, wat significant verschilde van echt positieve patiënten (P waarde < 0,001). Bovendien gaven de resultaten aan dat de roodverschuiving van 4,38 nm als grenswaarde moet worden gebruikt. Interessant genoeg had slechts 5% van de controles een roodverschuiving boven de grenswaarde, en de roodverschuiving bij alle patiënten was boven de grenswaarde, wat aangeeft dat de prestatie van de methode acceptabel is en dat de bepaling van de grenswaarde betrouwbaar is.

LSPR piek roodverschuiving in de sera van echte patiënten en controlepersonen. Bij de interactie tussen antilichamen, die aanwezig waren in de sera van geïnfecteerde individuen, vond een roodverschuiving plaats die significant anders was in vergelijking met controles. Verder toont de figuur de SD- en 2SD-waarden die waardevol zijn voor de definitie van het afkappunt. De experimenten werden voor elk monster in drievoud uitgevoerd. P waarde < 0,05 werd als significant beschouwd

Validatie van biosensorfunctie

In de vorige stappen introduceerde deze studie een snelle en goedkope methode om anti-Brucella-antilichamen in de monsters te identificeren. Het verifiëren van de functionaliteit van een nieuwe methode is echter noodzakelijk. Voor dit doel voerde deze studie een reeks deelonderzoeken uit, waaronder standaardbuisagglutinatietest, anti-IgG- en anti-IgM-niveaus in de sera van negatieve en positieve monsters op basis van de kweekresultaten. Zoals weergegeven in Tabel 2, was de gevoeligheid van de huidige methode minder dan die van SAT alleen. Belangrijk is dat de specificiteit van de op LSPR gebaseerde methode het meest acceptabele resultaat liet zien, namelijk 100%. Net als bij specificiteit was de positief voorspellende waarde van de huidige methode hoger dan die van andere conventionele tests (100%). Uiteindelijk was de NPV van op SAT, IgG, IgM en LSPR gebaseerde methoden respectievelijk 90%, 90%, 81% en 86%.

Discussie

Brucellose wordt waarschijnlijk beschouwd als de eerste menselijke infectie na de domesticatie van runderen, schapen en geiten [35]. Brucellose is 's werelds meest voorkomende bacteriële zoönose met 500.000 nieuwe menselijke gevallen van de ziekte die jaarlijks wereldwijd worden gediagnosticeerd [9, 36]. De symptomen van humane brucellose zijn niet pathognomonisch omdat de infectie elk orgaan van het lichaam kan aantasten [37]. Hoewel de laboratoriumbevindingen nog steeds een betrouwbare factor zijn bij het opsporen van ziekten, hebben de huidige strategieën, waaronder testen op kweek, serologie en nucleïnezuuramplificatie, ernstige gebreken aangetoond [9, 38,39,40]. Daarom probeert deze studie een nieuwe diagnostische methode te introduceren op basis van LSPR om de beperkingen op te heffen.

In de afgelopen jaren is de gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie gebruikt als basis voor de ontwikkeling van biosensoren. De voordelen van het huidige onderzoek naar gouden nanodeeltjes en de vooruitgang in nanotechnologie worden beschouwd als de belangrijkste factoren om de diagnostische prestaties te verbeteren. De unieke kleur en optische eigenschappen van BNP's, vanwege hun plasmonische en aanpasbare effecten, zijn twee uitstekende en gunstige eigenschappen van deze deeltjes in vergelijking met andere deeltjes [12, 41].

In deze studie werd een roodverschuiving in de LSPR-piek gebruikt als een indicator van interactie tussen LPS-antigenen en anti-Brucella-antilichamen. Met andere woorden, in vergelijking met de controlemonsters veroorzaakte de aanwezigheid van antilichamen in het serum van de casusmonsters een significante roodverschuiving van de LSPR-absorptiepiek, waarvan kan worden aangenomen dat het een indicator is van brucellose. Hoewel er een significant verschil is in roodverschuiving tussen controle- en casusmonsters, kan dit verschil de concentratie van antilichamen in het serum niet kwantificeren, wat kan worden beschouwd als een van de ernstige beperkingen van deze methode. We moeten echter niet vergeten dat sommige veelgebruikte methoden, zoals ELISA-gerelateerde strategieën, meestal als een afkappunt worden beschouwd [42, 43].

Belangrijk is dat deze studie de prestaties van de op LSPR gebaseerde techniek valideerde door de verkregen resultaten te vergelijken met andere huidige methoden door verschillende parameters te evalueren. De eerste geanalyseerde parameter was gevoeligheid die de waarschijnlijkheid van een positieve brucellosetest bij een patiënt bepaalt [44]. Zoals Yagupsky et al. had besproken [9], is de gevoeligheid van bloedkweek, die wordt beschouwd als de huidige gouden standaard, verminderd, vooral bij chronische ziekten en focale infecties. Bovendien had deze methode ook te maken met andere ernstige beperkingen, zoals laboratoriumveiligheidsproblemen, de langzame groei van bacteriën, en een positief resultaat is onbetwistbaar bewijs van de ziekte [45, 46]. Deze op LSPR gebaseerde techniek vertegenwoordigde een betrouwbaar en competitief resultaat in vergelijking met de conventionele methoden voor gevoeligheid, zoals kweek-, SAT- en ELISA-afhankelijke kits. Tegelijkertijd werd de specificiteit geëvalueerd, dat wil zeggen de kans op een negatieve test als de patiënt niet geïnfecteerd is [45, 47]. As results showed, compared to the other diagnostic strategy, the designed LSPR-based technique had the most significant outcome in terms of specificity. It is an important characteristic of this method because the previous studies had questioned the validity and specificity of serodiagnostic methods of human brucellosis since asymptomatic and self-limiting episodes of this infection occur in zoonosis endemicity areas [48,49,50]. However, like antibody-related methods, the current method resists the possible long-term persistence of anti-Brucella antibodies within the serum, even after complete recovery from brucellosis.

Similar to previous studies, positive predictive value was defined as the ratio of the true positive results to the sum of all positive results [51]. Similarly, the NPV was described as the ratio of the true negative results to the sum of all negative results [51]. Compared to conventional diagnostic strategies, the current designed method represented the most wonderful PPV outcomes, demonstrating its ability to distinguish between infected and non-infected individuals. In addition, the evaluation of the NPV results revealed the promising potential of the LSPR-based method to exclude non-patients from real patients.

Conclusion

This study introduced a rapid, simple, low cost, reliable, and economical method for diagnosing brucellosis. Although there are some minor limitations, including the qualitative outcomes and the possibility of being positive in recovered individuals, the advantages discussed show that it has good capabilities compared to the current laboratory-based diagnostic procedures.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

De datasets die tijdens het huidige onderzoek zijn gebruikt en/of geanalyseerd, zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de corresponderende auteur.

Afkortingen

LPS:

Lipopolysaccharides

GNPs:

Gold nanoparticles

DLS:

Dynamic light scattering

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

SAT:

Standard tube agglutination test

ELISA:

Enzyme-linked immunosorbent assay

PPV:

Positive predictive value

NPV:

Negative predictive value

PSPR:

Propagating surface plasmon resonance

SDS-PAGE:

Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis

SEM:

Scanning electron microscopy

TGA:

Thioglycolic acid

NHS:

N-hydroxysuccinimide

EDC:

N -(3-dimethylaminopropyl)-N ′-ethylcarbodiimide hydrochloride

PBS:

Phosphate buffer saline