Synthese van SPIO-nanodeeltjes en de daaropvolgende toepassingen in stamcellabeling voor de ziekte van Parkinson

Materialen en methode

Materialen

IJzeracetylacetonaat, TREG (triethyleenglycol), diethyleenglycol en PEG werden gekocht bij Aladdin Industrial Corporation (shanghai, China). Methylthiazolyldifenyl-tetrazoliumbromide (MTT) werd gekocht bij Sigma-Aldrich Corporation (Shanghai, China). Dulbecco's gemodificeerd adelaarsmedium (DMEM), trypsine-EDTA (0,25%) en foetaal runderserum (FBS) werden gekocht bij Thermo Fisher Scientific. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide-hydrochloride en N-Hydroxysuccinimide werden gekocht bij Sigma-Aldrich (China). N, N-dimethylformamide, ethylalcohol absoluut en ethylacetaat werden gekocht bij Sinopharm Chemical Reagent Corporation. Ultrapuur water werd geproduceerd door Millipore pure en ultrapuur waterzuiveringssystemen. Anti-humaan CD90-FITC, anti-humaan CD45-PE, anti-humaan CD34-FITC en anti-humaan CD105-PE werden gekocht bij Biolegend.

Synthese van USPIO

De USPIO werd gesynthetiseerd door de polyolmethode als eerder onderzoek [18,19,20,21]. De experimentstappen zijn als volgt:ijzeracetylacetonaat 1 mmol en TREG 25 ml werden gemengd in een driehalskolf, die was aangesloten op argon, een bolvormige condensatiebuis en een thermometer. Na 15 minuten geïncubeerd te zijn met argonstroom, werd het mengsel verwarmd tot 120 ℃ (verwarmingssnelheid is 3 ° C / min) en gedurende 1 uur gehandhaafd, en vervolgens werd het mengsel verder verwarmd tot 250 ° C met dezelfde verwarmingssnelheid en gehandhaafd gedurende 30 min. Het reactiemengsel werd natuurlijk afgekoeld tot kamertemperatuur, verdund met 2 ml absolute ethylalcohol, gevolgd door precipitatie met ethylacetaat. Het sediment werd verzameld door 20 minuten te centrifugeren bij 8000 rpm en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in absolute ethylalcohol. De USPIO werd bewaard in absolute ethylalcohol bij 4 ° C voor verder gebruik.

Voorbereiding van PAA/PEG-gecoate USPIO

De USPIO-PAA is verworven volgens een eerder rapport [22]. In detail werd polyacrylzuur (PAA) 1,5 g opgelost in 24 ml diethyleenglycol. Na een argonstroom van 5 minuten werd het mengsel verwarmd tot 110°C en gehouden tot de oplossing doorschijnend was. De ethanoldispergerende oplossing die 28 mg USPIO bevat, bereid in de vorige stap, werd na ultrasoon dispergeren aan de bovenstaande geklaarde oplossing toegevoegd. De oplossing werd uiteindelijk verwarmd tot 210°C met een snelheid van 3°C/min. De reactie werd na 2 uur reflux gestopt en natuurlijk afgekoeld tot kamertemperatuur. Na afkoeling werd ethylacetaat aan de reactieoplossing toegevoegd om de USPIO NP's te precipiteren en vervolgens 20 minuten bij 8000 tpm gecentrifugeerd om het supernatant te verwijderen. Het precipitaat werd vervolgens gedispergeerd in ethanol, gevolgd door precipitatie met ethylacetaat. Na drie keer wassen werd de USPIO-PAA gedispergeerd in ultrazuiver water voor verder gebruik. Om de biocompatibiliteit te verbeteren, hebben we PEG verder gekoppeld aan het oppervlak van nanodeeltjes door EDC en NHS-gemedieerde amidering [23]. 0,45 g PEG werd opgelost in 5 ml ultrapuur water en toegevoegd aan de 15 ml USPIO-PAA-dispersie (bevat 35 mg Fe) aangevuld met 20 mg EDC en 12 mg NHS. Het mengsel werd mechanisch 2 uur bij kamertemperatuur geroerd en vervolgens werd 10 ml DMF-oplosmiddel toegevoegd, waarbij water bij 40°C in het roterende verdampingsapparaat werd verwijderd. Ten slotte werden 40 mg DEC en 24 mg NHS aan het mengsel toegevoegd, waarbij 48 uur bij kamertemperatuur werd gemengd. De reactieoplossing werd gedurende 72 uur overgebracht naar een dialysezak in ultrapuur water, waarbij het ultrapuur water elke 12 uur werd vervangen. Het mengsel werd verder overgebracht naar een ultrafiltratiebuis om moleculen met een Mr >  30 kD te verzamelen door 10 minuten te centrifugeren bij 4000 rpm. Het eindproduct werd opgelost in ultrapuur water en bewaard bij 4 °C. In sommige gevallen werd SPIO-PAA/PEG-oplossing in water verzameld door centrifugeren met een ultrafiltratie-centrifugebuis (> 30 KD poriegrootte, Millipore), en de pellets werden gedroogd in een vacuümoven voor verder experiment.

Karakterisering van NP's

De deeltjesgrootte, grootteverdeling en morfologie van de monsters werden geanalyseerd door TEM. De bekledingslaag werd gemeten door negatieve kleuring. Na ultrasone dispersie werden de USPIO-PAA en USPIO-PAA/PEG in waterige oplossing toegevoegd aan het koperen netwerk van een 300-mesh koolstof ondersteunend membraan, op natuurlijke wijze gedroogd en vervolgens in een projectie-elektronenmicroscoop (Tecnai G2F20 s-twin, FEI) geplaatst voor observatie.

De infraroodspectroscopie-analyse wordt uitgevoerd op Agilent Technologies Cary 600-serie FTIR-spectrometer, waarbij het gedroogde monsterpoeder direct aan de monstertank wordt toegevoegd voor detectie.

Het Fe-gehalte in USPIO-PAA/PEG-dispersie werd bepaald met vlam-atomaire absorptiespectrometrie (FAAS), waarvan het model PerkinElmer Analyst 700 is. Eerst werden 1, 2, 3, 4 en 5 μg/ml ijzerstandaardoplossing geconfigureerd om de standaardcurve, waarna 100 μL USPIO-PAA of USPIO-PAA/PEG-dispersieoplossing werd opgelost met salpeterzuur en het ijzergehalte werd bepaald in een maatkolf van 50 ml.

Magnetische resonantiebeeldvorming van de nanodeeltjes werd uitgevoerd op klinische scanners met een magnetisch veld van 3 T in de beeldvormingsafdeling van het eerste aangesloten ziekenhuis van Soochow University. De nanodeeltjes werden gedispergeerd in 1% agarosegeloplossing volgens de overeenkomstige concentratie. Nadat de oplossing was gestold, werd de transversale relaxatietijd van de monsters gemeten door middel van multi-echosequentie. Door de acquisitie van MRI in DICOM-formaat te exporteren en vervolgens de RadiAnt DICOM Viewer te gebruiken om de grijswaarde te openen, af te lezen, door de grijswaarden van verschillende echotijden in de oorsprong te importeren voor montage, werden de transversale relaxatietijdwaarden van USPIO-dispersies met verschillende concentraties verkregen; ten slotte werd de transversale relaxatiesnelheid r2 van USPIO-PAA- en USPIO-PAA/PEG-monsters verkregen door lineair te passen met de transversale relaxatiesnelheid van 1/T2 en de Fe-concentratie van de monsters. De magnetische hysteresislussen van USPIO-PAA en USPIO-PAA/PEG werden verkregen met behulp van het Quantum Design DynaCool-9-apparaat aan de Suzhou University of Science and Technology volgens de eerder beschreven methoden [24].

HADSC-isolatie en identificatie

Alle onderzoeken zijn uitgevoerd in overeenstemming met de 'Ethical Guiding Principles on Human Embryonic Stem Cell Research' (van het ministerie van Wetenschap en Technologie en het ministerie van Volksgezondheid, Volksrepubliek China, 2003) en de Verklaring van Helsinki. Vetmonsters werden verkregen met geïnformeerde toestemming en ethische goedkeuring van het eerste aangesloten ziekenhuis van Soochow University. Het vetweefsel werd gewassen en in kleine stukjes gesneden na verwijdering van de bloedvaten en het bindweefsel onder een anatomische microscoop. De blokken werden verteerd met type I collagenase (0,3 pzu/ml) bij 37 °C gedurende 30 minuten, gevolgd door centrifugatie bij 500g gedurende 10 min. De celpellet werd gesuspendeerd met in DMEM + 10% FBS en gezaaid met een dichtheid van 8 × 10 ⁴ /cm ² . Na 48 uur werd het oude medium met drijvende cellen weggegooid en vervangen door vers medium.

HADSC's werden gekenmerkt door flowcytometrie voor oppervlaktemarkers die specifiek mesenchymale (CD90 en CD105) en hematopoëtische (CD34 en CD45) stamcellen labelen. Een totaal van 1 x 105 cellen werden geoogst en geïncubeerd met PE, FITC, APC/cy7 of PerCP-geconjugeerde antilichamen tegen CD34, CD45, CD90 en CD105 muis anti-menselijke monoklonale antilichamen en geschikte isotype controles. Gekleurde cellen werden geanalyseerd met behulp van een flowcytometer (LSRFortessa, BD, VS) en gegevens werden geanalyseerd met behulp van FlowJo-software. Vier fenotypes van CD90+, CD105+, CD34− en CD45− werden geselecteerd voor de oppervlaktemarkers van HADSC's. Expressieniveaus van celoppervlakkenmerkers werden geïdentificeerd door flowcytometrie (BD LSRFortessa).

De adipogene en osteogene differentiatie van HADSC's werden geëvalueerd door respectievelijk Oil Red O en Alizarin Red Staining. HADSC's werden gekweekt met MesenCultTM Adipogenic Differentiation-medium (Stem cell Tech., 05412) of OriCellTM Osteogenic Differentiation Kit (Cyagen, HUXMA-90021). Voor adipogene differentiatie van HADSC's werden cellen op dag 14 beoordeeld door kwalitatieve Oil Red O-kleuring voor met lipiden gevulde rijpe adipocyten (VivaCell Biosciences, C37A00150). Voor osteogene differentiatie van HADSC's werden cellen op dag 21 beoordeeld door middel van Alizarine Red Staining op calciumknobbeltjes in rijpe osteocyten (VivaCell Biosciences, C37C00150). Beelden werden verkregen met behulp van een omgekeerde Nexcope-microscoop.

In vitro cellulaire opname van USPIO-PAA/PEG en evaluatie van biocompatibiliteit

HADSC's werden uitgeplaat in een plaat met 6 putjes met een dichtheid van 1 × 10 ⁶ per put. Cellen werden gedurende 2 uur geïncubeerd met het medium dat USPIO-PAA/PEG (Fe 10 g/ml en 0,1 μg/ml) bevat en gekleurd met Pruisisch blauwe (PB) kleuring voor intracellulaire Fe-identificatie.

De biocompatibiliteit van USPIO-PAA/PEG werd bepaald met MTT-colorimetrie en 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) incorporatietest (EdU-proliferatiekit, Thermo). Voor MTT werden HADSC's uitgeplaat in een plaat met 96 putjes met een dichtheid van 5 × 10 ³ per putje en geïncubeerd met verschillende concentraties (0, 10, 20, 40, 80, 160 Fe μg/mL) USPIO-PAA/PEG 24 uur, 48 uur of 72 uur. Aan elk putje werd gedurende 4 uur 20 μl MTT-oplossing (5 mg/ml) toegevoegd, gevolgd door 150 μL dimethylsulfoxide om de kristallen op te lossen. De absorptiewaarde van elk gat werd gemeten bij OD 570 nm met behulp van een met een enzym gelabeld instrument (BioTek Synergy HT). Voor EdU-assay werden HADSC's 72 uur geïncubeerd met de SPIO-PAA/PEG bij 160 Fe g/ml, gevolgd door de incubatie met 10 μM EdU gedurende 24 uur. Cellen werden verzameld, gefixeerd met 4% paraformaldehyde en geneutraliseerd met een 2 mg / ml glycine. Nadat de permealisatiecellen waren geïncubeerd met de kleurstofoplossing (Azide 647-complex), werden de EdU-opnamesnelheden geëvalueerd door middel van flowcytometrie.

6-OHDA-geïnduceerd PD-model

Vijftien-twintig mannelijke Wistar-ratten (SPF-kwaliteit, met een gewicht van 220 ± 20 g) werden gebruikt voor in vivo tracering van USPIO-PAA/PEG-gelabelde HADSC's op PD-dieren. Alle procedures werden uitgevoerd volgens de voorschriften in China (Reglementen voor de administratie van proefdieren, 2017) en goedgekeurd door de commissie Institutional Animal Care and Use van de Chinese Academie van Wetenschappen. Overal werden dieren gehuisvest onder gecontroleerde verlichting (12/12 uur licht/donker cyclus, "aan" om 7 uur) met ad libitum toegang tot voedsel en water. PD-model werd bereid door 2-punts injectie van 6-hydroxydopamine (6-OHDA, Sigma, St. Louis, MO, VS) in het eenzijdige striatum van ratten. Zoals eerder beschreven [25, 26], werden ratten stereotactisch geïnjecteerd met 3 L 6-OHDA-oplossing (5 g/μL) op 2 coördinaten (AP:1,2 mm, ML:2,2 mm, DV:-4,0 tot 6,0 mm; en AP:respectievelijk − 1,0 mm, ML:4,4 mm, DV:− 4,5 tot 6,5 mm). Door apomorfine geïnduceerde rotatie (0,5 mg/kg, subcutaan) werd gebruikt om de validiteit van PD-modellen te testen. De ratten werden 1, 2 en 3 weken na behandeling met 6-OHDA subcutaan geïnjecteerd met apomorfine (0,5 mg/kg) en de rotatiescores werden gedurende 30 minuten in een open veld geëvalueerd. Het PD-model heeft meer dan 7 rotaties per minuut, geïnduceerd door apomorfine en werd als geslaagd beschouwd.

Celtransplantatie en in vivo MRI-beeldvorming

HADC's werden gedurende 2 uur geïncubeerd met USPIO-PAA/PEG (ijzerconcentratie was 10 g/ml) toen ze 80% samenvloeiing bereikten. 3 weken na voorbereiding van het PD-model, 3 × 10 ⁶ van USPIO-PAA / PEG-gelabelde HADC's of zoutoplossing werden geïnjecteerd in het linker striatum van PD-ratmodellen op de volgende coördinaat (AP:1,2 mm, ML:2,2 mm, DV:-4,0 tot 6,0 mm). Dieren die een transplantatie ontvingen, kregen onmiddellijk na de operatie en gedurende 2 dagen daarna buprenorfine (0,5 mg/kg) toegediend. Deze dieren werden 1, 2 of 3 weken na de transplantatie-operatie onderworpen aan de door apomorfine geïnduceerde rotatietests.

Voor in vivo MRI werden dieren afgebeeld met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS) beeldvormingssysteem voor kleine dieren (PerkinElmer, Waltham, MA, VS) op de 3e, 9e, 15e en 21e dag na de injectie met zoutoplossing of HADSC's.

Histologieanalyse

De hersenen van de overige rattenmodellen werden geoogst en in coupes gesneden tot een dikte van 30 mm voor analyse 3 weken na stamceltransplantatie (n = 5 per groep). Secties werden geïncubeerd met anti-tyrosinehydroxylase (TH, abcam, Engeland) en zichtbaar gemaakt met Alexa-594-geconjugeerd ezel-antikonijnantilichaam (Abcam). DAPI werd gebruikt voor tegenkleuring met kernen. Beelden werden vastgelegd met behulp van de Leica TCS SP5 confocale microscoop.

Statistische analyse

Numerieke gegevens werden uitgedrukt als het gemiddelde  ± SD. Gegevens werden onderworpen aan 2-tailed Student t-tests of one-way ANOVA met behulp van GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, VS) om het verschil te evalueren. * geeft p . aan < 0,05 en NS geeft geen significant verschil aan.

Resultaten

De synthese en karakterisering van nanodeeltjes

Het experimentele ontwerp wordt getoond in Fig. 1. De hydrofobe USPIO NP's werden bereid met behulp van de thermische ontledingsmethode. Zoals getoond in Fig. 2a-c, was de diameter van de originele USPIO NP's 4,07 ± 0,57 nm; door te coaten met PAA nam de diameter van de USPIO-PAA NP's toe tot 6,34 ± 0,54 nm; een verdere wijziging van de NP's met PEG zorgt ervoor dat de diameter van USPIO-PAA/PEG NP's 10,07 ± 0,55 nm bereikt. Alle drie de nanodeeltjes waren bolvormig en gelijkmatig verspreid. Statistische analyse toonde aan dat er een significant verschil was (F = 10, **p < 0.01, ##p < 0.01) tussen de diameters van de USPIO, USPIO-PAA en USPIO-PAA/PEG NP's, wat wijst op een succesvolle wijziging met PAA en PEG (Fig. 2d).

Schematische weergave van het experimentele ontwerp

Karakterisering van nanodeeltjes. a–c Representatieve TEM-afbeeldingen van USPIO NP's (a ), USPIO-PAA NP's (b ) en USPIO-PAA/PEG NP's (c ). d Statistische analyse gaf een significant verschil aan tussen de deeltjesgrootte van USPIO, USPIO-PAA en USPIO-PAA/PEG (n = 20 per groep). e Fourier-transform infrarood van nanodeeltjes van USPIO, USPIO-PAA en USPIO-PAA/PEG NP's. De pijlen geven de specifieke absorptiepiek aan bij 1728 cm ⁻¹ vanwege de PAA-aanpassing, 1595 cm ⁻¹ en 3440 cm ⁻¹ vanwege de PEG-modificatie. Numerieke gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD, **p < 0.01 versus de USPIO NP's, ##p < 0,01 versus de USPIO-PAA/PEG NP's. De balk staat voor 20 nm

Door de infraroodabsorptiemethode te gebruiken, ontdekten we dat USPIO-PAA een duidelijke carbonylabsorptiepiek heeft bij 1728 cm ⁻¹ vanwege de carbonyl-rektrillingspiek in het PAA-molecuul; USPIO-PAA/PEG heeft een koolstof-stikstofbinding in-plane buigtrillingspiek bij 1595 cm ⁻¹ en een uitrekkende trillingspiek van de hydroxylgroep bij 3440 cm ⁻¹ (Fig. 2e). Al deze gegevens bevestigden verder dat PAA- of PEG-moleculen met succes zijn gemodificeerd naar het oppervlak van NP's.

USPIO-PAA/PEG toonde goede in vitro magnetische respons en biocompatibiliteit met HADSC

Het in vitro beeldvormingsvermogen van USPIO-PAA en USPIO-PAA/PEG werd geëvalueerd door de grijswaarden van MRI-beelden bij verschillende concentraties (equivalent aan Fe-concentraties). Na het passen werden de transversale relaxatietijdwaarden van de dispersies bij verschillende concentraties verkregen. Door de transversale relaxatiesnelheid van 1/T2 in te stellen als de verticale coördinaat en de Fe-concentratie als de horizontale coördinaat, werd de transversale relaxatiesnelheid van USPIO-PAA berekend als 107,94 s ⁻¹ mm ⁻¹ (Fig. 3a), en 84.65 s ⁻¹ mm ⁻¹ voor USPIO-PAA/PEG (Fig. 3b). Beide deeltjes vertoonden goede MRI-beeldvormingseigenschappen. De magnetische hysteresislussen van SPIO-PAA en de SPIO-PAA/PEG toonden aan dat de verzadigingsmagnetisatiewaarde van SPIO-PAA 57 emu/g boven 10.000 Oe is (Fig. 3c), en die van SPIO-PAA/PEG 40 is emu/g boven 10.000 Oe (Fig. 3d). De dwangkracht en remanentie waren bijna nul (Fig. 3c, d), wat verder aangeeft dat zowel SPIO-PAA als SPIO-PAA/PEG superparamagnetisme waren.

In vitro magnetische respons van de gesynthetiseerde USPIO-PAA en USPIO-PAA/PEG NP's. een , b MRI en transversale relaxatiesnelheid van USPIO-PAA NP's (a ) en USPIO-PAA/PEG NP's (b ). r ₂ staat voor de mate van ontspanning. De relaxatiepercentages van de USPIO-PAA en USPIO-PAA/PEG NP's waren 107,94 s ⁻¹ mM ⁻¹ en 84.65 s ⁻¹ mM ⁻¹ . c , d magnetische hysteresislussen van USPIO-PAA NP's (c ) en USPIO-PAA/PEG NP's (d ). De magnetische hysterese werd gemeten bij 295 k (21,85 ° C) met de maximale magnetische veldintensiteit 50.000 Oe (5 Telsa). De verzadigingsmagnetisatiewaarden waren bijna 57 emu/g voor SPIO-PAA en 40 emu/g voor SPIO-PAA/PEG. Magnetisatiehysterese in beide curven was bijna nul

Door de USPIO-PAA/PEG NP's met HADSC's gedurende verschillende tijd te incuberen, ontdekten we dat USPIO-PAA/PEG NP's geen significante effecten hebben op de overleving van cellen (p> 0,05). De cellevensvatbaarheid van HADSC's blijft boven 96% wanneer de equivalente Fe-concentratie varieerde van 0 tot 160 g/ml. Bovendien veroorzaakt de toename van de incubatietijd (van 24 tot 72 uur) geen significant celverlies bij elke Fe-concentratie (figuur 4a). Een vergelijkbare waarneming werd verkregen toen USPIO-PAA / PEG NP's werden geïncubeerd met iPSC's in verschillende concentraties (figuur 4b). Hoewel HADSC's 72 uur werden behandeld met de 160 μg Fe / ml USPIO-PAA / PEG, is het proliferatievermogen, zoals aangegeven door de EdU-opnamesnelheden, niet aangetast door de aanwezigheid van USPIO-PAA / PEG (Fig. 4c). Al deze gegevens wezen op de bioveiligheid van de gesynthetiseerde USPIO-PAA/PEG NP's.

De gesynthetiseerde USPIO-PAA / PEG NP's vertonen een goede biocompatibiliteit en labelingscapaciteit. een , b HADSC's of iPSC's werden geïncubeerd met USPIO-PAA/PEG NP's in verschillende concentraties (equivalent aan Fe-concentraties bij 0, 10, 20, 40, 80 en 160 μg Fe/ml) gedurende 24, 48 en 72 uur, en de levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald met de MTT-methode en weergegeven in a , b , respectievelijk. Er is geen significant verschil tussen de levensvatbaarheid bij verschillende NP's-concentraties (n = 5) of incubatietijd (n = 5). c Flowcytometrie-analyse toonde aan dat de EdU-opnamesnelheden vergelijkbaar waren in de HADSC's die waren geïncubeerd in aanwezigheid of afwezigheid van USPIO-PAA/PEG (160 μg Fe/ml gedurende 72 uur). HADSC's die niet met EdU werden behandeld, dienden als negatieve controle. d USPIO-PAA/PEG bij 10 μg Fe/ml en incubatietijd gedurende 2 uur resulteerde in bijna 100% labelingsefficiëntie van HADSC's, zoals geëvalueerd door Pruisische blauwe kleuring. Merk op dat USPIO-PAA/PEG bij 0,1 μg Fe/ml (2 uur incubatietijd) een lichte maar uniforme PB-kleuring in de HADSC's produceerde. Numerieke gegevens worden weergegeven als gemiddelde  ± SD. De balk staat voor 20 μm

Om te bepalen of cellen effectief kunnen worden gelabeld door USPIO-PAA/PEG NP's, hebben we de HADSC's gedurende 2 uur geïncubeerd met USPIO-PAA/PEG NP's bij equivalent Fe 10 g/ml of 0,1 μg/ml. Zoals getoond in Fig. 4d, werd een groot aantal in blauw gekleurd NP's waargenomen in bijna 100% van de HADSC's in aanwezigheid van USPIO-PAA / PEG (Fe 10 μg / ml). Hoewel de dosis USPIO-PAA/PEG verlaagde tot 0,1 μg Fe/ml, zagen we nog steeds vrij uniforme en verspreide PB-kleuring in bijna alle HADSC. In vergelijking met sommige van de andere gerapporteerde SPIO's [14, 27, 28], vertoonde USPIO-PAA/PEG een hoge celopname-efficiëntie.

Op lange termijn volgen van USPIO-PAA/PEG NP's-gelabelde HADSC's in PD-ratmodellen

HADSC's gelabeld met USPIO-PAA / PEG NP's werden door stereotactische injectie in het linker striatum van het PD-rattenmodel getransplanteerd. Zoals weergegeven in Fig. 5, hebben we 3 dagen na de HADSC-transplantatie een duidelijk MRI-signaal in het linker striatum waargenomen, wat wijst op een goede in vivo tracering van de getransplanteerde cellen. Een dynamische observatie op D3, D9, D15 en D21 na transplantatie toonde aan dat de getransplanteerde cellen met NP-labeling tot 3 weken duidelijk konden worden getraceerd, en de MRI-signalen vertoonden geen duidelijke vermindering tijdens het proces. Deze resultaten geven aan dat de gesynthetiseerde nanodeeltjes een goed potentieel hebben voor het in vivo opsporen van de getransplanteerde cellen.

Representatieve MRI-beelden van de hersenen na 3 dagen, 9 dagen, 15 dagen en 21 dagen gevolgd door transplantatie met USPIO-PAA/PEG-labeling HADSC's of zoutoplossing. De MRI-beelden van de overeenkomstige controles, d.w.z. normale ratten of PD-rattenmodel geïnjecteerd met zoutoplossing, werden respectievelijk in de 1e en 2e rij getoond. Merk op dat in vergelijking met de negatieve signalen in de controle, de rattenhersenen die waren getransplanteerd met USPIO-PAA/PEG-gelabelde HADSC's, tot 21 dagen constante en duidelijke MRI-signalen vertoonden. De balk staat voor 5 mm

USPIO-PAA/PEG NPs-gelabelde HADSC's vertoonden therapeutische effecten in PD-model

Om te evalueren of met NP's gelabelde HADSC's therapeutische effecten vertoonden, hebben we eerst een fenotypische karakterisering van de geïsoleerde HADSC's uitgevoerd. Zoals getoond in Fig. 6a, waren de gekweekte HADSC's spoelvormige cellen. De flowcytometrie-analyse toonde aan dat de HADSC's sterk tot expressie gebrachte markers waren voor mesenchymale cellen, zoals CD90 (> -99%) en CD105 (> -99%), terwijl weinigen hematopoëtische markers zoals CD34 en CD45 tot expressie brachten (Fig. 6b-g ). De HADSC's konden onder bepaalde omstandigheden differentiëren naar adipogene of osteogene lijnen, en het differentiatievermogen werd respectievelijk getoond door Oil Red O of Alizarin Red Staining (figuur 5h). Let op de lipidedruppeltjes of verkalkte knobbeltjes in de gedifferentieerde HADSC's, terwijl een dergelijke structuur niet aanwezig is in de controle HEK293-cellen (figuur 6h). Al deze geven aan dat HADSC's voldoen aan de criteria van mesenchymale cellen.

HADSC's karakterisering. een Een representatief beeld onder de woordcontrastmicroscoop die aantoont dat HADSC's een typisch spindelachtig fenotype hebben. b–g HADSC's werden geïncubeerd met antilichamen die waren geconjugeerd met verschillende kleurstoffen tegen CD45-, CD105-, CD34- en CD90-markers en onderworpen aan flowcytometrische analyse. De spreidingsdiagrammen worden weergegeven in b, c , en de histogrammen worden weergegeven in d–g . Merk op dat de meeste cellen CD90 en CD105 tot expressie brachten, maar niet CD34 en CD45. u Adipogene differentiatie en osteogene differentiatie van HADSC's versus HEK293-cellen worden geëvalueerd door respectievelijk Oil Red O of Alizarin Red Staining. De balk staat voor 20 μm

De door apomorfine geïnduceerde rotaties waren 17,1 ± -1,79, 28,7 ±  1,77 en 31,86 ± -1,72 per minuut in de 1e, 2e en 3e week na 6-OHDA-injectie, wat de succesvolle oprichting van het ratten-PD-model bevestigt. Zoals getoond in Fig. 7, verminderden de rotatiegetallen van PD-rattenmodellen tot 32,59 ±-1,12, 31,85 ± 1,98 en 31,54 ±-1,73 in de 1e, 2e en 3e week gevolgd door NPs-gelabelde HADSC's-transplantatie in het striatum van de laesiezijde. Statistische analyse bracht een significant verschil aan het licht tussen de met zoutoplossing en de HADSC-toegediende groepen vanaf de 2e week na de transplantatiechirurgie (p < 0.01 bij 2e week, p < 0,01 in de 3e week; n = 5 in elke groep), wat aangeeft dat de met NP's gelabelde HADSC's de gedragsstoornissen in de PD-modellen verbeteren.

PD-ratmodellen werden toegediend met zoutoplossing of USPIO-PAA/PEG-gelabelde HADSC's in het ipsilaterale striatum aangetast met 6-OHDA, en de rotatiegetallen per minuut werden gescoord en vergeleken. Er is een significante vermindering van de rotatiegetallen in de 2e, 3e week nadat de PD-ratten HADSC's kregen, in vergelijking met de overeenkomstige PD-ratten die zoutoplossing kregen. ns geeft onbeduidende verandering aan, en ** geeft p . aan < 0.01. n = 5 voor elke groep

PD wordt gekenmerkt door het verlies van neuronen die tyrosinehydroxylase (TH) tot expressie brengen in de substantia nigra. Door immunokleuring tegen TH te gebruiken, ontdekten we dat 6-OHDA de neuronen die TH tot expressie brengen in de substantia nigra vermindert, en de transplantatie met HADSC's in het striatum van PD-rattenmodellen zou een dergelijke vermindering kunnen verlichten (Fig. 8). Gecombineerd met de observatie dat celtransplantatie de gedragsstoornissen van PD-ratten verlicht, concludeerden we dat USPIO-PAA/PEG NP's-gelabelde HADSC's therapeutische effecten uitoefenen in PD-rattenmodellen.

Immunokleuring tegen TH in de substantia nigra van de ratten die zoutoplossing kregen (a , d , g ), PD-ratten die zoutoplossing kregen (b , e , u ) of PD-ratten die USPIO-PAA/PEG NPs-gelabelde HADSC's (c , v , ik ). Het gebied in het gestippelde kader geeft het compacte gebied van de substantia nigra (SNc) en het ventrale tegmentale gebied (VTA) aan. Afbeeldingen in de vakken van d , e , v worden vergroot en weergegeven in g , u , ik , respectievelijk. Er zijn minder cellen die TH tot expressie brengen in de SNc- en VTA-regio's bij de ratten die 6-OHDA-injectie kregen, in vergelijking met de controles die zoutoplossing kregen. Na HADSC-transplantatie konden meer cellen die TH tot expressie brengen in de SNc van PD-ratten worden waargenomen. De balk staat voor 100 m

Discussie

Celtherapie is een veelbelovende strategie voor de behandeling van neurodegeneratieve ziekten en heeft de afgelopen 20 jaar in de voorhoede gestaan ​​van preklinisch onderzoek [29, 30]. Het opsporen van de getransplanteerde cellen is een onmisbaar onderdeel voor de opheldering van onderliggende mechanismen en de evaluatie van klinische effecten; het is echter een uitdaging en belemmerde tot op zekere hoogte de toepassing van celtherapie [31, 32]. Computertomografie (CT), near-infrared fluorescent imaging (NIFI) en MRI zijn de meest gebruikte methoden voor het in vivo volgen van getransplanteerde cellen [31, 32]. Vergeleken met de vrij hoge straling van CT en lage gevoeligheid van NIFI, toont MRI goede beeldvorming van diep weefsel, hoog contrast en lage ioniserende straling, waardoor het een goede kandidaat is voor in vivo tracering [33,34,35,36]. De ontwikkeling van goede tracers voor MRI wordt daarom een ​​onmisbaar onderdeel van het bevorderen van de toepassing van celtherapie.

SPIO is een eenvoudige en betrouwbare labelstrategie voor MRI-visualisatie. Om langdurige in vivo tracering van de getransplanteerde cellen te bereiken, moeten de SPIO-deeltjes een uniforme en ultrakleine grootte hebben, aangezien grote deeltjes kunnen leiden tot een ongelijkmatige verdeling van de tracers en de normale bloedcirculatie kunnen verstoren [33]. Bovendien zijn de internalisatie-efficiëntie en biocompatibiliteit van nanodeeltjes een andere belangrijke index om de tracers te evalueren. Nanodeeltjes komen gewoonlijk cellen binnen via endocytose in de vloeibare fase [37], receptor-gemedieerde endocytose [38] en fagocytose [39]. Om een ​​betere cellulaire opname te bereiken, worden de SPIO-deeltjes meestal gemodificeerd met intermediaire liganden [18, 40, 41].

Naast celtracking is SPIO ook toegepast voor medicijnafgifte [42]. De weefseldistributie en farmacokinetische klaring zijn belangrijke indexen voor beide toepassingen. Vergeleken met de NPs-PAA vertoonden NPs-PAA/PEG een langere retentietijd in het bloed en een langzamere urineklaring [43]. NP's die dicht gecoat zijn met PEG zorgen voor een veel meer uniforme verdeling over mucosale epitheliale oppervlakken, inclusief het maagdarmkanaal [44], het ademhalingssysteem [45, 46] en hersentumor [42], enz. Bovendien vermindert PEG-coating de aanhechting van eiwitten en vorming van corona, wat op zijn beurt een uniforme verdeling van de NP's zou kunnen bevorderen ten koste van een verminderde opname [47]. Als een potentieel goed diagnostisch en therapeutisch hulpmiddel is de labelingscapaciteit van SPIO-PAA/PEG op MSC's en de verdere toepassing ervan bij hersenaandoeningen zoals PD niet goed bestudeerd, en de huidige studie was ontworpen om deze vraag te beantwoorden. In de huidige studie hebben we een nieuwe ultrakleine USPIO-PAA / PEG-nanodeeltjes gesynthetiseerd, waarbij de SPIO-kernen werden gewijzigd met respectievelijk PAA- en PEG-liganden. De USPIO-PAA/PEG NP's hebben een uniforme ultrakleine diameter (10,07 ± 0,55 nm), goede dispersie in waterige oplossing, biocompatibiliteit met verschillende celtypen en een goed magnetisch responseffect in vitro en in vivo. Belangrijk is dat de signalen van gelabelde HADSC's duidelijk kunnen worden gedetecteerd onder MRI na hersentransplantatie gedurende maximaal drie weken, wat wijst op het goede potentieel voor klinische toepassing.

PD wordt gekenmerkt door een progressief verlies van dopaminerge neuronen in de substania nigra en door een tekort aan dopaminerge niveaus in de dopaminerge netwerken [1]; de meest getroffen is de nigrostriatale route inclusief het striatum. In de huidige studie hebben we USPIO-PAA / PEG-gelabelde HADSC's getransplanteerd in het striatum van PD-rattenmodellen en ontdekten dat een dergelijke transplantatie de gedragsstoornissen verbeterde; bovendien verminderde het tot op zekere hoogte het verlies van dopaminerge neuronen in de substania nigra. Evenzo, Ardeshir et al. rapporteerde dat het transplanteren van de MSC's die zijn afgeleid van vetweefsel van ratten, apomorfine-geïnduceerde rotaties in PD-modellen verzwakte [48]. Anders dan het transplanteren van foetale middenhersenenweefsels [49] of dopaminerge neurale voorlopers [50], oefenen HADSC's hun therapeutische effecten voornamelijk uit via de paracriene effecten [51, 52], in plaats van de aangetaste weefsels te vervangen. Studies hebben aangetoond dat MSC's fungeren als promotors van immunomodulatie, neuroprotectie en neuronale differentiatie, en deze effecten worden in wezen gemedieerd door het secretoom dat door MSC's wordt afgegeven [6, 7, 51]. Ons resultaat is consistent met deze waarnemingen; bovendien geeft het aan dat de nieuwe USPIO-PAA/PEG-tracers de neuroprotectieve effecten van HADSC's niet verstoorden.

Conclusies

We hebben nieuwe USPIO-PAA/PEG-tracers ontwikkeld die een hoge celopname-efficiëntie, uitstekende biocompatibiliteit en MRI-traceringscapaciteiten op lange termijn laten zien. De HADSC's gelabeld met USPIO-PAA/PEG konden met MRI worden getraceerd tot 3 weken na celtransplantatie. Bovendien verzwakten de gelabelde HADSC's de gedragsstoornissen van PD-modellen aanzienlijk en verhoogden ze het aantal dopaminerge neuronen in de substantia nigra. De ontwikkeling van USPIO-PAA/PEG-tracer kan een veelbelovend hulpmiddel zijn in stamcelonderzoek en -toepassing.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Alle gegevens die de conclusies van dit artikel ondersteunen, zijn in het artikel opgenomen.

Afkortingen

SPIO:

Klein superparamagnetisch ijzeroxide

USPIO:

Ultraklein superparamagnetisch ijzeroxide

PAA:

Polyacrylzuur

PEG:

Methoxypolyethyleenglycolamine

HADSC's:

Menselijke van vet afkomstige stamcellen

USPIO-PAA/PEG:

Ultrakleine superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes coating met polyacrylzuur en methoxypolyethyleenglycolamine

6-OHDA:

6-Hydroxydopamine

CT:

Computertomografie

NIFI:

Nabij-infrarood fluorescentiebeeldvorming

MRI:

Magnetische resonantie beeldvorming

TH:

Tyrosinehydroxylase

TEM:

Transmissie elektronenmicroscoop