Het verbeteren van de magnetofectie van magnetische polyethyleenimine-nanodeeltjes in MG-63-osteoblasten met behulp van een nieuw uniform magnetisch veld

Resultaten en discussie

Beginsel van magnetofectie

Magnetofectie wordt gedefinieerd als vectoren die zijn geassocieerd met superparamagnetische nanodeeltjes en die zich ophopen op de doelcellen door de toepassing van magnetische gradiëntvelden [15]. Figuur 1 toont de componenten en morfologie van PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen en het primaire principe van magnetofectie. Langzame vectoraccumulatie en bijgevolg lage vectorconcentratie in doelweefsels zijn geïdentificeerd als eenvoudige maar sterke barrières voor effectieve genafgifte [28]. Het belangrijkste werkzaamheidsverhogende mechanisme van magnetofectie lijkt de snelle sedimentatie van de volledige vectordosis op de doelcellen te zijn, zodat tot 100% van deze cellen binnen enkele minuten vectordeeltjes aan hun oppervlak hebben gebonden. Magnetofectie is dus een geschikt hulpmiddel om de sterke barrière van langzame vectoraccumulatie en bijgevolg lage vectorconcentratie in doelweefsels te overwinnen. PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen willekeurig, en is beperkt en tijdrovend in zijn afzetting in de beoogde cellen in afwezigheid van een magnetisch veld. Desalniettemin kan het PEI-SPIO-NP's/pDNA-complex de beoogde cellen in een relatief korte tijd in de aanwezigheid van een magnetisch veld breed en uniform raken, wat de kans op endocytische opname in het eenheidsgebied van cellen kan vergroten, om verbeter de bezettingsgraad van PEI-SPIO-NPs/pDNA-complex en verbeter de transfectie-efficiëntie.

Overzicht van magnetofectie met behulp van PEI-SPIO-NPs/pDNA-complex. Gevoerd polyethyleenimine (LPEI) en superparamagnetische ijzeroxide-nanodeeltjes (SPIO-NP's) worden geassocieerd door de reactie van uitdrogingscondensatie. Voor dit doel werden SPIO-NP's gecoat met LPEI, d.w.z. de LPEI is stevig gebonden aan het oppervlak van SPIO-NP's en ze vormen samen PEI-SPIO-NP's. Als PEI-SPIO-NP's worden gemengd met naakt pDNA, bindt negatief geladen pDNA aan positief geladen PEI-SPIO-NP's via elektrostatische adsorptie. Cellen worden geïncubeerd met de PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen in aanwezigheid van een magnetisch veld dat de complexen naar de cellen trekt. Het resultaat van magnetofectie is dat vrijwel alle cellen in contact komen met vectoren en dat een hoog percentage cellen snel wordt getransfecteerd

Karakterisatie van PEI-SPIO-NP's/pDNA-complexen

Figuur 2a laat zien dat de PEI-SPIO-NP's ruwweg bolvormig zijn en dat PEI-SPIO-NP's/pDNA-complexen geaggregeerd lijken, beide met een gunstige dispergeerbaarheid, en de aantrekkingskracht tussen positieve en negatieve ladingen maakt PEI-SPIO-NP's/pDNA-complexen in staat om te verwerven een kleine maat. De hysterese-lus van PEI-SPIO-NP's / pDNA-complexen wordt getoond in figuur 2b. Het gewichtspercentage ijzeroxide in PEI-SPION-NP's gemeten met een atoomabsorptiespectrometer is 20,33 (±-2,87) %. De verzadigingsmagnetisatie van de PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen was 21,5 (±-1,6) emu/g ijzer. Ondanks de verminderde magnetische eigenschappen in vergelijking met die van de niet-gemodificeerde superparamagnetische ijzeroxide-nanodeeltjes, vertoonden PEI-SPIO-NP's/pDNA-complexen een uitstekende magnetische respons, wat nodig is voor magnetofectie met hoge efficiëntie.

Kenmerken van PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen. een TEM van PEI-SPIO-NP's en PEI-SPIO-NP's/pDNA-complexen. b Hysterese-lussen van SPIO-NP's en PEI-SPIO-NP's/pDNA-complexen. c Zeta-potentiaal en hydrodynamische diameter van PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen bij verschillende N/P-verhoudingen. d AFM-grijswaardenafbeelding en de moleculaire structuur van de PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen. Rode stippen vertegenwoordigen de locatie van de chemische groep SPIO, de groene stippen geven stikstofatomen aan, gele stippen duiden koolstofatomen aan en het fosforatoom wordt weergegeven door een witte cirkel zwarte stip. e (a) Grootteverdeling van PEI-SPIO-NP's/pDNA-complexen en e (b) zeta-potentiaal van PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen zoals gemeten door een Malvern Zetasizer dynamisch lichtverstrooiingsinstrument. Resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD (n = 5)

Hydrodynamische diameter en zeta-potentiaal werden beschouwd als de onmisbare parameters van gendragers. Figuur 2c laat zien dat de hydrodynamische diameter van PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen 200 (± 21,7) nm was met een N/P-verhouding (NH₂ —groep in PEI / PO₄ -groep in pDNA) van 2,5 en 175 (±  16,4) nm wanneer de N/P-verhouding 5 was, wat aangeeft dat de snelle verandering in grootte plaatsvond tijdens de overgang van de potentiaal van negatief naar positief. Daarna namen de afstotende krachten tussen de PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen toe met hogere N/P-verhoudingen, wat aangeeft dat de grootte van nanodeeltjes was toegenomen.

We analyseerden de soorten chemische bindingen volgens de rangschikking van atomen en speculeerden verder over de moleculaire structuur van PEI-SPIO-NP's / pDNA-complexen. De moleculaire structuur van PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen werd indirect onthuld door atoomkrachtmicroscopie (AFM, figuur 2d), waaruit bleek dat de carboxylgroepen van superparamagnetische ijzeroxide-nanodeeltjes gecombineerd met het primaire amine van PEI door de amidebinding. Bovendien werd het pDNA in een PEI-moleculaire keten gewikkeld via elektrostatische binding tussen de fosfaatgroepen van de nucleotideketen en de aminegroepen van PEI, waardoor PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen werden gevormd. In de AFM-grijsschaalafbeelding geeft de rode stip de locatie van de ijzeratomen weer, de groene stip geeft stikstofatomen aan, de gele stippen duiden koolstofatomen aan en het fosforatoom wordt weergegeven door een witte cirkel met een zwarte stip.

Zoals getoond in Fig. 2e, werd het potentieel van PEI-SPIO-NPs / pDNA-complexen gedetecteerd met behulp van het dynamische lichtverstrooiingsinstrument. Bij pH =7 was het potentieel van de superparamagnetische ijzeroxide-nanodeeltjes (SPIO-NP's) -6,6 (±-1,1) mV, wat de aanwezigheid van carboxylgroepen aan hun oppervlak aangaf. Het potentieel van PEI-SPIO-NP's was +-18,2 (±-1,5) mV. Het potentieel van PEI gemodificeerd met SPIO-NP's werd getransformeerd in een positief geladen oppervlak, dat zou kunnen worden gebruikt als een gendrager die kan worden gecombineerd met negatief geladen pDNA. We evalueerden de verandering in oppervlakteladingen van PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen bij verschillende N/P-verhoudingen. De PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen vertoonden een negatieve oppervlaktelading, zelfs bij een lage N/P-verhouding van 2,5, wat zich geleidelijk vertaalde in een positieve oppervlaktelading naarmate de N/P-verhouding toenam tot 5. Deze toename in N/P-verhoudingen in PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen resulteerden in een toename van de positieve oppervlaktelading van polyplexen. Bij een N/P-verhouding van 10 was het potentieel van PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen (N/P = 10) +-11,9 (±-1,2) mV en bereikte de oppervlaktelading een plateau. De positief geladen complexen kwamen in contact met het negatief geladen celmembraan en maakten cellulaire opname van de gecomplexeerde nanodeeltjes mogelijk [29]. PEI-SPIO-NP's kunnen niet alleen worden gebruikt als gendragers van negatief geladen pDNA, maar dragen ook een bepaald niveau van magnetisme bij voor gerichte medicijnafgifte en worden het contrastmiddel dat wordt gebruikt voor magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) contrastbeeldvorming [30, 31] .

Een fundamentele vereiste van gendragers is dat de transfectiedrager efficiënt een stabiel complex moet vormen met nucleïnezuren. Om het bindingsvermogen ervan te evalueren, werden vergelijkbare volumes PEI-SPIO-NPs-oplossing en pDNA-oplossing gemengd bij verschillende N/P-verhoudingen en gevortext. Een aliquot van 10 L van het mengsel werd vervolgens geanalyseerd door agarosegelelektroforese (figuur 3a). In tegenstelling tot naakt pDNA werd de migratie van het plasmide volledig geblokkeerd bij een N/P-verhouding van 5, wat aangeeft dat de PEI-SPIO-NP's het pDNA volledig geconcentreerd [32].

De pDNA-bindingstest en de pDNA-beschermingstest van PEI-SPIO-NP's. een Agarosegelelektroforese van PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen bij verschillende N/P-verhoudingen. b Elektroforetische mobiliteitsanalyse van PEI-SPIO-NP's/pDNA na DNase-I-behandeling. PEI-SPIO-NP's met verschillende N/P-verhoudingen en pDNA (3 μg) werden bij 37 °C geïncubeerd in een 5% CO₂ sub-vochtige omgeving gedurende 30 min met DNase-I (4U) in DNase/Mg ²⁺ digestiebuffer bestaande uit 50 mM Tris-HCl (pH =7,6) en 10 mM MgCl₂ . DNase I werd vervolgens geïnactiveerd door EDTA-oplossing (pH =8) toe te voegen totdat de eindconcentratie 2,5 mM was. Het monster werd vervolgens gedurende 15 minuten bij 65 ° C geïncubeerd en 10 μL van 1 mg / ml natriumheparine werd toegevoegd om pDNA vrij te maken van PEI-SPIO-NP's / pDNA. De integriteit van pDNA werd beoordeeld met 1% agarosegelelektroforese (90 V, 30 min)

Een ander kenmerk van PEI-SPIO-NP's als potentiële gendragers is dat ze pDNA kunnen beschermen tegen afbraak door nucleasen, waardoor transfectie wordt bevorderd. Figuur 3b laat zien dat naakt pDNA significant wordt afgebroken door DNase-I. De PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen met een N/P-molverhouding < 5 werden volledig verteerd, terwijl pDNA dat vrijkwam uit PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen (N/P = 5:1) intact bleef. De resultaten van deze DNase-I-beschermingstests toonden aan dat de PEI-SPIO-NP's pDNA effectief beschermden tegen DNase-I-digestie, wat de mogelijke toepassingen ervan voor gentherapie impliceert.

Zoals hierboven getoond, konden PEI-SPIO-NP's pDNA's niet beschermen tegen nucleasedegradatie toen N / P < 5 was. De grootte van PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen nam toe wanneer N/P> 10 was, wat ongeschikt was voor vectortransport [33, 34]. De grootte van de PEI-SPIO-NPs/pDNA-complexen was de kleinste en vertoonde stabiliteit bij N/P =  5. Bovendien nam het zeta-potentieel van de PEI-SPIO-NP's niet significant toe wanneer N/P> 10. om de stabiliteit van PEI-SPIO-NP's/pDNA te garanderen, werd voor de daaropvolgende experimenten een N/P-verhouding van 10 gekozen.

Generatie van een magnetisch veld

De nieuwe Halbach-magneetveldgenerator (Fig. 4a, b) is ontwikkeld door onze groep, in samenwerking met het Electrical Engineering College van de Chongqing University [20, 21]. De nieuwe magnetische veldgenerator bestaat uit negen identieke kubusvormige permanente magneetmodules en twee passieve vulplaten (Fig. 4c), die een zeer uniform magnetisch veld in het horizontale vlak genereren.

De magnetische veldgenerator en hun magnetische velduniformiteit en PEI-SPIO-NP's verdeeld in de verschillende magnetische velden. een Meting van magnetische velduniformiteit door Graussmeter. b Uniforme magnetische veldgenerator. c 3D-afbeelding van magneetopstelling van uniforme magnetische veldgenerator (waarbij elke magneet een afmeting heeft van 40 × 40 × 200 mm ³ ). d 96-wells magnetisch veld generator. e Magnetische velduniformiteit van 96-wells magnetische veldgenerator. v Magnetische velduniformiteit van uniforme magnetische veldgenerator. g Verdeling van PEI-SPIO-NP's in een magnetisch veld met 96 putjes. u Verdeling van PEI-SPIO-NP's in uniform magnetisch veld. ik De XOY-vlakverdeling van uniform magnetisch veld (50 mm × 50 mm) en j 3D-verdeling van uniform magnetisch veld

De optimaliserende magneetstructuur kan een magnetisch veld genereren dat zich vlak verdeelt in de horizontale richting van het 50 mm × 50 mm gebied in het YOZ-vlak. De helling wordt in verticale richting verdeeld met een helling van 2 mT/mm. Het magnetische veld is uniform verdeeld in een XOY-gebied van 50 mm × 50 mm met een uniformiteit van 1,3 × 10 ⁻³ en een magnetisch veld van 0,0739 T, zijn de magnetische sterkten van het coronale vlak en de sagittale vlakken waar de celkweekplaat was geplaatst respectievelijk 0,0632 T en 0,07 T. Het uniformiteitsverschil van elk putje in de magnetische plaat voor het kweken van 96 putjes was ongeveer 80% (Fig. 4d, e). Het uniformiteitsverschil van elk putje in het nieuwe magnetische veld van Halbach is echter kleiner dan 2‰, dus het uniformiteitsverschil tussen de twee magnetische velden is>  100-voudig (figuur 4f). In dit geval hebben we een magnetische plaat met 96 putjes voor het kweken van cellen ingesteld als een niet-uniform magnetisch veld, en het nieuwe magnetische veld van Halbach is een relatief uniform magnetisch veld, dat werd gebruikt als een experimenteel hulpmiddel voor latere studies.

De verdeling van PEI-SPIO-NP's werd significant beïnvloed door het magnetische veld. PEI-SPIO-NP's zonken geleidelijk als gevolg van de zwaartekracht en werden willekeurig verdeeld in afwezigheid van het magnetische veld. Bij het aanleggen van een magnetisch veld zonken PEI-SPIO-NP's snel naar de bodem van de platen. Bovendien kan de verdeling ook aanzienlijk worden gewijzigd in verschillende magnetische velden. In het conventionele niet-uniforme magnetische veld (96-wells magnetische plaat voor het kweken van cellen), werden PEI-SPIO-NP's verzameld in massa's of banden en verdeeld langs de lijnen van magnetische kracht (figuur 4g). De PEI-SPIO-NP's waren echter uniform verdeeld in het uniforme magnetische veld dat werd geïnduceerd door de nieuwe magnetische veldgenerator (figuur 4h). As can be seen from the XOY plane distribution and 3D distribution of the magnetic field (Fig. 4i, j), the red area in the figure is a relatively uniform magnetic field, with the uniformity of about two thousandths (Z  = 10 mm), and it can be seen that the gradient of the magnetic field in the target region is about 1.3 t/m (130 G/cm). The magnetic field generated in the designated area could obtain a good flat property in the horizontal direction by adjusting the arrangement of the magnet module and changing the magnetization direction of the magnet module.

Assessment of In Vitro Cytotoxicity

We used CCK-8 kits to evaluate the effects of magnetization, magnetic field, and pDNA on the cytotoxicity of nanoparticles. Figure 5a shows that with the prolongation of culture time, the absorbance values increased in all the groups except for the PolyMag-200/pDNA groups. The absorbance values of PEI-SPIO-NPs/pDNA group were higher than that of PEI-NPs/pDNA group and PolyMag-200/pDNA group (P  < 0.05) and lower than that of the control group (P  > 0.05), suggesting that the cytotoxicity of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes is lower than unmagnetized PEI-NPs/pDNA complexes and PolyMag-200/pDNA complexes. Figure 5b shows the negative effects on the absorbance values caused by the uniform and non-uniform magnetic fields. The negative effect caused by the uniform magnetic field was smaller than that caused by the non-uniform magnetic field (P < 0.05). As shown in Fig. 5c, the absorbance values of nanoparticles without pDNA is significantly lower than that of nanoparticles with pDNA (P  < 0.05), which meant nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts.

Comparison of cytotoxicity effects of the uniform magnetic field and non-uniform magnetic field, PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, PolyMag-200/pDNA complexes and PEI-NPs/pDNA complexes, and different nanoparticles with pDNA and without pDNA on MG-63 osteoblasts. Cytotoxicity is detected by the CCK-8 test kit, the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm, which reflects the cell viability, and the high viability is indicative of the low cytotoxicity. The results are expressed as the mean ± SD (n  = 5, one-way ANOVA, *P  < 0.05, **P < 0.01). een The cytotoxicity effects of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, PolyMag-200/pDNA complexes and PEI-NPs/pDNA complexes on MG-63 osteoblasts. b The cytotoxicity effects of the uniform magnetic field and non-uniform magnetic field on MG-63 osteoblasts and c the cytotoxicity effects of different nanoparticles with pDNA and without pDNA

Although PEI is an efficient transfection reagent, its cytotoxicity is strongly and positively correlated with its transfection efficiency and the mechanism of cytotoxicity caused by PEI is not very clear [35]. The present study found that during transfection, PEI increases the permeability of the cell membrane and damages the integrity of the mitochondrial and nuclear membranes [36, 37]. Sonawane et al. [38] reported that PEI25K promotes the release of mitochondrial protons and inhibits the electron transport chain in a dose- and time-dependent manner, indicating that PEI induces cell apoptosis. Another study showed that PEI induces cell autophagy, which is closely related to cytotoxicity [39]. The cytotoxicity of magnetized PEI decreased, and this might be attributable to the surface carboxyl groups of superparamagnetic iron oxide nanoparticles, which are negatively charged, thus partly neutralizing the positive charge of the PEIs and decreasing the chances of incurring irreversible damage. The non-uniform magnetic field induced PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes to gather into masses or bands, and be distributed along with the lines of magnetic force (Fig. 4b), thereby causing severe damage to parts of the cell membrane and even cell death due to the excessively high number of positive charges [40]. In contrast, PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes were uniformly distributed across the uniform magnetic field, thereby decreasing the accumulation of positive charges and reducing the cytotoxicity.

Nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts than nanoparticles without pDNA; this may be attributed to the negatively charged pDNA partially neutralize the surface positive potential of the cationic nanoparticles at the beginning of magnetofection progress. Moghimi SM et al. concluded that PEI-induced cellular toxicity could been defined as a two-stage process, with the first stage taking place within 30 min of PEI uptake [41]. Stage-one toxicity has been defined as necrosis that is based on compromise of cell membrane integrity mediated by PEI binding to negatively charged plasma membrane proteoglycans, with highly cationic NPs being extremely cytotoxic [42]. After internalized by MG-63 osteoblast, different nanoparticles exhibits similar cytotoxic mechanisms, internalization leads to proton buffering, osmotic pressure, and eventual lysis of lysosomal membranes, releasing hydrolytic enzymes and other lysosomal constituents into the cytoplasm [43].

Cellular Uptake of PEI-SPIO-NPs/pDNA Complexes

To better understand the intracellular distribution of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes or PEI-NPs/pDNA complexes and the relationship between intracellular uptake of complexes and transfection efficiency, a laser scanning confocal microscope was used to trace the magnetized RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes and non-magnetized RBITC-PEI-NPs/pDNA complexes during transfection of MG-63 cells. LysoTracker Green D26 is a specific marker for lysosomes, and Hoechst 33342 specifically stains nuclei. Overlapping green and red fluorescence, which yields yellow fluorescence, represents colocalization and indicates entrapment of polyplexes in lysosome.

Figure 6 shows that extensive co-localization was observed at 6 h post-transfection, which indicates that most of the complexes were entrapped in endosomes. The RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed a higher frequency of co-localization than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group (arrow). At 12 h post-transfection, most of the red fluorescence had already translocated from the green fluorescence of lysosomes to the surrounding blue fluorescence of nuclei, and some green fluorescence of gene expression was visible in the cytoplasm, which indicated that most complexes escaped the endosomes via the proton sponge effect [44, 45] (arrow). The fluorescent signals of the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group were more distinct than those of the RBITC-SPIO-PEI-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group. It was interesting that the cytoplasm emitted green fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, which indicated expression of GFP, thereby illustrating the proton sponge effect that facilitates gene expression. At 12 h post-transfection, some nuclei emitted red fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, indicating that complexes had been transported into nuclei, which may be attributable to the mechanical effect of magnetofection (arrow). At 24 h post-transfection, the green fluorescence in the cytoplasm showed maximal levels, the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed more intense green fluorescence than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field and the PBITC-PEI-NPs group (arrow). The affiliated magnetic field enabled the magnetic nanoparticles to attach rapidly to the cell membrane and accelerate intracellular uptake of magnetic nanoparticles. By contrast, up to 100% of these cells will have vector particles bound to their surfaces within a few minutes in the presence of the novel uniform magnetic field; more vectors adherence leads to a greater probability of cellular uptake, and transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [46].

Intracellular tracking of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes in the presence of uniform magnetic field (uniform MF) or non-uniform magnetic field (non-uniform MF) and PEI-NPs/pDNA complexes without magnetic field (No MF) at 6, 12, and 24 h post-transfection to MG-63 osteoblasts. Confocal images were obtained from three channels and overlaid:red indicates RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes (excitation:554 nm; emission:576 nm), green represents lysosomes stained with Lysotracker-DND26 and the homogeneous green in the cytoplasm implies GFP expression (excitation:443 nm; emission:505 nm), blue signifies the nuclei stained by the Hochest 33342. (excitation:359 nm; emission:461 nm)

In Vitro Transfection

Because PEI-SPIO-NPs are endowed with promising attributes such as pDNA condensation ability and high cell viability, we next used it as a gene carrier to determine the role of novel uniform and non-uniform magnetic fields on transfection efficiency. To evaluate the effectiveness of magnetofection, we selected the MG-63 osteosarcoma cell line as target cells and used GFP-pDNA as the reporter gene.

GFP expression was observed by inverted fluorescence microscopy at 24 h post-transfection. Figure 7a shows that the PEI-SPIO-NPs/pDNA group yielded significantly higher transfection efficiencies than the PEI-NPs/pDNA group in the presence of the uniform or non-uniform magnetic field, which is obvious in the uniform magnetic field group (P  < 0.05), the transfection efficiency of the uniform magnetic field group was 42.1%, which is roughly two times higher than that of the non-uniform magnetic field group. Although PolyMag-200/pDNA showed high transfection efficiency and has been confirmed to transfect most adherent cell lines, it is also highly cytotoxic. The cells were collected for flow cytometry at 48 h post-transfection (Fig. 7b), and the statistical analysis results were in agreement with the findings from fluorescence microscopy (Fig. 7c).

MG-63 osteoblasts transfected with PEI-SPIO-NPs/pDNA or PEI-NPs/pDNA under the condition of no magnetic field, non-uniform magnetic field, or uniform magnetic field. GFP-pDNA was used for reporter gene in combination with PEI-NPs or PEI-SPIO-NPs (N/P = 10), and the cells were exposed to the non-uniform or uniform magnetic fields for 20 min. At 24-h post-transfection, cell images were captured under an inverted fluorescent microscope. PolyMag-200 comprise commercial magnetic transfection reagents that were used as positive control, naked pDNA was used as the negative control. een At × 40 magnification in an inverted fluorescent microscope. b Transfection efficiency was calculated by flow cytometer and c statistical analysis of the transfection efficiency of PEI-SPIO-NPs/pDNA group, PolyMag-200/pDNA group and PEI-NPs/pDNA group. The results are expressed as the mean ± SD (n  = 5, one-way ANOVA, *P  < 0.05, **P  < 0.01)

The mechanism underlying the increase in transfection efficiency by magnetofection is currently unclear. Previous studies have demonstrated that magnetofection does not involve magnetic nanoparticles being pulled directly into the cells by the magnetic field, magnetic nanoparticles enter cells via endocytosis and remain intact upon cellular uptake [47]. The observed significant increase in transfection efficiency may be due to the synergistic effect of accelerated sedimentation and fast internalization [48, 49]. The number of magnetic complexes that enter each cell apparently influences pDNA content. Although genes must still escape endosomes before transcription, transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [50], branched PEIs showed a higher uptake rate. However, once inside the cell, lysosomal escape becomes the key to transfection, especially with higher N/P ratios, and linear PEIs showed higher rates of lysosomal escape [51,52,53]. Because of the magnetic force, PEI-SPIO-NPs can quickly come in close contact with cell membranes, which to some extent, increases the uptake capability of complexes. Once the complexes are inside the cell, PEIs provide a structural advantage and facilitate timely release of pDNA, which is eventually expressed by the cells.