Blootstelling aan titaniumdioxide-nanodeeltjes tijdens de zwangerschap Veranderde maternale darmmicrobiota en verhoogde bloedglucose van ratten

Resultaten en discussie

Kenmerken van TiO₂ NP's

De belangrijkste kenmerken van TiO₂ NP's werden gemeten en gepresenteerd vóór dierstudies. Afbeelding 1b toonde een gezichtsveld van TiO₂ NP's onder elektronische transmissiemicroscoop. De morfologie van TiO₂ NPs was bijna bol met een primaire diameter van ongeveer 21 nm. De gemiddelde hydrodynamische diameter was ongeveer 199,5 nm in methylcellulose-oplossing (figuur 1c). De zuiverheid van TiO₂ NP's is ≥ 99,5% en de oppervlakte is 35-65 m ² /g volgens het rapport van de fabrikant. Recente onderzoeken hebben aangetoond dat TiO₂ . van zowel nano- als fijne kwaliteit zou de bloedglucosespiegel van volwassen dieren na orale blootstelling kunnen verhogen [11, 16], en of de bloedglucose van de drachtige vrouwtjes zou worden beïnvloed, was niet bekend. Om deze vraag en de onderliggende mechanismen duidelijk te maken, hebben we het blootstellingsmodel voor zwangerschap bij ratten opgesteld om de toxiciteit van TiO₂ te evalueren. NP's en om de schade aan zwangere ratten te onderzoeken.

De meeste TiO₂ deeltjes in producten hebben een primaire grootte van voornamelijk 60 tot 300 nm, de minderheid (~ 20%) was < 100 nm [17], terwijl recent onderzoek aantoonde dat de hoeveelheid TiO₂ NP's in sommige voedingsmiddelen zijn veel groter dan we wisten (~  90%), bijvoorbeeld kauwgom [18]. Zoals bekend hadden kleinere nanodeeltjes een hogere toxiciteit [19, 20], en de vrouwtjes waren tijdens de zwangerschap gevoeliger voor schadelijke substraten, dus het minderheidsdeel van TiO₂ NP's kunnen niet-verwaarloosbare effecten hebben op zwangere vrouwen dan de meeste fijne deeltjes. In deze studie hebben we het zwangere rattenmodel blootgesteld aan TiO₂ . in nanoformaat (~ 21 nm) om de potentiële risico's van TiO₂ . te bestuderen NP's voor zwangere vrouwen.

Bacteriëndiversiteit verandert tijdens normale zwangerschap

Tijdens de dracht worden zwangere vrouwtjes gevoeliger voor fysieke en chemische blootstelling; om de effecten van handmatige bediening op de implantatie van bevruchte eicellen te verminderen, werd de 5e dag gekozen als de eerste dag van blootstelling wanneer de blastula's klaar waren met implanteren. GD 17 is de laatste dag voor de bevalling en GD 10 is de middenzwangerschap. De normale dynamiek van het darmmicrobioom tijdens de zwangerschap werd onderzocht met behulp van fecale monsters van drie tijdstippen van controlegroepen (GD 0, GD 10 en GD 17). We hebben de alfa-diversiteit van het darmmicrobioom in de loop van de tijd waargenomen door Shannon-, Simpson- en Chao1-indexen te berekenen, maar het verschil was niet significant (figuur 2a). Op basis van niet-metrische multidimensionale schaalanalyse (NMDS) werd ook geen duidelijk verschil gevonden in monsters van verschillende tijdstippen (figuur 2b), wat consistent was met eerdere onderzoeken [21, 22]. Het Venn-diagram (Fig. 2c) toonde de gedeelde en specifieke operationele taxonomische eenheden (OTU's) in steekproeven van verschillende tijdstippen, en de gedeelde OTU's van drie tijdstippen (GD 0, GD 10, GD 17) in controlegroepen was 164; deze resultaten gaven aan dat het aantal specifieke OTU's tijdens de zwangerschap met de tijd toenam. Onze resultaten toonden aan dat de darmmicrobiota geen significante verandering vertoonde tijdens een normale zwangerschap, en de veranderingen zullen geen nadelige effecten hebben en zelfs gunstig zijn voor de moeder. Onze resultaten suggereerden dat de verandering van de darmmicrobiota het resultaat zou kunnen zijn van het zwangerschapsproces, dat kan worden veroorzaakt door hormonale veranderingen van zwangere vrouwen [23], vergelijkbaar met veranderingen in de vaginale flora tijdens de zwangerschap [24]. Het kan ook een voorwaarde zijn voor een normale zwangerschap.

Veranderingen in de kenmerken van de darmflora bij controle (niet-blootgestelde) ratten in de loop van een normale zwangerschap. een Alfa-diversiteit van darmmicrobioom onthuld door Shannon, Simpson en Chao1-index. b De bèta-diversiteit werd onthuld door niet-metrische multi-dimensionale schaling (NMDS) analyse. c De unieke en gedeelde operationele taxonomische eenheden (OTU's) nummers werden gepresenteerd in Venn-diagram. D0 Ctrl betekent ratten in de controlegroep vóór de paring, d10 Ctrl en d17 Ctrl betekent de controleratten in respectievelijk GD 10 en GD 17

Bacteriëndiversiteit verandert na blootstelling aan TiO₂ NP's tijdens de zwangerschap

Studies hebben aangetoond dat de darmflora cruciaal is voor het behoud van een normale immuniteitssituatie [25]; een natuurlijke verandering van de darmflora tijdens een normale zwangerschap kan het immuunsysteem reguleren om de implantatie van bevruchte eicellen te accepteren [26]. Ondertussen kan de natuurlijke verandering van de darmflora tijdens een normale zwangerschap de zwangere vrouwen ook helpen zich aan te passen aan de metabolische veranderingen tijdens de zwangerschap. Zodra de verandering van de darmflora een "juiste mate" overschrijdt, kan een nadelige zwangerschapsuitkomst ontstaan. Dus analyseerden we de microbiota-veranderingen na TiO₂ Blootstelling aan NP's in het volgende deel. De effecten van TiO₂ NP's op de diversiteit van bacteriën tijdens de zwangerschap werden geëvalueerd door alfa- en bèta-diversiteit te analyseren bij GD 0, GD10 en GD17 nadat vrouwen waren blootgesteld aan nanodeeltjes. De resultaten toonden aan dat de alfadiversiteit een stijgende trend liet zien in Shannon, en een significante verandering in de Simpson-index (P <-0,05) in vergelijking met een normale zwangerschap, maar geen verschil in Chao1 (Fig. 3a). De NMDS-analyse (Fig. 3b) toonde ook geen significant verschil zoals bij een normale zwangerschap, maar na blootstelling aan TiO₂ NP's, de specifieke OTU's in monsters namen af ​​tijdens de middelste en late zwangerschap (figuur 3c). Tijdens een normale zwangerschap was er geen duidelijke verandering in de diversiteit van de darmflora, maar we zagen een toenemende trend van bacteriële diversiteit in maternale uitwerpselen nadat vrouwelijke muizen waren blootgesteld aan TiO₂ NP's tijdens de zwangerschap, die te wijten kunnen zijn aan TiO₂ NP's zijn een zeer efficiënt antibacterieel middel en kunnen vele soorten bacteriën doden; ze remden de dominante bacteriën in de darm en de oorspronkelijk onderdrukte bacteriën konden zich onder deze voorwaarde voortplanten. Studies gaven aan dat de darmflora werd geassocieerd met veel ziekten, waaronder diabetes, obesitas, hypertensie [27] en kanker [28]; het verband tussen darmmicrobiota en zwangerschapsdiabetes was ook bevestigd [29]. De reden waarom er geen significante verandering tussen GD 0, GD10 en GD17 werd waargenomen na blootstelling kan zijn dat TiO₂ NP's waren "relatief veilig" of de microbiota-veranderingen veroorzaakt door TiO₂ Blootstelling aan NP's kan worden gedekt door de aan zwangerschap gerelateerde microbiota-veranderingen.

Veranderingen in de kenmerken van de darmflora bij blootgestelde ratten in de loop van de zwangerschap. een De alfa-diversiteit van het darmmicrobioom onthuld door Shannon, Simpson en Chao1-index. b De bèta-diversiteit werd onthuld door NMDS-analyse. c De unieke en gedeelde OTU's-nummers werden gepresenteerd in een Venn-diagram. D0-test betekent monsters die zijn verzameld van ratten vóór blootstelling aan TiO₂ NP's, d10-test en d17-test betekent monsters verzameld van blootgestelde ratten bij respectievelijk GD 10 en GD 17

Darmmicrobiota-veranderingen in tweede trimester na blootstelling aan TiO₂ NP's

Om de effecten van zwangerschap uit te sluiten en meer te weten te komen over de onafhankelijke effecten van TiO₂ NP's op darmmicrobiota, vergeleken we de verschillen van darmmicrobioom tussen controlegroep en behandelingsgroep met behulp van monsters verzameld uit het tweede trimester (GD 10). Er werd geen significant verschil in alfadiversiteit gevonden volgens de Shannon-, Simpson- en Chao1-indexen (figuur 4a). Een opmerkelijk onderscheid werd waargenomen tussen de twee groepen op basis van NMDS-analyse (Fig. 4b). Figuur 4c toonde aan dat blootstelling aan TiO₂ NP's leidden tot de veranderingen van sommige specifieke OTU's in de behandelingsgroep in vergelijking met de controle (Venn). Deze resultaten toonden aan dat TiO₂ NP's waren relatief veilig en zullen geen duidelijke dysbacteriose veroorzaken. Maar de florasamenstelling, namelijk de overvloed aan specifieke geslachten, veranderde respectievelijk in het tweede trimester en de late zwangerschapsfase. Om meer te weten te komen over de mogelijke risico's van de veranderingen die zich tijdens de zwangerschap hebben voorgedaan en om te onderzoeken welke nadelige effecten kunnen optreden, hebben we de functionele veranderingen van de darmmicrobiota geïdentificeerd met bio-informatica. De resultaten toonden aan dat twee dominante biomarkers, Ellin6075 en Clostridiales, werden gevonden door LefSe-analyse (lineaire discriminantanalyse (LDA)> 2). De overvloed aan Ellin6075 was verminderd en Clostridiales was verhoogd na TiO₂ NP's blootstelling respectievelijk (Fig. 4d). Ellin6075 werd geïsoleerd van een Australische boerderij, maar er was weinig informatie beschikbaar over de fenotypische eigenschappen of functies, dus hun effecten op de zwangerschap moeten verder worden onderzocht. Yan en zijn collega's toonden aan dat Clostridium significant toenam bij SD-ratten met obesitas [30], wat consistent was met onze bevinding dat Clostridium samen bestond met een hoge bloedglucosespiegel. Om de effecten van verandering van de darmmicrobiota op de zwangerschap te onthullen, voorspelden we de genverschillen in fecale monsters met behulp van fylogenetisch onderzoek van gemeenschappen door reconstructie van niet-geobserveerde toestanden (PICRUSt) (Fig. 4e), en ontdekten we dat genen over type 2 diabetes mellitus-gerelateerde functie en lipide-biosynthese-eiwitten werden versterkt in de behandelingsgroep, terwijl het metabolisme van taurine en hypotaurine was verzwakt. Onderzoekers hadden aangetoond dat de darmflora vetzuur met een korte keten kan genereren, waaronder azijnzuur en propionzuur, en op zijn beurt de bloedglucose van de gastheer kan reguleren [31]. En de verandering van taurine en hypotaurine was ook in overeenstemming met het feit dat taurine de maternale bloedglucoseconcentraties kon verlagen [32].

Veranderingen in de kenmerken van darmmicrobiota tussen controleratten en TiO₂ NP blootgestelde ratten bij GD 10. a , b Alfa- en bèta-diversiteit van het darmmicrobioom werden gepresenteerd als Shannon-, Simpson- en Chao1-index, evenals NMDS-analyse. c Venn-diagram toonde de OTU-kenmerken. d , e Dominante biomarkers en gerelateerde genfuncties werden gevonden door respectievelijk Lefse en fylogenetisch onderzoek van gemeenschappen door voorspelling van reconstructie van niet-geobserveerde toestanden (PICRUSt). D10 Ctrl betekent de controleratten bij GD 10, d10 Test betekent de blootstellingsratten in GD 10

Darmmicrobiota-veranderingen in de late zwangerschap na blootstelling aan TiO₂ NP's

Het darmmicrobioom van de late zwangerschap werd onderzocht door fecale monsters verzameld op GD17. Er werd geen significant verschil gevonden in alfa-diversiteit (Fig. 5a). Deze monsters werden significant gedistribueerd door controle- en behandelingsgroep in het NMDS-model (figuur 5b). Zoals getoond in Fig. 5c, werd een verminderd aantal waargenomen OTU's gevonden in de behandelingsgroep. We gebruikten ook Lefse om potentiële biomarkers te identificeren. Met name, zoals getoond in Fig. 5d, nam de aanhoudende overvloed aan Ellin6075 af in de behandelingsgroep tijdens de late zwangerschap (LDA > 2), en de overvloed aan Dehalobacteriaceae werd verminderd door blootstelling aan TiO₂ Ook NP's (LDA > 2). In dit stadium werden de diabetes mellitus-gerelateerde genveranderingen niet waargenomen, wat suggereerde dat het tweede trimester, in plaats van het late trimester, het gevoelige venster was voor TiO₂ NP's om de maternale bloedglucose te verhogen. En het resultaat was in overeenstemming met onze klinische erkenning dat onze artsen de orale glucosetolerantietest (OGTT), een veel voorkomende diagnose van zwangerschapsdiabetes bij de mens, hebben uitgevoerd om zwangerschapsdiabetes bij zwangere vrouwen te screenen in het tweede trimester (ongeveer 26e week in zwangere vrouw). De resultaten toonden aan dat de nuchtere bloedglucose was gestegen op GD 10 nadat de zwangere ratten waren blootgesteld aan TiO₂ NP's, en is voorafgaand aan een eerder gerapporteerd resultaat (~ 12 weken) bij volwassen dieren [11], wat aantoonde dat zwangere vrouwtjes gevoeliger waren dan volwassenen.

Veranderingen in de kenmerken van darmmicrobiota tussen controleratten en TiO₂ NP blootgestelde ratten bij GD 17. a Shannon, Simpson en Chao1-index die alfadiversiteit presenteerde, werden vergeleken tussen twee groepen. b De bèta-diversiteit werd onthuld door NMDS-analyse. c Het Venn-diagram met de unieke en gedeelde OTU's in twee groepen. d Lefse vond de kandidaat-biomarkers (LDA > 2) en de verschillen in genfuncties werden voorspeld. e De nuchtere bloedglucosespiegels van ratten werden gemeten bij GD 0, GD 10 en GD 17 na blootstelling aan TiO₂ NP's. D17 Ctrl- en d17-test betekent respectievelijk de controle- en blootgestelde ratten op de 17e dag van de dracht

De effecten van TiO₂ NP's op bloedglucose na prenatale blootstelling

Om de resultaten van de PICRUST-voorspelling te bewijzen, hebben we de nuchtere bloedglucose van de ratten gemeten bij respectievelijk GD10 en GD17. Nadat de drachtige ratten waren blootgesteld aan TiO₂ NP's gedurende 12 dagen (GD5-GD17), werden de nuchtere bloedglucosewaarden gemeten. Zoals getoond in Fig. 5e, vergeleken met de controlegroep, stegen de nuchtere glucosespiegels van de ratten significant bij zowel GD10 (P < 0.05) en GD17 (P < 0.01) na blootstelling aan TiO₂ NP's, wat in overeenstemming was met de eerdere rapporten dat TiO₂ NP's zouden de bloedglucosespiegel van volwassen dieren kunnen verhogen [11, 33]. Maar de waardetoename tussen de controlegroep en GD 17 was relatief klein (~  0,5 mM) en bereikte niet de standaard van zwangerschapsdiabetes [34]. De resultaten suggereerden dat moeders solitair blootgesteld aan TiO₂ NP's tijdens de dracht zijn niet voldoende om zwangerschapsdiabetes te veroorzaken, maar de verhoogde bloedglucose kan nadelige effecten hebben op de zwangere vrouwen en hun nakomelingen. En er werd gemeld dat maternale blootstelling aan hogere bloedglucose tijdens de zwangerschap het risico op obesitas en abnormale glucosetolerantie van foetussen zou kunnen verhogen [35], wat ons er ook aan herinnerde dat TiO₂ NP's kunnen potentiële risico's voor het nageslacht met zich meebrengen.