Antimicrobiële en cytotoxiciteitseffecten van gesynthetiseerde zilveren nanodeeltjes van Punica granatum-schilextract

Resultaten en discussie

De AgNP's werden met succes gesynthetiseerd met behulp van het waterige extract van granaatappelschil als bron van reductiemiddel. Afbeelding 1a toont 0,1 mM zilvernitraat opgelost in 250 ml DDH₂ O om een ​​kleurloze oplossing te maken. Vervolgens werd 10 ml waterig schilextract toegevoegd en goed gemengd, en het reactiemengsel veranderde langzaam in een donkerbruine kleur gedurende 24 uur, zoals te zien is in figuur 1b. De kleurverandering die werd waargenomen tijdens de synthese van AgNP's is gemeld voor vergelijkbare reacties wanneer verschillende soorten extracten van plantendelen zoals bladeren, bloemen, schillen, zaden en fruit worden gebruikt. De kleurverandering was te wijten aan AgNO₃ interactie met plantaardige bronnen en wordt gereduceerd van zilvernitraat tot elementair zilver [18,19,20,21,22].

een 0,1 mM zilvernitraat. b Kleur verandert na P. granatum schilextract toegevoegd

Figuur 2 toont het UV-Vis-spectrum van AgNP's die zijn gesynthetiseerd met waterig extract van granaatappelschil. Zoals weergegeven in figuur 2 heeft de absorptieband een piek bij 378 nm bij reactietijden van 24, 48 en 72 uur met intensiteiten van respectievelijk 0,96, 1,08 en 1,16. De intensiteit nam met de tijd toe, omdat de reactie meer tijd had om op te treden, wat leidde tot hogere concentraties AgNP's. De oppervlakte-plasmonresonantiegegevens toonden aan dat toenemende concentraties van AgNP's leidden tot toenemende AgNP-pieken, samenvallend met verhoogde hoeveelheden verminderd zilver in de loop van de tijd. Als AgNO₃ reageerde om AgNP's te vormen vanwege het vrijkomen van elektronen uit het granaatappelextract, een gelijktijdige reactie begon om ascorbaatradicalen te oxideren. Een vergelijkbaar UV-Vis-absorptiespectrum werd waargenomen in een ander onderzoek dat AgNP's produceerde uit granaatappelschilextract, met een absorptiepiek bij 371 nm [23].

UV-Vis-absorptiespectra van gesynthetiseerde AgNP's met intervallen van 48 tot 72 uur

Het XRD-patroon van groen-gesynthetiseerde AgNP's wordt getoond in Fig. 3. Zes intense diffractiepieken worden waargenomen bij 2θ waarden variërend van 0 tot 90, wat aangeeft dat we de 111, 200, 220 en 311 vlakken van een tegenoverliggende kubus kunnen toewijzen aan een centraal Ag-ion. Het XRD-spectrum suggereert dat de gesynthetiseerde AgNP's zich vormden tot een kristallijne structuur. Dit resultaat komt overeen met XRD-patronen die eerder zijn gepubliceerd in de JCPDS-database (nr. 04-0783). De ongeïdentificeerde kristallijne pieken (*) die zijn waargenomen, komen overeen met zilveroxiden [24]. Een TEM-beeld van 0,1 mM waterige granaatappelschil NP's wordt getoond in Fig. 4. Deze afbeelding liet zien dat deeltjes bolvormig waren met een diameter van 20 tot 40 nm, met een gemiddelde deeltjesgrootte van 26,95 nm. Soortgelijke rapporten zijn gemaakt met betrekking tot de nanosynthese van NP's met behulp van Actinidia deliciosa fruitextract [25]. De SEM-waarnemingen van de gesynthetiseerde AgNP's (Fig. 5) tonen een gelijke verdeling van zilveren nanodeeltjes op het oppervlak van granaatappelschilcellen. Uit deze afbeelding werd vastgesteld dat de nanodeeltjes bolvormig zijn, met een diameter van 20 tot 40 nm, wat vergelijkbaar is met een eerder rapport van bolvormige AgNP's met een diameter van 34 tot 50 nm, geproduceerd met behulp van Raphanus sativus L. schilextract [26].

XRD-patroon van gesynthetiseerde AgNP's van P. granatum schil extract

TEM-afbeelding van gesynthetiseerde AgNP's van P. granatum schil extract

SEM-beeld van gesynthetiseerde AgNP's van P. granatum schil extract

In de fytosynthese van zilveren nanodeeltjes met behulp van het hier gepresenteerde extract van de granaatappelschil, is de grootte van de verkregen nanodeeltjes veelbelovend voor medicijnafgifte. De grootte van de nanodeeltjes van minder dan 100 nm speelt naar verluidt een rol bij de ontwikkeling van slimme systemen, waardoor de therapeutische en beeldvormende waarden en medicijnafgifte aan specifieke weefsels worden verbeterd om therapie met gecontroleerde afgifte te bieden [27]. De grootte en vorm van de nanodeeltjes beïnvloedt de biologische beschikbaarheid van het geneesmiddel in doelweefsels. Nanodeeltjes die 100 nm zijn, vertonen naar verluidt een 2,5 keer grotere opname in vergelijking met deeltjes met een diameter van 1 μm [28, 29]. De grootte van de nanodeeltjes speelt een sleutelrol in de deeltjesfunctie, zoals degradatie, vasculaire dynamica, targeting, klaring en opnamemechanismen [30]. Bovendien verbetert de nanokristallijne aard van de gesynthetiseerde AgNP's de biodistributie en farmacokinetiek zoals gerapporteerd [31, 32]. Het gebruik van bioafval van granaatappel zal een nieuwe benadering van afvalgebruik zijn, zoals eerder gemeld [33].

Gegevens uit het EDX-onderzoek leverden een kwalitatieve en kwantitatieve analyse op van de elementen die in de gesynthetiseerde nanodeeltjes worden gevonden, zoals weergegeven in figuur 6. Het EDX-onderzoek gaf een elementaire uitsplitsing van de inhoud van de gesynthetiseerde NP's en schatte dat de NP's voor 70% bestonden. Ag op gewicht. Andere elementen en bindingen die in de resultaten werden geïdentificeerd, waren C-K, O, C-U, Cu en K, die elk overeenkwamen met een klein percentage van de totale massa. Het EDX-rapport levert bewijs dat de lage concentratie van 0,1 mM AgNO₃ resulteerde in grote aantallen gesynthetiseerde AgNP's. Vergelijkbare resultaten werden gerapporteerd voor 0,3 mM AgNO₃ dat werd 3 uur in gedestilleerd water gegoten en verwarmd tot 300 ° C, en voor 1, 2 en 3 g granaatappelschilextract gemengd met 30 ml gedestilleerd water en verwarmd tot 80 ° C [34].

EDX-beeld van gesynthetiseerde AgNP's van P. granatum schilextract met kwantitatieve analyse

De antibacteriële eigenschappen van de door granaatappel gesynthetiseerde AgNP's werden onderzocht met behulp van 25, 50, 75 en 100 μg / ml-monsters tegen zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën via de agarwell-diffusietest. Agarplaten met de Gram-negatieve bacteriën E. coli , S. typhi , en P. aeruginosa en de remzones worden getoond in Fig. 7a-c. Lage concentraties van door granaatappel gesynthetiseerde AgNP's (25 en 50 L) vertoonden remmende activiteit tegen P. aeruginosa en E. coli maar niet tegen S. typhi. Vergelijkbare antimicrobiële effecten van granaatappelproducten zijn eerder gemeld, waarbij de sterkste remmingen werden waargenomen voor E. coli , S. aureus , en P. aeruginosa [35,36,37].

Antimicrobiële effecten en remmingszone van AgNP's van Gram-negatieve pathogenen (a –c )

Antimicrobiële effecten en remmingszone van AgNP's van Gram-positieve pathogenen (d –f )

Figuur 8a–c toont de antimicrobiële activiteit van gesynthetiseerde AgNP's tegen de Gram-positieve pathogenen K. longontsteking , S. aureus , en S. opperhuid . Antimicrobiële activiteit werd zelfs waargenomen bij lage AgNP-concentraties (25 en 50 μL) voor K. longontsteking, met remzones van respectievelijk 9 en 14 nm en tegen S. aureus , met remzones van respectievelijk 6 en 14 nm. Eerdere studies bevestigden ook de groeiremming van Gram-positieve bacteriën die werden behandeld met gesynthetiseerde NP's [35,36,37,38]. De antibacteriële activiteit die werd geëvalueerd na blootstelling aan gesynthetiseerde AgNP's, vertoonde remmingszones in het bereik van 7 tot 21 mm. Afbeelding 9 geeft de remmende effecten weer van verschillende concentraties (25 tot 100 μL) van P. granatum schil AgNP's op E. coli , P. aeruginosa , S. typhi , K. longontsteking , S. aureus , en S. opperhuid . Zelfs bij lage concentraties AgNP's werd een goede antibacteriële activiteit waargenomen voor alle microben, behalve S. typhi , zoals eerder gemeld [38].

Om de cytotoxische effecten van AgNP's te analyseren, werd een colonkankercellijn (RKO:ATCC® CRL-2577™) gebruikt. Op dag 3 vonden we een levensvatbaarheid van 56% met een behandeling van 12,5 g en een levensvatbaarheid van 61% op dag 5. De algehele significante verminderingen in proliferatie werden waargenomen bij> -12,5 μg (Fig. 10a), en het was consistent op dag 5. Bovendien bevestigden AO / EtBr-gekleurde afbeeldingen de vermindering van de proliferatie door het visualiseren van kolonies en celaantallen (Fig. 10b). Interessant is dat we cellen konden observeren met perinucleaire cytoplasmatische vacuolen bij 12,5 μg (Fig. 10b, c); dit proces kan een afbraakroute zijn in lysosomen in het proces van autofagie voor het verbeteren van geprogrammeerde celdood. Er zijn echter verdere studies nodig om het effect van AgNP op autofagiefuncties te bevestigen. In onze vorige studie over AgNP's gesynthetiseerd met behulp van Pimpinella anisum zaden, ontdekten we ook dat 12 μg AgNP's toxisch was voor HCT116-cellen door apoptose of necrose te versterken [12]. Er werd ook gemeld dat een lage concentratie AgNP's apoptose zou kunnen induceren [39]. De huidige experimenten met AgNP's gesynthetiseerd met Punica granatum schilextract vertoonde ook 55-62% toxiciteit met 12,5 μg. Bovendien onthulde AO/EtBr-kleuring een duidelijk beeld van geprogrammeerde celdood via autofagie.

Antimicrobiële activiteit van AgNP's tegen Gram-negatieve en Gram-positieve pathogenen

Cytotoxiciteit van AgNP's. een Celproliferatie en levensvatbaarheidsanalyse op RKO-cellen. Eenrichtings-ANOVA meerdere vergelijkingen, ***P < 0,0005. b Apoptose/necrose-analyse op RKO-cellen. c RKO-cellen blootgesteld aan verschillende doses AgNP's