Anti-tumoronderzoek van chondroïtinesulfaat-methotrexaat-nanogels

Abstract

Zelfassemblage nanogels (NG's) werden gevormd door bioconjugering van methotrexaat (MTX) met chondroïtinesulfaat (CS). MTX-CS NG's kunnen de oplosbaarheid en de afgifte-efficiëntie van MTX aanzienlijk verbeteren vanwege de CD44-bindende eigenschap van CS. Vivo-experimenten onthulden dat MTX-CS NG's minder toxiciteit vertoonden dan MTX. MTX-CS NG's kunnen het antitumoreffect verbeteren en de bijwerkingen van MTX verminderen. Vanwege hun CD44-bindende eigenschap kunnen chondroïtinesulfaat-geneesmiddelconjugaten een veelbelovend en efficiënt platform zijn voor het verbeteren van de oplosbaarheid van slecht oplosbare geneesmiddelmoleculen en voor gerichte afgifte aan kankercellen en tumorweefsels.

Achtergrond

Methotrexaat (4-amino-10-methylfoliumzuur, MTX) is een folaatanalogon, behorend tot de familie van antifolaatantimetabolieten [1]. MTX was het eerste medicijn dat vanaf de jaren vijftig werd gebruikt bij tumortherapie [2], een mutageen en teratogeen antitumormiddel dat werkt door de enzymactiviteit te blokkeren en de DNA-synthese te verstoren [3]. Eerdere studies hebben aangetoond dat de toediening van chemotherapiemedicijnen aan de doelcel alleen niet voldoende is om celdood te induceren, en een hoge dosis MTX kan het genezingspercentage en de prognose van patiënten aanzienlijk verbeteren [4]. Lage oplosbaarheid in water, lage permeabiliteit en korte halfwaardetijd van MTX beperken de klinische toepassing ervan [5, 6]. Het effect van chemotherapie van MTX wordt grotendeels beïnvloed door de lage opname door tumorcellen, de biodistributie van weefsels en ernstige bijwerkingen [7]. Een hogere concentratie MTX kan echter het risico op bijwerkingen verhogen vanwege de slechte biologische beschikbaarheid van MTX [8]. Er is dringend behoefte aan de ontwikkeling van een nieuw medicijnafgiftesysteem om de biologische beschikbaarheid van MTX te verbeteren en de bijwerkingen ervan te verminderen.

Nanotechnologie heeft voordelen in medicijnafgiftesystemen, waaronder het verbeteren van de medicijnstabiliteit, het verlengen van de bloedcirculatie, het verminderen van bijwerkingen en het beheersen van de medicijnafgifte [9,10,11,12,13,14,15]. Zelfassemblagetechnologie is op grote schaal gebruikt op het gebied van medicijnafgifte om de werkzaamheid te verbeteren en de nadelige effecten van medicijnen te verminderen [16,17,18,19,20]. Onze studie heeft tot doel een nanogel-medicijnafgiftesysteem voor MTX te ontwerpen om de oplosbaarheid en biodistributie te verbeteren en de bijwerking ervan te verminderen. Chondroïtinesulfaat (CS) is een zuur glycosaminoglycaan (GAG), dat een belangrijk onderdeel vormt van kraakbeen, bloedvatwanden, huid, pezen en ander bindweefsel [21]. Nanogels op basis van chondroïtinesulfaat zijn eerder onderzocht [22, 23]. Studies hebben aangetoond dat CD44 een CS-proteoglycaan bindt [24,25,26]. CD44 is een transmembraanglycoproteïne met extracellulaire domeinen en is betrokken bij het bemiddelen van cel-cel- en cel-ECM-interacties en speelt een rol bij celmigratie [27]. CD44 wordt sterk tot expressie gebracht in uitgezaaide kanker in tegenstelling tot de lage expressieniveaus in normale weefsels [28]. Nanodeeltjes op basis van CS zijn gerapporteerd voor tumortargeting en antitumormedicijnafgifte [29, 30]. Hier hebben we een nieuw type zelfassemblage CS-MTX-nanogels gefabriceerd in een poging om de gerichte afgifte van MTX-medicijnmoleculen aan kankercellen te verbeteren door middel van CS-CD44-interactie.

Methoden

Materialen en voorbeelden

Chondroïtinesulfaat werd gekocht bij Dalian Meilun Biotech Co., Ltd. (Dalian, Liaoning, China). 4-Methylmorfoline, tetrahydrofuran en 2-chloor-4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine werden gekocht bij Sun Chemical Technology (Shanghai, China) Co., Ltd., en foetaal runderserum (FBS) werd gekocht van HyClone (Utah, VS). Alle andere chemicaliën werden gekocht bij Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). De Lewis-ratten zijn gekocht bij Shanghai Sippr-BK Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China).

Synthese van DMT-MM

4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl)-4-methylmorfoliniumchloride (DMT-MM) wordt gebruikt voor dehydratatiecondensatiereacties met carbonzuuractivering die kan worden gebruikt in waterig of protonoplosmiddel systemen. Vijfentwintig gram 2-chloor-4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine (CDMT) werd opgelost in 200 ml tetrahydrofuran (THF). Vervolgens werd onder roeren 18,79 ml 4-methylmorfoline (NMM) druppelsgewijs aan de CDMT-oplossing toegevoegd. Om een volledige respons te garanderen, moet het roeren gedurende 30 minuten worden volgehouden. Vervolgens werd het gefiltreerde product driemaal gewassen met THF en 24 uur onder vacuüm gedroogd. De DMT-MM werd verkregen als een wit poeder (schema 1).

Synthetische routes bij de vorming van DMT-MM

Synthese van MTX-CS

De MTX-geconjugeerde CS werd geactiveerd door DMT-MM. Voor CS-activering werd CS (1,0 g) opgelost in 20 ml ultrapuur water en geactiveerd door toevoeging van DMT-MM (0,769 g). De reactie werd 30 min bij kamertemperatuur uitgevoerd. Vervolgens liet het geactiveerde CS gedurende 24 uur bij kamertemperatuur verder reageren met MTX. De oplossing werd 48 uur gedialyseerd met om de 4 uur ververst water en gevriesdroogd. Het MTX-CS werd verkregen als een geel poeder. Het gele poeder werd onderzocht met Fourier-transformatie-infraroodspectrometrie (ALPHA, BRUKER, VS). De FTIR-spectra zijn opgenomen van 400 tot 4000 cm⁻¹ . ¹ H-NMR werd gebruikt om te bepalen of de MTX was geconjugeerd aan CS (schema 2).

Synthetische routes bij de vorming van MTX-CS

Cytotoxiciteit van MTX-CS Nanogels

De cytotoxiciteit van de nanogels werd geanalyseerd met behulp van A549T- en Hela-tumorcellen en Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) -cultuur. De A549T- en Hela-cellen werden gezaaid in platen met 96 putjes met een dichtheid van 5 × 10³ cellen per putje in 1640, aangevuld met 10% FBS en 24 uur geïncubeerd onder 5% CO₂ bij 37 °C. De A549T werd gevolgd door behandeling met verschillende concentraties MTX-CS NG's (0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 400 μM), en de Hela werd gevolgd door behandeling met verschillende concentraties MTX- CS NG's (0, 5, 10, 30, 40, 60, 80, 100 μM) nog 48 uur. De concentraties van MTX-CS NG's waren gebaseerd op het gehalte aan MTX in elk monster. De concentraties van CS waren gebaseerd op het gehalte aan MTX-CS NG's in elk monster. De HUVEC's werden gezaaid in platen met 96 putjes met een dichtheid van 5 × 10³ cellen per putje in DMEM, aangevuld met 10% FBS en 24 uur geïncubeerd onder 5% CO₂ bij 37 °C. Aan de HUVEC werden vervolgens verschillende concentraties MTX-CS NG's toegevoegd (0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 400 M). De concentraties van MTX-CS NG's waren gebaseerd op het gehalte aan MTX in elk monster. De concentraties van CS waren gebaseerd op het gehalte aan MTX-CS NG's in elk monster. De MTT-assay is een meting van celactiviteit. Twintig microliter CCK-8-buffer werd aan elk putje toegevoegd en bij 37 °C onder 5% CO₂ geïncubeerd nog 4 uur. Het medium werd verwijderd en 200 μL DMSO werd aan elk putje toegevoegd. De absorptie werd gemeten bij een golflengte van 490 nm (570 nm als referentie) op een MULTISKAN GO Microplate-lezer (Thermo Scientific, VS).

Dier- en experimenteel ontwerp

Om de toxiciteit van MTX-CS NG's in vivo te analyseren, werden achttiende mannelijke Sprague-Dawley-ratten gekocht bij het Experimental Animal Center van de Zhejiang Academy of Medical Sciences (Hangzhou, Zhejiang, China). Die ratten werden gehuisvest onder een cyclus van 12 uur licht, 12 uur donker met vrije toegang tot water en voedsel. De ratten van 8 weken oud (200 ± 10 g) werden willekeurig verdeeld in drie groepen:controlegroep (geïnjecteerd met hetzelfde volume zoutoplossing), MTX-groep (geïnjecteerd met 1,25 μmol kg⁻¹ dag⁻¹ ) en MTX-CS NG-groep (geïnjecteerd met 25 mg kg⁻¹ dag⁻¹ MTX-CS NG's). De MTX-dosis van de MTX-CS NG-groep was gelijk aan een gratis dosis van de MTX-groep (1,25 μmol kg⁻¹ dag⁻¹ ). Medicijnen werden respectievelijk op een andere dag toegediend via intraperitoneale injecties. Na 2 weken behandeling (totaal zeven injecties) werden alle ratten gedood door onthoofding voor verder onderzoek.

Histologisch onderzoek

Na onthoofding werden de milten van alle ratten snel uitgesneden en tweemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en gefixeerd in 4% (w) /v ) paraformaldehyde (pH = 7.4) (Sigma-Aldrich, MO, VS) gedurende 24 uur. Vervolgens werden weefsels geprepareerd voor hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring met behulp van standaardprocedures en verkregen onder een hoogwaardige lichtmicroscoop.

Resultaten en discussie

Synthese van MTX-CS

Om te bepalen of de MTX was geconjugeerd aan CS, gebruikten we FTIR en ¹ H NMR om de MTX-, CS- en MTX-CS-bioconjugaatmonsters te analyseren. Figuur 1 toont de FTIR-spectra van CS (Fig. 1a), MTX (Fig. 1b) en MTX-CS-bioconjugaten (Fig. 1c). Zoals weergegeven in figuur 1b, had MTX karakteristieke transmissie bij 3355, 2951, 1646, 1600, 1540, 1493, 1403 en 1207 cm⁻¹ . De FTIR piekt op 1600 en 1540 cm⁻¹ kan worden toegewezen aan het uitrekken van para-benzeen, dat kan worden gevonden in het FTIR-spectrum van MTX (figuur 1b) en MTX-CS-bioconjugaten (figuur 1c). De FTIR-resultaten gaven aan dat MTX met succes was geconjugeerd aan CS.

een FTIR-spectrum van CS. b FTIR-spectrum van MTX. c FTIR-spectrum van MTX-CS

Afbeelding 2 toont de ¹ H NMR-spectra van CS-, MTX- en MTX-CS-bioconjugaten. De pieken bij 6,93 (2H, d, J = 10,1 Hz) en 7,84 (2H, d, J =-10,1 Hz) kan worden toegewezen aan de benzoylgroep van MTX. De pieken bij 4,90 (2H, s) kunnen worden toegewezen aan het methyleen naast de 2,4-diamino-6-pteridinylgroep, en de pieken bij 8,69 (1H, s) kunnen worden toegewezen aan de 2,4-diamino- 6-pteridinylgroep van MTX zoals figuur 2b suggereert. De ¹ H NMR van CS-MTX (Fig. 2c) suggereerde de CS (disacharide deel δ _H signalen waren tussen 3,20 en 5,40, met 5,39 toegewezen als de anomere koolstof) werd met succes gehecht aan MTX (chemische verschuiving van de benzoylgroep was 8,00 en 6,88, en de methylgroep was op 3,20). De NMR bewees ook dat MTX was geconjugeerd aan CS.

¹ H NMR-spectra van CS, MTX en CS-MTX. een ¹ H NMR-spectra van CS; CS werd opgelost in D₂ O. b ¹ H NMR-spectrum van MTX; MTX werd opgelost in dimethylsulfoxide-d6. c ¹ H NMR-spectrum van CS-MTX; CS-MTX is opgelost in D₂ O

Om de hoeveelheid MTX geconjugeerd aan CS te berekenen, werden de monsters opgelost in ultrapuur water en 48 uur bij kamertemperatuur geschud. De hoeveelheid MTX werd bepaald met behulp van een UV-vis-spectrofotometer bij 309 nm. De hoeveelheid MTX werd gemeten met UV-vis-spectroscopie. Ten slotte was de berekende hoeveelheid methotrexaat op MTX-CS NG's 13,65%. De nanogels gevormd door inkapseling van hydrofobe MTX-moleculen door de buitenste laag van hydrofiele zijketens van CS (figuur 3a). Nanogels werden gekenmerkt door dynamische lichtverstrooiing (DLS), atomaire krachtmicroscoop (AFM) en transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). Zoals weergegeven, maten DLS-gegevens de grootte van alle nanogels in het bereik van 100-400 nm (figuur 3b). De deeltjesgrootte van de nanodeeltjes is voornamelijk ongeveer 200 nm. AFM-afbeelding van nanogels bevestigde dat nanodeeltjes goed verdeeld waren met een vergelijkbare grootte van ongeveer 200 nm en morfologie (figuur 3c). TEM-afbeeldingen toonden ook aan dat de grootte van nanogels nanosferen waren met een grootte in het bereik van 200-240 nm. De deeltjesgrootte van de nanodeeltjes is voornamelijk ongeveer 200 nm (Fig. 3d, e).

Schematische weergave van de MTX-CS NG's. Dynamische lichtverstrooiing (DLS), atomic force microscope (AFM) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) karakterisering van MTX-CS NG's. een Schematische weergave van de MTX-CS NG's. b Grootte van MTX-CS NG's gemeten door DLS in representatieve experimenten. c AFM-afbeeldingen van MTX-CS NG's. d , e TEM-afbeeldingen van MTX-CS NG's

De hoeveelheid MTX werd gemeten met UV-vis-spectroscopie. Eerst werd een standaardcurve van vrije methotrexaat-UV-absorptie opgesteld (Fig. 4). De relatie tussen absorptie en vrije MTX-concentratie is:

$$ A\kern0.5em =\kern0.5em 0.0518\mathrm{C}\kern0.5em +\kern0.5em 0.0019\ \left({R}^2\kern0.5em =\kern0.5em 0.9998\right) $$

Standaardcurve van methotrexaat UV-absorptie

Vervolgens werd 28,8 mg MTX-CS opgelost in 1000 ml ultrapuur water en is de UV-absorptie 0,2055. Ten slotte was de berekende hoeveelheid methotrexaat op MTX-CS NG's 13,65%.

Cytotoxiciteit van MTX-CS Nanogels

De in vitro antitumoractiviteit van MTX-CS NG's, vrij MTX en MTX gemengd met CS werd geanalyseerd met behulp van zowel A549T- als Hela-tumorcelkweek. Zoals blijkt uit de MTT-assay (Fig. 5), konden de MTX-CS NG's de levensvatbaarheid van beide kankercellen aanzienlijk verminderen, terwijl vrij MTX bij hoge concentraties geen effecten vertoonde. MTX gemengd met CS in hoge concentratie bevordert zelfs de groei van kankercellen. De levensvatbaarheid van Hela was verlaagd van 73,81% voor gratis MTX tot 60,16% voor MTX-CS NG's (13,65% afname in cellevensvatbaarheid) bij de 10 μM geneesmiddelconcentratie (figuur 5a). Evenzo was de levensvatbaarheid van de A549T-cellen verlaagd van 80,23% voor gratis MTX tot 46,04% voor MTX-CS NG's (34,09% afname in cellevensvatbaarheid) bij de 50 M geneesmiddelconcentratie (figuur 5b). Polysachariden zoals hyaluronzuur worden gebruikt als een targeting-deel van de geneesmiddelconjugaten of nanodeeltjes voor kankertherapie, omdat het specifiek bindt aan de CD44-receptor [31]. Chondroïtinesulfaat kan ook werken als een ligand voor de CD44-receptor [25, 27], wat betekent dat CS de opname van MTX-CS NG's door kankercellen kan bevorderen en de geneesmiddeleffectiviteit van MTX kan verbeteren. Bovendien kunnen nanodeeltjes de stabiliteit van het medicijn verbeteren en de afgifte van de medicijnen regelen [32, 33]. Alle resultaten toonden aan dat de antitumoractiviteit van MTX-CS NG's beter was dan vrij MTX en MTX gemengd met CS. Met verhoogde intracellulaire afgifte-efficiëntie van MTX-medicijnmoleculen, verbeterde ook de targetingselectiviteit van MTX-CS NG's in vergelijking met dezelfde concentratie van vrij MTX. Deze resultaten tonen aan dat MTX-CS NG's een beter antitumoreffect hebben dan vrij MTX.

een Cellulaire levensvatbaarheid van A549 T in aanwezigheid van vrije MTX, vrije MTX en CS en MTX-CS NG's in 48 uur. b Cellulaire levensvatbaarheid van Hela in aanwezigheid van vrije MTX, vrije MTX en CS en MTX-CS NG's in 48 uur. c Cellulaire levensvatbaarheid van HUVEC in aanwezigheid van vrije MTX, CS en MTX-CS NG's in 48 h

Het nadelige effect van MTX-CS NG's, vrij MTX en CS werd geanalyseerd met behulp van een HUVEC-cultuur. Zoals blijkt uit de MTT-assay (Fig. 5c), zouden de MTX-CS NG's de bijwerking aanzienlijk kunnen verminderen, terwijl gratis MTX de levensvatbaarheid van HUVEC aanzienlijk zou kunnen verminderen. De levensvatbaarheid van HUVEC was verhoogd van 63,6% voor gratis MTX tot 73,5% voor MTX-CS NG's (9,9% toename in cellevensvatbaarheid) bij de 10 μM geneesmiddelconcentratie (figuur 5c). De cellevensvatbaarheid van HUVEC bij 400 μM was nog steeds 69,95%. Het resultaat gaf aan dat MTX-CS NG's de bijwerking op de normale cel zouden kunnen verminderen.

Dier- en experimenteel ontwerp

Een van de belangrijkste secundaire toxische bijwerkingen van MTX dat wordt gebruikt om kankerpatiënten te behandelen, is intestinale mucositis, die een snelle afname van het lichaamsgewicht veroorzaakt [34]. Vervolgens testten we de beschermende effecten van MTX-CS NG's tegen door chemotherapie geïnduceerd gewichtsverlies bij mannelijke Sprague-Dawley-ratten. De overleving en het gewicht werden gedurende 14 dagen na injectie van zoutoplossing, vrije MTX en MTX-CS NG's gevolgd. In geen van de drie groepen werden sterfgevallen gevonden. Een abrupte afname werd waargenomen in het lichaamsgewicht van alle MTX-groepen (1,25 μmol kg⁻¹ dag⁻¹ gedurende 14 dagen), wat duidelijk aangeeft dat de ratten chemotherapiesyndroom en chemotherapie-geïnduceerde schade ondervonden, resulterend in ziekte en verlies van lichaamsgewicht, terwijl het lichaamsgewicht van ratten die werden behandeld met MTX-CS NG's (4,25 mg kg⁻¹ dag⁻¹ gedurende 14 dagen) een lichte stijging vertoonden (Fig. 6). De resultaten laten zien dat MTX-CS NG's geen nadelige effecten veroorzaakten. Deze bevindingen ondersteunen de doelafgifte van MTX aan tumorweefsel via CD44-CS-interactie en verminderen de cytotoxiciteit van het MTX-medicijn.

Effecten van MTX en MTX-CS NG's op het lichaamsgewicht van de rat. De dag van de eerste injectie werd beschouwd als dag 0. Zoutoplossing, MTX (1,25 μmol kg⁻¹ dag⁻¹ ) en MTX-CS NG's (4,25 mg kg⁻¹ dag⁻¹ ) kregen een andere dag respectievelijk intraperitoneale injecties aan de overeenkomstige groep. Resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM en geanalyseerd met t test. *P < 0,05 vergeleken met de datum op dag 0

Om de in vivo toxiciteit van MTX-CS NG's verder te onderzoeken, werd een histologische analyse van de milt van ratten uitgevoerd om te bepalen of MTX-CS NG's weefselbeschadiging veroorzaakten (Fig. 7). Secties van de controlegroep vertoonden de structuur van de normale milt, bestaande uit witte pulp (vormen) en rode pulp (RP), met fibreuze trabeculae (T) die zich uitstrekten tot in de miltpulp. De witte pulp bevat periarteriële lymfoïde omhulsels en miltfollikels en is omgeven door marginale zones, terwijl de rode pulp is samengesteld uit miltkoorden en wordt gescheiden door miltsinusoïden (figuren 7a en 7b). De met MTX behandelde groep vertoonde ernstige vernauwing van zowel de witte pulp (black box) als RP. De hemosiderine-afzettingen zijn ook te vinden in de met MTX behandelde groep (figuren 7c en 7d). De met MTX-CS NG behandelde groep vertoonde milde vernauwing van zowel de witte pulp (vormen) als RP, zonder dat hemosiderineafzettingen werden gevonden. Zowel witte pulp als rode pulp vertoonden milde vernauwing in vergelijking met de MTX-groep (Fig. 7e en 7f). De bovenstaande resultaten gaven aan dat MTX-CS NG's weinig bijwerkingen hebben op normaal weefsel [35, 36].

De toxiciteitseffecten van MTX en MTX-CS NG's op de milt van ratten. H &E gekleurde milt uitgesneden uit muizen na 14 dagen behandeling na zeven intraperitoneale injecties. een , b Secties van de controlegroep. c , d De met MTX behandelde groep. e , v De met MTX-CS NG behandelde groep

Conclusies

Samenvattend hebben we met succes zelf-geassembleerde nanogels gefabriceerd voor zeer efficiënte toediening van antitumormedicijnen. De met MTX-CS geconjugeerde nanogels waren ongeveer 200 nm groot en vertoonden een goede stabiliteit en oplosbaarheid. MTX-CS NG's vertoonden een sterkere en meer specifieke cytotoxiciteit dan MTX. In vivo experimenten onthulden dat MTX-CS NG's minder toxiciteit vertoonden dan MTX. MTX-CS NG's kunnen het antitumoreffect verbeteren en de bijwerkingen van MTX verminderen. Vanwege hun CD44-bindende eigenschap zouden chondroïtinesulfaat-geneesmiddelconjugaten een veelbelovend en efficiënt platform kunnen zijn voor het verbeteren van de oplosbaarheid van slecht oplosbare geneesmiddelmoleculen en voor actieve en selectieve gerichte afgifte aan kankercellen en tumorweefsels.

Afkortingen

¹ H NMR:: 1H Nucleaire magnetische resonantie
AFM:: Atoomkrachtmicroscoop
CDMT:: 2-Chloor-4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine
CS:: Chondroïtinesulfaat
DLS:: Dynamische lichtverstrooiing
DMT-MM:: 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl)-4-methylmorfoliniumchloride
FTIR:: Fourier-transformatie infrarood
MTT:: 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-difenyl-2-H-tetrazoliumbromide
MTX:: Methotrexaat
MTX-CS NG's:: Methotrexaat-chondroïtinesulfaat nanogels
NG's:: Nanogels
NMM:: 4-Methylmorfoline
TEM:: Transmissie-elektronenmicroscoop
THF:: Tetrahydrofuraan
UV-vis:: Ultraviolet-zichtbare spectroscopie

Bone Morphogenic Protein-2 (rhBMP2)-Loaded Silk Fibroin Scaffolds om de osteo-inductiviteit in botweefselengineering te verbeteren Magnetisch poly(N-isopropylacrylamide) nanocomposieten:effect van bereidingsmethode op antibacteriële eigenschappen

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal