Osteoblastreactie op met koper gedoteerde microporeuze coatings op titanium voor verbeterde botintegratie

Abstract

Vanwege hun uitstekende mechanische eigenschappen en goede biocompatibiliteit zijn titaniumlegeringen een populair onderzoeksonderwerp geworden op het gebied van medische metalen implantaten. Het oppervlak van de titaniumlegering vertoont echter geen biologische activiteit, wat een slechte integratie tussen het grensvlak van het titaniumimplantaat en het grensvlak van het botweefsel kan veroorzaken en er vervolgens voor kan zorgen dat het implantaat eraf valt. Daarom is biologische inertie van het oppervlak een van de problemen die titaniumlegeringen moeten overwinnen om een ideaal orthopedisch implantaatmateriaal te worden. Oppervlaktemodificatie kan de biologische eigenschappen van titanium verbeteren, waardoor het osseo-integratie-effect wordt versterkt. Koper is een essentieel sporenelement voor het menselijk lichaam, kan botvorming bevorderen en speelt een belangrijke rol bij het in stand houden van de fysiologische structuur en functie van bot en botgroei en -ontwikkeling. In deze studie werd een microporeuze koper-titaniumdioxide-coating op het oppervlak van titanium bereid door microarc-oxidatie. Op basis van de evaluatie van de oppervlakte-eigenschappen werden de adhesie, proliferatie en differentiatie van MC3T3-E1-cellen waargenomen. Een titanium staaf werd geïmplanteerd in de femurcondyl van konijn en de integratie van de coating en het botweefsel werd geëvalueerd. Onze onderzoeksresultaten laten zien dat de microporeuze koper-titaniumdioxide-coating een bijna driedimensionale poreuze structuur heeft en dat koper in de coating is verwerkt zonder de structuur van de coating te veranderen. In vitro-experimenten hebben aangetoond dat de coating de hechting, proliferatie en differentiatie van MC3T3-E1-cellen kan bevorderen. In vivo-experimenten bevestigden verder dat de microporeuze coating van titanium-koper-titaniumdioxide de osseo-integratie van titaniumimplantaten kan bevorderen. Concluderend kunnen microporeuze coatings van koper-titaniumdioxide worden bereid door microarc-oxidatie, wat de biologische activiteit en biocompatibiliteit van titanium kan verbeteren, de vorming van nieuw bot kan bevorderen en goede osteo-inductieve eigenschappen kan vertonen. Daarom heeft het gebruik van deze coating in de orthopedie een potentiële klinische toepassing.

Inleiding

Een medisch implantaatmateriaal van hard weefsel moet geschikte mechanische eigenschappen hebben, zoals sterkte, elasticiteitsmodulus, slijtvastheid en vermoeidheidsweerstand, zodat het implantaat de fysiologische belasting van het geïmplanteerde gebied gedurende lange tijd kan dragen. Tegelijkertijd moet het materiaal een goede biocompatibiliteit en zelfs bioactiviteit hebben, zodat het implantaat een goede combinatie kan vormen met het fysiologische weefsel van het implantatiegebied zonder nadelige reacties in het menselijk lichaam te veroorzaken. Zuiver titanium en titaniumlegeringen hebben goede mechanische eigenschappen en biocompatibiliteit en zijn momenteel de meest gebruikte metalen implantaatmaterialen.

Nadat het implantaat is geïmplanteerd, vindt eerst een reeks biochemische reacties plaats op het oppervlak van het materiaal, en de oppervlakte-eigenschappen spelen een cruciale rol in de reactie van het implantaat op de interne omgeving. De microstructuur en chemische samenstelling van het implantaatoppervlak kunnen de adsorptie van eiwitten veranderen, en eiwitten reguleren celadhesie en bepalen uiteindelijk hun functie [1]. Hoewel titanium en titaniumlegeringen de meest gebruikte orthopedische implantaatmaterialen zijn, heeft titanium geen biologische activiteit. Na implantatie in het lichaam kan het geen chemische binding vormen met het botweefsel van het implantatiegebied. Titanium en titaniumlegeringen zijn voornamelijk afhankelijk van mechanische vergrendeling om retentie te bereiken [2] en zijn niet bevorderlijk voor de fysieke functie op de lange termijn in het lichaam.

De oppervlaktecoating van titaniumimplantaten kan de mechanische eigenschappen van titanium aanvullen en de tekortkomingen met betrekking tot slechte biologische activiteit overwinnen; dat wil zeggen, titanium als substraat kan mechanische eigenschappen verschaffen, en elementen met een goede oppervlaktestructuur en biologische activiteit worden gebruikt als de coating. Deze laag zorgt voor biologische activiteit en onderzoek op dit gebied is een onderzoekshotspot geworden.

Op dit moment omvatten de technologieën die worden gebruikt voor de bereiding van bioactieve coatings op metalen oppervlakken voornamelijk plasmaspuiten, ionenstraal-geassisteerde depositie, elektroforetische depositie, gepulste laser fysieke dampdepositie, microarc-oxidatie, magnetron sputterdepositie, sol-gel, directe lasercladding en laserablatie [3,4,5,6,7,8,9,10]. Onder hen heeft plasmaspuittechnologie commerciële toepassingen; de huidige coatingtechnologie kan echter nog steeds niet voldoen aan de klinische vereisten, voornamelijk vanwege de volgende problemen:de bioactieve fase van de coating heeft een lage kristalliniteit en een slechte biologische activiteit; de hechtsterkte tussen de coating en het substraat is niet goed; het interne materiaal van de coating lost gemakkelijk op, wat de stabiliteit van de coating in het lichaam op lange termijn beïnvloedt; en het voorbereidingsproces voor de coating is te ingewikkeld, de procesvoorwaarden zijn streng, de kosten zijn hoog en de efficiëntie is laag [11].

Micro-arc-oxidatie, een effectieve technologie voor oppervlaktemodificatie die momenteel veel wordt gebruikt bij de oppervlaktemodificatie van metalen implantaten, maakt gebruik van het onmiddellijke sintereffect van plasma op hoge temperatuur en hoge druk; niet alleen het oppervlak van het materiaal genereert een ruw en poreus oppervlak, maar ook biologisch actieve elementen kunnen in de coating worden ingebracht. Het oppervlak van het materiaal dat is gemodificeerd door micro-arc-oxidatietechnologie kan de oppervlaktemorfologie, ruwheid, hydrofobiciteit en oppervlakte-energie van het matrixmateriaal en andere fysische en chemische eigenschappen aanzienlijk verbeteren, zodat de biologische activiteit en biocompatibiliteit van het materiaal aanzienlijk worden verbeterd. De osseo-integratie tussen het geïmporteerde materiaal en botweefsel is van grote betekenis [12].

Koper (Cu) is een essentieel sporenelement in het menselijk lichaam dat een verscheidenheid aan functies heeft, waaronder het bevorderen van de groei van osteoblasten en het bevorderen van de expressie van vasculaire endotheliale groeifactor in intimaweefsels, wat gunstig is voor de adhesie en proliferatie van vasculaire endotheliale cellen. Cu versterkt ook de lipideperoxidatiereactie, remt de synthese van bacterieel actief DNA en verwante enzymen die interfereren met het bacteriële energiemetabolisme en leidt niet gemakkelijk tot resistentie tegen geneesmiddelen [13]; wat nog belangrijker is, wordt erkend dat koperionen in een bepaald concentratiebereik zowel een hoge biologische activiteit als uitstekende antibacteriële eigenschappen hebben. Daarom is bewezen dat koperionen een goede biocompatibiliteit hebben bij gebruik bij het ontwerpen van biomaterialen [14].

De interactie tussen de cellen en het implantaat is een belangrijke factor bij het induceren van de vorming van een osseo-integratie-interface. Deze interactie hangt meestal af van de materiaaleigenschappen van het implantaatoppervlak, zoals de chemische samenstelling van het oppervlak, oppervlakte-energie, oppervlaktelading en oppervlaktemorfologie. Deze interactie tussen cellen en implantaten kan celadhesie, proliferatie en differentiatie beïnvloeden. Het is bewezen dat een poreus oppervlak de celadhesie, proliferatie en differentiatie verbetert, en het is ook bewezen dat implantaten die zijn gedoteerd met anorganische ionen (zink, strontium, magnesium, enz.) osseo-integratie bevorderen [15, 16].

Het proces van microarc-oxidatieapparatuur is eenvoudig en de eigenschappen van de voorbereide coating kunnen worden aangepast. Coatings gedoteerd met verschillende ionen kunnen worden bereid door de samenstelling van de elektrolyt te veranderen. Koper speelt een belangrijke rol in het organisme. De juiste hoeveelheid koperionen in de coating kan de proliferatie van osteoblasten bevorderen en de hechting van oppervlaktebacteriën remmen. Daarom hebben we in deze studie een microporeuze Cu–TiO₂ coating op het titanium oppervlak en gebruikt in vitro celexperimenten en dierproeven om het effect van het microporeuze Cu–TiO₂ te observeren en te analyseren coating op de oppervlakteactiviteit en biocompatibiliteit van titanium. We hebben ook geprobeerd de haalbaarheid van microporeus Cu–TiO₂ . te onderzoeken coating als een nieuw type implantaatcoatingmateriaal om de adhesie, proliferatie en osteogene differentiatie van MC3T3-E1-cellen te verbeteren en de vorming en osseo-integratie van nieuw bot op het implantaat-botinterface te bevorderen om een theoretische en experimentele basis te leggen voor de klinische toepassing van microporeus Cu–TiO₂ coating op het oppervlak van titanium implantaten.

Materialen en methoden

Voorbereiding en karakterisering van monsters

Door middel van draadsnijden werd het titanium verwerkt tot een monster met een diameter van 12 mm en een dikte van 1 mm. Van de implantaten zijn titanium staafjes gemaakt met een diameter van 3 mm en een lengte van 8 mm. Schuurpapier werd gladgestreken en gewassen met aceton en gedeïoniseerd water om de coating te bereiden. In deze studie werd een zelfgemaakte microarc-oxidatievoeding met laag vermogen gebruikt; het oxidatievoltage van de microboog was 450 V, de modus was constante stroom, de oxidatietijd van de microboog was 5 min en de frequentie was 1000 Hz.

De blanco controlegroep werd gelabeld met Ti en calciumacetaat en calciumglycerofosfaat werden gebruikt als de basische elektrolytoplossingen. De Ti-monsters na microarc-oxidatie in de basische elektrolytoplossing werden gelabeld met TCP en de monsters na microarc-oxidatie met verschillende koperoxidegehalten in de basische elektrolytoplossing werden gelabeld met TCP Cu I en TCP Cu II (tabel 1).

Veldemissie scanning-elektronenmicroscopie (FE-SEM) werd gebruikt om de oppervlaktemorfologie van de monsters te observeren, energiedispersieve spectroscopie (EDS) werd gebruikt om de elementverdeling op het coatingoppervlak te observeren, en oppervlakteruwheidsprofiel werd gebruikt om de ruwheid van verschillende monsters. Röntgendiffractie (XRD) en röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS) werden gebruikt om de elementaire samenstelling en microstructuur van de coatingfase en chemische toestand te observeren.

Celcultuur

MC3T3-E1-cellen (geëxtraheerd uit muizenschedelcellen) werden gebruikt voor in vitro celtesten. De cellen werden geïncubeerd in MEM met 10% foetaal runderserum α bij 37 ℃ in 5% CO₂ . Toen de cellen versmolten en groeiden tot 80% dichtheid, werden ze verteerd en gepasseerd met 0,25% trypsine. De derde passage werd gebruikt voor celexperimenten.

Levende/dode kleuring

De cytotoxiciteit van elke groep werd geëvalueerd door middel van levende/dode fluorescentiekleuring. De celzaaidichtheid was 1,5 × 10⁴ cellen/cm² . Na 3 dagen kweken werden de monsters gespoeld met steriel PBS en behandeld volgens de kit voor levend/dood levensvatbaarheid/cytotoxiciteit. De cytotoxiciteit van het materiaal werd waargenomen met fluorescentiemicroscopie.

Celadhesie en proliferatie

De cellen werden geïnoculeerd op het oppervlak van elke groep met een dichtheid van 1,5 × 10⁴ cellen/cm² . Na 1 uur, 2 uur en 6 uur incuberen werden de cellen gespoeld met PBS en 30 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde. Na spoelen met PBS werd 40 L DAPI-kleurmiddel gedurende 10 minuten op het oppervlak van het monster gedruppeld om lichtvlekken te voorkomen, en de monsters werden geobserveerd en afgebeeld met een confocale lasermicroscoop.

De celzaaidichtheid en kweekmethode waren hetzelfde als hierboven, en de proliferatie-activiteit van de cellen werd gemeten met de CCK-8-kit 1, 3 en 10 dagen na celkweek.

Expressie van genen gerelateerd aan osteogene differentiatie

De celinoculatiedichtheid en kweekmethode waren hetzelfde als hierboven. De cellen werden 1, 3 en 10 dagen na inoculatie verzameld en real-time kwantitatieve PCR werd gebruikt om de mRNA-niveaus van osteogene differentiatie-gerelateerde genen te detecteren (inclusief BMP , COL-I, ALP en OCN ). De expressieniveaus van de doelwitgenen werden genormaliseerd naar die van het huishoudgen GAPDH . De primersets staan vermeld in Tabel 2.

Dieren en chirurgie

De dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Guizhou Provincial People's Hospital. Zestien volwassen konijnen, zowel mannelijke als vrouwelijke, met een gewicht van 3,6 kg (3,2-3,9 kg) werden gekocht bij het Experimental Animal Center van Soochow University en werden verdeeld in een experimentele groep en een controlegroep (elk 8 konijnen). Intraveneuze anesthesie werd uitgevoerd met 3% natriumpentobarbital (0,1 ml per kilogram lichaamsgewicht). Na de voorbereiding van de huid werd de huid gefixeerd en routinematig gedesinfecteerd. Er werd een longitudinale incisie gemaakt in de laterale femurcondyl om de laterale condylus bloot te leggen. Met behulp van een chirurgische elektrische boor werd op een vlakke ondergrond een gat geboord met een diameter van 2,7 mm en een diepte van 6 mm. Twee sets titanium staafjes werden in het botdefect geïmplanteerd (links in de experimentele groep en rechts in de controlegroep) en penicilline werd gedurende 3 opeenvolgende dagen na de operatie gegeven om infectie te voorkomen.

Micro-CT-assay

Na de operatie werden de konijnen in aparte kooien gehouden en mochten ze eten en water drinken. Bij 4 w en 8 w na de operatie werden 8 konijnen geëuthanaseerd door luchtembolisatie. De femurcondylen van de konijnen met titaniumstaven in de experimentele groep en de controlegroep werden verwijderd, de steekproefomvang werd bijgesneden, de monsters werden formaline gefixeerd en micro-CT-scanning werd gebruikt voor driedimensionale reconstructie. Het interessegebied (ROI) werd ingesteld met behulp van Micro-CT-software en de botvolumefractie van het interessegebied (botvolume/totaal volume, BV/TV %) werd gemeten.

Histologische evaluatie door toluidineblauw- en fuchsine-methyleenblauwkleuring

De monsters werden gedehydrateerd met gradiëntalcohol (70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 100%). De gedehydrateerde monsters werden ingebed met methylmethacrylaat. Na succesvolle inbedding werden de monsters gesneden en bijgesneden, op een snijmachine gefixeerd met lijm om te snijden en uiteindelijk gepolijst met schuurpapier tot een plakdikte van ongeveer 20-30 m. (1) Toluïdineblauwkleuring:toluidineblauwe kleurstof werd aan het oppervlak van de plak toegevoegd en de plak werd in een waterbad geverfd. De oppervlaktekleurstof werd gedroogd met filtreerpapier, gespoeld en natuurlijk aan de lucht gedroogd. De film werd afgesloten en bekeken onder een lichtmicroscoop. (2) Fuchsine-methyleenblauw kleuring:de methode was dezelfde als toluidineblauw kleuring. Eerst werd methyleenblauw-kleuringsoplossing aan het oppervlak van de plakjes toegevoegd om te verven, aan de lucht gedroogd en gespoeld. Vervolgens werden de plakjes gedrenkt in een fuchsine-kleuroplossing om ze te verven, op natuurlijke wijze aan de lucht gedroogd, verzegeld en geobserveerd.

Statistische analyse

Gegevens worden uitgedrukt als de gemiddelden ± standaarddeviatie bepaald door SPSS 16.0-software. One-way ANOVA en de SNK-test werden gebruikt om de verschillen tussen groepen te vergelijken. P < 0,05 geeft een significant verschil aan.

Resultaten

De samenstelling van de oppervlaktemorfologie, fase en chemische elementen van het monster

Afbeelding 1 toont de SEM-oppervlaktemorfologieën van verschillende monsters. De morfologieën van de Ti-groep en andere groepen zijn significant verschillend. De Ti-groep heeft geen gaten op het oppervlak en het oppervlak is relatief vlak, waardoor er slechts enkele krassen achterblijven. De TCP-groep heeft een typische microarc-oxidatie-oppervlaktemorfologie en het oppervlak is bedekt met microporiën van verschillende groottes. Deze microporiën snijden elkaar en hebben bij benadering een "driedimensionale structuur". Grote en kleine poriën zijn met elkaar genest, en de poriën hebben geen vaste regels. De vorm is onregelmatig. Bovendien zijn er brandplekken in de openingen tussen de gaten. Net als de oppervlaktemorfologie van de TCP-groep, zijn de oppervlakken van de TCP Cu I- en TCP Cu II-groepen ook bedekt met onregelmatig gevormde microporiën, en er is geen duidelijk verschil in oppervlaktemorfologie tussen de groepen. De dotering van koper heeft geen invloed op de structuur en morfologie van de microporiën.

Oppervlaktemorfologieën van Ti, TCP, CP Cu I en TCP Cu II

Afbeelding 2 toont de mapping en het EDS-diagram van het microporeuze Cu–TiO₂ coating Zoals te zien is in het EDS-diagram, is het microporeuze Cu–TiO₂ coating is samengesteld uit Cu, Ti, Ca, P en O. De oplossing die Cu, Ca en P bevat, werd volledig in de coating opgenomen. Wat nog belangrijker is, we hebben geen andere giftige en schadelijke elementen gevonden. De mappingresultaten van de microporeuze Cu–TiO₂ coating laten zien dat koper, calcium en fosfor gelijkmatig in de coating zijn verdeeld.

Mapping en EDS-diagram van de Cu–TiO₂ coating (TCP Cu II)

Afbeelding 3 toont de XRD-patronen van Ti, TCP, TCP Cu I en TCP Cu II. Alle coatings zijn voornamelijk Ti, rutiel en anataas. Wat nog belangrijker is, CuO verscheen in het microporeuze Cu–TiO₂ coating, die aangaf dat koper bestond in de vorm van CuO.

XRD-patronen van Ti, TCP, TCP CuI en TCP CuII

Afbeelding 4 is de XPS-afbeelding van het microporeuze Cu–TiO₂ bekleding. Afbeelding 3a toont het volledige spectrum van het microporeuze Cu–TiO₂ coating bepaald met röntgenfoto-elektronenspectroscopie, die vergelijkbaar is met het EDS-resultaat, behalve voor titanium, zuurstof, calcium en fosfor. Naast de karakteristieke pieken van koper zijn er ook karakteristieke pieken van koper. De piek in de Ti2p spectrum komt overeen met TiO₂ , en de piek van Cu2p bij 932,7 eV wordt beschouwd als indicatief voor CuO [17, 18].

XPS-afbeelding van het microporeuze Cu-TiO₂ bekleding. een XPS-spectrum, b Ti2p , c Cu2p , d Ca2p , e P2p en f O1s spectrum

Afbeelding 5 toont de morfologie van de profilometer van verschillende monsters. Met uitzondering van de Ti-monsters, is de oppervlaktemorfologie van de profilometer van elke groep vergelijkbaar, wat een vulkanisch-achtige meertraps porieholtestructuur vertoont. Nadere analyse van de ruwheid Ra van elke groep toonde aan dat de ruwheid van TCP, TCP CuI en TCP CuII groter was dan die van Ti. De ruwheid van TCP, TCP CuI en TCP CuII is vergelijkbaar, en het verschil is niet significant, wat aangeeft dat microarc-oxidatie de ruwheid van Ti verhoogt, maar koperdoping heeft geen invloed op de ruwheid van de monsters.

Profielmetermorfologie van verschillende monsters

Celadhesie en proliferatie

Figuur 6a toont celaanhangende beelden op 1, 2 en 6 uur na kleuring met DAPI. Afbeelding 6b het aantal MC3T3-E1-cellen dat op verschillende tijdstippen aan de oppervlakken van verschillende monsters is gehecht. De aantallen hechtende cellen in verschillende groepen monsters op verschillende tijdstippen zijn in de volgende volgorde gerangschikt:TCP Cu II > TCP Cu I > TCP > Ti. Vergeleken met de Ti- en TCP-groepen nam het aantal hechtende cellen in de TCP Cu I- en TCP Cu II-groepen aanzienlijk toe. Daarom is het microporeuze Cu–TiO₂ coating kan celadhesie aanzienlijk bevorderen.

Adhesie en proliferatie van MC3T3-E1-cellen op de oppervlakken van verschillende monsters. een Celaanhangende beelden op 1, 2 en 6 uur na kleuring met DAPI, b staafdiagram van hechtende cellen en c staafdiagram van celproliferatie (gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD, n = 5. **p < 0.01 vergeleken met groeps-TCP)

Figuur 6c toont de proliferatie van MC3T3-E1-cellen op het oppervlak van verschillende monsters op verschillende tijdstippen. Vergelijkbaar met de adhesietrend van de bovenstaande cellen, was de celproliferatie van de TCP Cu I- en TCP Cu II-groepen significant hoger dan die van de Ti- en TCP-groepen. De oppervlaktemorfologie van het microporeuze Cu–TiO₂ coating en koperionen samen bevorderden celproliferatie.

Afbeelding 7 toont de resultaten van de EdU-kleuring. De verhouding van EdU-positieve kernen volgde deze volgorde:TCP CuII > TCP CuI > TCP > Ti. In vergelijking met de Ti-groep verschilde de proliferatie van cellen in de TCP CuII-groep significant.

EdU-kleuring gemeten na 3 dagen kweken (gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD, n = 5. **p < 0.01 vergeleken met groeps-TCP)

Levende/dode kleuring

Cytocompatibiliteit is de basisvereiste van implantaatmaterialen. Levende/dode fluorescerende kleuring kan de cytotoxiciteit en biocompatibiliteit van materialen evalueren. Afbeelding 8 toont de kleurresultaten van levende/dode cellen nadat cellen gedurende 3 dagen op het oppervlak van verschillende monsters waren gekweekt. Er waren slechts een paar dode cellen (rood) op het oppervlak van elke groep monsters, wat erop wijst dat er geen duidelijke cytotoxiciteit was. Koperdotering in het microporeuze Cu–TiO₂ coating verhoogt niet duidelijk de cytotoxiciteit en heeft een goede celcompatibiliteit.

Kleuring van levende/dode cellen op de oppervlakken van verschillende monsters (gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD, n = 5. **p < 0.01 vergeleken met groeps-TCP)

Expressie van osteogene differentiatiegenen

Afbeelding 9 toont de mRNA-expressieniveaus van osteogene differentiatiegenen (BMP , OCN , ALP en COL-I ) op de oppervlaktecellen van elke groep monsters op verschillende tijdstippen. Na verloop van tijd nam de expressie van osteogene differentiatiegenen op het oppervlak van elke groep monsters geleidelijk toe. Tegelijkertijd vertoonde de expressie van elke groep genen de volgende trend:TCP Cu II > TCP Cu I > TCP > Ti. Vergeleken met de Ti- en TCP-groepen was de expressie van botgerelateerde differentiatiegenen bestaande uit TCP Cu I en TCP Cu II significant verbeterd, wat aangeeft dat de microporeuze Cu-TiO₂ coating kan osteogene differentiatie bevorderen.

De mRNA-expressie van BMP , OCN , ALP en COL-I na 1, 3 en 10 dagen incubatie (gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD, n = 5. *p < 0,05 vergeleken met groep-TCP, **p < 0.01 vergeleken met groeps-TCP)

Grossobservatie en micro-CT-analyse

Afbeelding 10 toont de resultaten van grove observatie en micro-CT-reconstructie van de femurcondyl. Uit grove observatie bleek dat de implantaten in de twee groepen zich in het midden van de femurcondyl bevonden na 4 en 8 weken met een goede positionering, geen duidelijke infectie en geen losraken van het implantaat. Micro-CT driedimensionale reconstructie laat zien dat in de loop van de tijd het nieuwe botweefsel op het oppervlak van de twee groepen monsters na 8 weken groter was dan dat na 4 weken, en op verschillende tijdstippen werd nieuw botweefsel gevormd op het oppervlak van het microporeuze Cu–TiO₂ -gecoat titanium implantaat, en de hoeveelheid was groter dan die van de controlegroep. Door de botvolumefractie van de twee groepen te vergelijken, wordt de botvolumefractie (BV/TV) van microporeus Cu–TiO₂ -gecoat titanium was significant hoger dan die van de blanco controlegroep. Microporeus Cu–TiO₂ -gecoat titanium kan de osseo-integratie van titaniumimplantaten bevorderen.

Grove observatie en micro-CT-reconstructie van de femurcondyl werden 4 en 8 weken na implantatie waargenomen

Histologische evaluatie

Afbeelding 11 toont de resultaten van kleuring met toluidineblauw en fuchsine-methyleenblauw. Er werd geen vezelomhulsel gezien bij het bot-implantaat-interface, wat aangeeft dat het titanium implantaat geen ontstekingsreactie had op het raakvlak met het bot. Witte gaten zijn te zien bij de tussenruimte van titanium implantaat en bot in de twee groepen. De breedte van de witte gaten in de controlegroep was groter dan die van microporeus Cu–TiO₂ gecoat titaan. Hoe groter de opening, hoe zwakker de inductie van nieuw botweefsel door de implantaten. Kleuring met toluidineblauw toont de blauwe band bij de tussenruimte tussen implantaat en bot, het nieuwe bot. Microporeus Cu–TiO₂ gecoat titanium had meer botweefsel dan de controlegroep, wat aangeeft dat microporeus Cu–TiO₂ coating kan osteogenese beter bevorderen en heeft een beter osseo-integratie-effect. De botmatrix rond het microporeuze Cu–TiO₂ gecoat titanium was dikker en continu, en het botweefsel was aanzienlijk toegenomen. Daarentegen had de controlegroep minder bot. Dit resultaat toont aan dat microporeus Cu–TiO₂ gecoat titanium kan osteogenese beter bevorderen en heeft een beter osseo-integratie-effect.

Toluidineblauw en fuchsine-methyleenblauw kleuring van nieuwe botvorming 4 en 8 weken na implantatie

Discussie

Metaaltitanium en zijn legeringen worden veel gebruikt in de tandheelkunde, plastische chirurgie en andere gebieden vanwege hun uitstekende mechanische eigenschappen en biocompatibiliteit; titanium als implantaat kan echter alleen passief worden gecombineerd met botweefsel. Deze combinatie is vaak een mechanische combinatie, die vatbaar is voor losraken en verzakken van het implantaat, wat leidt tot implantaatfalen. Op dit moment wordt de methode van implantaatoppervlakmodificatie voornamelijk gebruikt om het osseo-integratievermogen te verbeteren [19]. Het oppervlak van het ideale implantaat moet zowel osteoconductiviteit als osteo-inductiviteit hebben, een goede biocompatibiliteit hebben en de vorming van osseo-integratie tussen het implantaat en het botweefsel bevorderen [20]. In deze studie hebben we een innovatief microporeus Cu–TiO₂ coating op het oppervlak van titanium, in de hoop de biologische activiteit en biocompatibiliteit van titanium te verbeteren en de tekortkomingen van titaniumimplantaten in huidige klinische toepassingen te overwinnen.

Van koperion en titaniumdioxide is bewezen dat ze een goede biologische activiteit hebben [21]. In deze studie werd het microporeuze Cu–TiO₂ coating bereid door microarc-oxidatie op het titaniumoppervlak toonde het grootste voordeel van een hechte hechting tussen de coating en het titaniumsubstraat, wat in de literatuur is bevestigd [22]. De goede hechtkracht van de microarc-oxidatiecoating hangt nauw samen met het vormingsproces. In het proces van microarc-oxidatie bestaan naast elkaar chemische oxidatie, elektrochemische oxidatie en plasma-oxidatie. Onder invloed van de onmiddellijke hoge temperatuur en hoge druk die worden gegenereerd door boogontlading, groeit het titaniumoppervlak op een "groei" -manier op het oppervlak van het substraat, voornamelijk het substraatoxide. De keramische coating, coating en substraat hoektanden zijn verspringend en hebben een goede hechtkracht [23].

De oppervlakte-eigenschappen van biologische materialen hebben een directe invloed op de biologische eigenschappen van de materialen. De microarc-oxidatiecoating vertoont een ruwe en poreuze oppervlaktemorfologie onder een elektronenmicroscoop. De morfologie bestaat voornamelijk uit microporiën van verschillende groottes die met elkaar doordringen. Deze kleine poriën worden gevormd tijdens het proces van microarc-oxidatie, het metalen oppervlak wordt afgebroken onder hoge spanning en het onmiddellijke sinteren bij hoge temperatuur in de microarc-zone oxideert en sintert de titaniummatrix direct tot een keramische film met een kristallijne keramische fasestructuur , waar elektrische storing optreedt. De onder de elektronenmicroscoop waargenomen microporiën worden gevormd. These rough and porous structures can not only increase the attachment area of tissue cells, but these interpenetrating micropores are also equivalent to a three-dimensional scaffold structure, which can induce bone tissue to grow into the pores and promote cell adhesion and extension. Pan et al. [24] prepared micro/nanohierarchical structured TiO₂ coatings on polished titanium by micro-arc oxidation and found that the coatings were favorable for the adhesion and extension of MG63 cells. Zhang et al. [25] prepared a Si–TiO₂ coating by micro-arc oxidation, and further study showed that the adhesion of MC3T3-E1 cells on this silicon-containing TiO₂ coating was significantly higher than that on a Si-free TiO₂ coating and pure Ti.

The greatest advantage of the microarc oxidation coating is that the ions in the electrolyte solution can be introduced into the coating during the microarc oxidation process. In this study, the EDS analysis results of the coating surface showed that the microporous Cu–TiO₂ coating is mainly composed of Cu, Ca, P, O and Ti elements, of which titanium comes from the matrix, calcium and phosphorus come from the basic electrolyte solution, and the copper ions in the electrolyte are deposited in the coating along with the formation of the ceramic film. The calcium and phosphorus components on the surface of the implant can not only improve the surface properties of the material but also induce bone formation. In addition to calcium and phosphorus, the copper ions in the microporous Cu–TiO₂ coating have good biocompatibility and biological activity. Copper-doped coatings on the surface of implants have also been reported in the literature. Astasov-Frauenhoffer et al. [26] deposited copper on Ti via a spark-assisted anodization method and confirmed that the viability of the bacterial cells was strongly inhibited. Zong et al. [27] combined anodization and magnetron sputtering to combine copper into TiO₂ nanotubes and prepare copper (Cu) into TiO₂ NTAs (Cu–Ti–O NTAs), and further study showed that Cu–Ti–O NTAs have excellent long-term antibacterial ability and favorable angiogenic activity.

Biocompatibility is the minimum requirement for measuring implants and is also the basic guarantee for implant safety. In this study, biologically active copper was introduced into the surface of titanium implants through microarc oxidation; however, copper ions, as heavy metal ions, have potential toxicity. Therefore, we must consider whether the microporous Cu–TiO₂ coating is cytotoxic. In this study, live/dead cell staining was used to evaluate the microporous Cu–TiO₂ coating. The results showed no obvious cytotoxicity on the surface of the microporous Cu–TiO₂ coating on the titanium surface, and good cell compatibility was observed. We speculate that this finding may be related to the low copper content of the coating. Huang et al. [28] fabricated gap-bridging chitosan–gelatin nanocomposite coatings incorporated with different amounts of copper (Cu; 0.01, 0.1, 1, and 10 mM for Cu I, II, III, and IV groups, respectively) on Ti and demonstrated that the activities of bone marrow stromal cells were not impaired on Cu-doped coatings except for the Cu IV group.

Cell adhesion and proliferation are the basis of implant osseointegration in the later stage. The more cells that adhere and proliferate on the surface of the implant, the better the effect of implant-bone interface osseointegration. The results of this study showed that on the first day after the material surface was inoculated, the amount of cell adhesion on the surface of the samples of each group differed, and the amount of adhesion on the surface of the microporous Cu–TiO₂ coating group increased significantly. The number of cells that adhered to the sample surface gradually increased, but the number of cells that adhered to the group with microporous Cu–TiO₂ coating was significantly greater than that of the other two groups. The difference was statistically significant, indicating that the microporous Cu–TiO₂ coating was doped with copper ions. A porous, rough surface is most conducive to cell adhesion. Similar to cell adhesion, cell proliferation on the surface of each group of materials also showed similar results. Our research results are similar to previous reports [29].

In addition to adhesion and proliferation, the degree of cell differentiation on the surface of the material can further reflect the performance of the implant's osseointegration. The osteogenic differentiation marker genes ALP , BMP , RUNX2 , OCN and COL-I can reflect cell differentiation. In this study, as time went by, the expression of BMP, OCN, ALP and COL-I on the surface of each group of samples increased, but the expression of the microporous Cu–TiO₂ coating group was significantly higher than that of the control group. This finding is closely related to the promotion of osteogenic differentiation by copper ions. Komarova et al. [30] prepared Zn- and Cu-containing CaP-based coatings by microarc oxidation on Ti and showed that low amounts of Cu and Zn in the coatings promoted high motility of human adipose-derived multipotent mesenchymal stromal cells and subsequent ability to differentiate into osteoblasts.

Osseointegration is the key to the success or failure of the implant. This means that there is no fibrous tissue between the implant and the bone tissue. There is direct contact between the implant and the bone tissue, and it can directly bear stress to realize the relationship between the implant and the bone tissue, establishing a functional connection. The osseointegration between orthopedic implants and bone tissue is affected by many factors, such as the initial stability of the implant and the mechanical properties of the implant material, implant surface properties, biocompatibility, biological activity and the condition of the surrounding bone tissue [31].

An ideal implant position and a stable biomechanical environment are the prerequisite and basis for the osseointegration of the implant-bone interface. In this study, the femoral condyle was chosen to be implanted with a copper-doped microporous coating because the abundant blood supply and sufficient bone volume at the femoral condyle can provide a good anatomical basis and a relatively stable mechanical environment for the implant. Moreover, the femoral condyle is mostly cancellous bone. After implantation, bone formation and the effect of implant-bone interface osseointegration can be more intuitively evaluated.

Micro-CT is currently a common method for observing the osteogenesis performance of implants and is also an effective method for evaluating the osseointegration between implants and bone tissue. Bone microstructure is visualized through three-dimensional reconstruction and the region of interest (ROI) analysis with the assistance of related software to obtain the relevant parameters of new bone tissue. Among all the parameters, BV/TV represents the total amount of bone formation and is an important indicator reflecting the osseointegration of the implant. In this study, we chose BV/TV as the detection index. Four weeks after implantation, the BV/TV of the microporous Cu–TiO₂ coating group was higher than that of the control group. Eight weeks after implantation, the BV/TV values of the microporous Cu–TiO₂ coating group and the control group were higher than those at 4 weeks, and the BV/TV of the microporous Cu–TiO₂ coating group was higher than that of the control group. On the basis of micro-CT detection, we performed histological observation and quantitative analysis of the bone tissue around the implant through hard tissue slices. The results of VG staining showed that the microporous Cu–TiO₂ coating group formed more new bone than the control group, and the new bone that formed around it was in direct contact with the internal implant without fibrous tissue infiltration. These results indicate that microporous Cu–TiO₂ coating on the titanium surface can promote the osseointegration of titanium implants. This finding is similar to previous in vitro studies. The rough, porous structure produced by microarc oxidation mimics the micro/nanostructure of normal bone tissue. More importantly, biologically active copper ions promote bone tissue regeneration. Under the action of these common factors, bone tissue regeneration on the surface of the implant is promoted. Our research results are consistent with literature reports. Milan et al. [32] designed a multifunctional Cu/a-C:H thin coating deposited on Ti–6Al–4 V alloy (TC4) via magnetron sputtering and found that the coating composition can stimulate angiogenesis and osteogenesis and control the host response, thereby increasing the success rate of implants.

Conclusion

In summary, we prepared a microporous Cu–TiO₂ coating on a titanium surface by microarc oxidation. The surface of the coating has a porous structure with pores of different sizes and interconnected pores. The coating increases the surface roughness of Ti and copper is evenly distributed on the surface of the coating. In vitro studies revealed that the coating has no obvious cytotoxicity and can promote the adhesion, proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells. In vivo experiments further confirmed that the coating can induce the formation of new bone tissue and promote osseointegration at the titanium implant-bone interface. In view of the biological activity in vivo and in vitro, we believe that the microporous Cu–TiO₂ coating on the surface of titanium implants has potential clinical application value in orthopedics.

Availability of data and materials

Not applicable.

Abbreviations

MAO:: micro-arc oxidation
Cu:: copper
Zn:: zinc
Cu–TiO₂ coating:: copper–titanium dioxide coating
ROI:: region of interest
ALP:: alkaline phosphatase

Effecten van co-adsorptie op grensvlakladingsoverdracht in een quantum dot@dye composiet Meerkleurige emissie van op ultraviolet GaN gebaseerde fotonische quasicrystal nanopiramidestructuur met semipolaire InxGa1−xN/GaN meerdere kwantumbronnen

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal