PRISM-techniek doorbreekt lichtdiffractielimieten voor live-celbeeldvorming in ruimte en tijd

• Onderzoekers ontwikkelen een nieuwe techniek (PRISM) die verder kan kijken dan de diffractie van licht. 
• Het kan uitzonderlijke beelden in levende cellen vastleggen via ruimtelijke en temporele beeldvorming met superresolutie. 

De afgelopen decennia hebben we breedveldfluorescentiebeeldvormingsmethoden, zoals PALM en STORM, gebruikt om subcellulaire structuren te observeren. Deze methoden vereisen honderden en duizenden onbewerkte afbeeldingen in lange reeksen. Het verhogen van de ruimtelijke resolutie vermindert dus de tijdresolutie.

Nu hebben onderzoekers van EPFL (onderzoeksinstelling in Lausanne, Zwitserland) een systeem ontworpen dat uitzonderlijke beelden in levende cellen kan vastleggen door middel van ruimtelijke en temporele beeldvorming met superresolutie (zowel in ruimte als in tijd).

Het nieuwe microscopieplatform, genaamd PRISM (Phase Retrieval Instrument with Super-resolutie Microscopy), kan verder kijken dan de diffractie van licht. Het integreert driedimensionale microscopie en een nieuwe techniek voor het driedimensionaal faseonderzoek van wit licht.

Het combineert de ruimtelijke resolutie van fluorescentie-superresolutie en moleculaire specificiteit met de snelle en gevoelige kwantitatieve fasebeeldvorming, waardoor multimodale 4-dimensionale beeldvorming mogelijk wordt. 

Hoe 4D-celmicroscopie werkt?

Onderzoekers gebruikten Fourier-filtering om de kwantitatieve 3D-fase uit een reeks witlichtbeelden te extraheren. Vervolgens legden ze deze helderveld-diepte-opgeloste fasebeeldvorming uit via gedeeltelijk coherente 3D-beeldvorming.

Ze demonstreerden hun concept door de 3D-fasegegevens met hoge resolutie van stabiele cellen op te halen uit een grote stapel z-verplaatste intensiteiten. Ze ontwikkelden PRISM voor gelijktijdige acquisitie van 8 vlakken – het kan 3D-fasebeeldvorming met hoge snelheid uitvoeren over een volume van 2,5*50*50 micrometer. Ten slotte hebben ze monsters van cellen sequentieel in 3D in beeld gebracht met fasemicroscopie en optische fluctuatiebeeldvorming met superresolutie (SOFI).

SOFI ondersteunt 3D-beeldvorming van levende cellen met bijna één seconde per gereconstrueerd beeld van tijdresolutie in een meervlaksmicroscoop. Bovendien biedt het een kwantitatieve beoordeling van moleculaire parameters en tolereert het een hoge labeldichtheid.

Referentie:Natuurfotonica | doi:10.1038/s41566-018-0109-4 | EPFL

In eenvoudige taal:PRISM is een aanvulling op de huidige breedveldmicroscopieplatforms, die een eenvoudige en snelle implementatie van 3D-fluorescentie-superresolutiebeeldvorming en 3D-kwantitatieve fase mogelijk maakt. Kortom, het nieuwe systeem biedt een betere mogelijkheid om de temporele fysiologie en de complexe ruimtelijkheid van levende cellen te observeren.

Technische details

Een cel waargenomen met de PRISM-techniek | Krediet:  T. Lasser / EPFL

Gebaseerd op de Helmholtz-golfvergelijking, is de techniek ingebed in het raamwerk van de stelling van Wiener-Khintchine. Het proces van het decoderen van fasegegevens langs de z-as wordt uitgevoerd door de voorwaartse zwakke verstrooiingsinterferentie te berekenen.

Ze bouwden een efficiënt algoritme om de 3D-fasegegevens uit een verkregen volumetrische intensiteitsstapel te herstellen. De numerieke apertuur met hoge detectie en Koehler-verlichting met wit licht zorgen voor spikkelvrije hoge resolutie en stabiele kwantitatieve fasebeeldvorming van levende cellen. Bovendien geverifieerd de simulaties een axiale resolutie van 350*560 nanometer. 

Lezen:De elektrische activiteit van de hersenen meten met behulp van een fluorescentiesensor

Over het geheel genomen maakt de procedure het mogelijk om een conventionele helderveldmicroscoop te upgraden naar een eenvoudige, snelle en betrouwbare 3D-fasemicroscoop, die zou moeten voldoen aan de verwachtingen van talloze onderzoeken en toepassingen in de levenswetenschappen en de biologie.