Lang niet-coderend RNA MALAT1/microRNA-143/VEGFA signaalas moduleert vasculair endotheliaal letsel-geïnduceerd intracraniaal aneurysma

Materialen en methoden

Ethische verklaring

De studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China en volgde de principes van de Verklaring van Helsinki. Deelnemers gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming in dit onderzoek. Alle dierproeven waren in overeenstemming met de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Het protocol is toegestaan ​​door het Comité voor de Ethiek van Dierproeven van het First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China.

Studieonderwerpen

Twintig IA-patiënten (IA-groep) bij wie de diagnose was gesteld door middel van beeldvormend onderzoek en die neurochirurgische clipping hadden ondergaan in The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, werden geselecteerd voor onze experimenten. Er waren 11 mannen en 9 vrouwen die 43,27 ± 6,25 jaar oud waren. De IA-weefsels werden bemonsterd. Ondertussen werden de temporale corticale arteriële vasculaire weefsels van de temporale pool gereseceerd bij 20 patiënten (controlegroep) met temporale kwab-epilepsie veroorzaakt door amygdala en hippocampale sclerose. De verwijderde weefsels werden na de operatie histopathologisch onderzocht als normale arteriële weefsels en er waren 13 mannen en 7 vrouwen in de leeftijd van 44,18 ± 5,91 jaar. Er werd geen significante discrepantie vastgesteld in geslacht en leeftijd tussen de IA-groep en de controlegroep (beide P> 0,05). Veneuze bloedmonsters (2 buisjes) werden 's ochtends vóór de operatie van alle proefpersonen in nuchtere toestand op hetzelfde tijdstip genomen.

Opstelling van rattenmodellen van IA

Zestig schone Sprague-Dawley mannelijke ratten (Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan, China), met een gewicht tussen 200 en 250 g, werden gedurende 7 dagen gekweekt (25 ± 2 °C, relatieve vochtigheid van 65-70 %, 12 u licht-donkercyclus, gratis water en voedselinname). Ratten werden met het varkenspancreas-elastase naar de externe halsslagader en rond de vertakkingsslagaderwand gedropt. De externe halsslagader werd geligeerd met twee chirurgische lijnen aan de tak van de externe halsslagader ongeveer 1,5 mm. De externe halsslagader werd tussen de twee lijnen doorgesneden om een ​​intern halsslagaderaneurysma te vormen in het blinde segment van de externe halsslagader. Ratten werden 1 week na operatie gevoed met 1% zoutoplossing. Cerebrale angiografie werd na 1  maand uitgevoerd en de vorming van een aneurysma werd waargenomen.

Na de oprichting van IA-rattenmodellen werden 50 ratten willekeurig verdeeld in een blanco groep (n =10, gemodelleerde ratten werden eenmaal per dag behandeld met stereotactische injectie van 100 L fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), korte haarspeld RNA (sh)-negatieve controle (NC) groep (n =10, gemodelleerde ratten werden eenmaal per dag behandeld met stereotactische injectie van 100 L sh-MALAT1 NC), sh-MALAT1-groep (n =10, gemodelleerde ratten werden eenmaal per dag behandeld met stereotactische injectie van 100  μL sh-MALAT1-plasmide), overexpressie (Oe) -NC-groep (n =10, gemodelleerde ratten werden eenmaal per dag behandeld met stereotactische injectie van 100 μL Oe-MALAT1 NC-plasmide) en Oe-MALAT1-groep (n =10, gemodelleerde ratten werden eenmaal per dag behandeld met stereotactische injectie van 100 L Oe-MALAT1-plasmide) [15]. De bovenstaande plasmiden zijn samengesteld door Shanghai Genechem Co., Ltd. (Shanghai, China).

Bloeddruktest bij ratten

De bloeddruk van de staartslagader van ratten werd gemeten in de 1e, 4e en 12e week na de operatie. Voordat de bloeddruk werd gemeten, werden de ratten even in een verwarmingsapparaat met constante temperatuur geplaatst om verstoring van de externe temperatuur te voorkomen. Ten tweede werden de ratten enkele minuten stil gehouden in een speciale rattenkooi om interferentie van activiteit te voorkomen. Als de bloeddruk sterk varieerde, werd deze twee of drie keer in verschillende tijden bepaald om de gemiddelde waarde te verkrijgen.

Verwerving van aneurysmaweefsel

Na 3  maanden werden ratten verdoofd met 1% pentobarbital-natrium (40  mg/kg) door intraperitoneale injectie om bloedmonsters uit de aderen te verkrijgen. Ratten werden geëuthanaseerd en de borstkas werd geopend, de linker hartkamer werd in de aorta geïntubeerd en de cava werd doorgesneden om het bloed af te geven. Ondertussen werd 30 mL normale zoutoplossing die heparine-natrium bevat gebruikt voor snelle hartperfusie om bloed te spoelen, en vervolgens werd 10  L 10% polyformaldehyde/0,1  M PBS (pH 7,4) in de hersenen geïnjecteerd. Na perfusie en fixatie werden de hersenen van de rat geopend. De arteriële circulatie in de schedelbasis werd zorgvuldig geobserveerd, het aneurysmaweefsel werd gescheiden en de veranderingen van het aneurysma werden onder de microscoop waargenomen.

Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Serumgerelateerde indices werden getest met een ELISA-kit. De verzamelde bloedmonsters werden gedurende 1 uur in een thermostaat van 37 ° C geplaatst en gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 3000 r/min. Detectie van endotheline-1 (ET-1) en von Willebrand factor (vWF) expressie werd uitgevoerd in overeenstemming met de instructies van de kit (alle kits werden gekocht bij NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Jiangsu, China).

Hematoxyline-eosine (HE)-kleuring

De monsters werden gedurende meer dan 24 uur gefixeerd met 10% formaline en bewaard in paraffineblokken. De paraffineblokken werden gedurende 20 min van was ontdaan met xyleen, gedehydrateerd met een gradiënt-aflopende reeks alcohol (100%, 95%, 80%, 75%) gedurende 1 minuut en gekleurd met hematoxyline gedurende 10 min. Vervolgens werden de weefsels gespoeld met gedestilleerd water, gedurende 30 seconden gedifferentieerd met zoutzuur-ethanol en gedurende 5 minuten in warm water van 50 ° C geweekt. Geverfd met eosine-oplossing, werden de weefsels gespoeld met gedestilleerd water, gedehydrateerd met 70% en 90% alcohol, helder gemaakt met xyleen en afgesloten met neutrale gom. De morfologie van de weefsels werd waargenomen onder een krachtige microscoop.

Transmissie-elektronenmicroscoopobservatie

De reserveweefsels werden gefixeerd met 2,5% glutaardialdehyde en 1% osmitinezuur, gedehydrateerd en vervolgens ingebed met Epon812-hars. De halfdunne secties werden geverfd met tolueenblauw, bijgesneden en verwerkt tot ultradunne secties. De coupes werden geverfd met uranylacetaat en loodcitraat en geobserveerd door een JME-2000EX transmissie-elektronenmicroscoop (Hitachi High-Technologies Co., Ltd., Shanghai, China).

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-gemedieerde Deoxyuridine Trifosfaat-Biotine Nick End-Labeling (TUNEL) kleuring

TUNEL-kleuring werd geïmpliceerd om apoptose van endotheelcellen bij IA-ratten waar te nemen op basis van TUNEL-kit (Roche, Basel, Zwitserland). De bereide secties van het aneurysma van de rat werden tweemaal gewassen met xyleen (5 min/tijd) en 3 keer gedehydrateerd met een dalende reeks alcohol (100%, 95%, 80%, 75%) (5 min/tijd). De weefsels werden behandeld met 20 g/ml protease K-oplossing zonder DNase gedurende 15-30 min, gedruppeld met 50 L TUNEL-reactieoplossing gedurende 60 min en ontwikkeld met 50 L diaminobenzidine (DAB) bij 25 °C gedurende 10 min. Vervolgens werden coupes tegengekleurd met hematoxyline, gedehydrateerd met gradiëntalcohol, geklaard met xyleen en afgesloten met neutrale gom. De coupes werden bekeken onder de optische microscoop en de apoptotische index werd berekend.

Isolatie en identificatie van aneurysma vasculaire endotheelcellen

Endotheelcelisolatie werd uitgevoerd volgens de methode uitgevoerd door Boscolo et al. [16]. De IA-weefsels werden in plakjes van 3 mm ² . gesneden fragmenten. De weefsels werden gedurende 25 min bij 37 °C geïncubeerd met 0,1% collagenase B/0,1% dispase (Roche). Vervolgens werden de vooraf losgemaakte weefsels gedurende 2 min getritureerd met een pipet van 2 m en gefilterd met een zeef van 100 μm (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, VS). Vervolgens werd de celsuspensie gecentrifugeerd en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in MV2-medium (inclusief groeifactoren en 20% foetaal runderserum) (PromoCell, Heidelberg, Duitsland). De cellen werden gezaaid bij 1 × 10 ⁴ cellen/ml in een kweekkolf bedekt met 1 μg/cm ² fibronectine. Volgens de methode beschreven door Jackson et al. [17], de cellen van 80-100% samenvloeiing werden gescheiden met de kralen (Dynabeads M-450 Tosylactived, Oxoid, Hampshire, VK) gecoat door Ulex europaeus Agglutinin I (UEA) (Vector Laboratories, Ltd., Peterborough, VK) . De endotheelcellen die waren gehecht aan de met lectine beklede kralen werden verzameld met een magnetische deeltjesconcentrator en de niet-geconjugeerde cellen werden gewassen met een basaal medium. De UEA-positieve cellen werden opnieuw gesuspendeerd in het kweekmedium en uitgezaaid in de met fibronectine beklede kweekkolf om de adhesie en groeisnelheid van de cellen te verbeteren.

Cellen werden gekweekt in MV2 op met fibronectine beklede kamerglaasjes. Toen de celconfluentie 80-100% bereikte, werden de cellen vastgemaakt in aceton bij 4 ° C en behandeld met 1% Triton X-100 gedurende 5 min en vervolgens 0,5% runderserumalbumine (BSA) gedurende 15 min. De cellen werden gedruppeld met primair antilichaam tegen vWF (1:300, Abcam, Cambridge, MA, VS) en gedurende 2 uur geïncubeerd (NC werd uitgevoerd in afwezigheid van primair antilichaam), gedruppeld met mierikswortelperoxidase-gedachte immunoglobuline G (1:150, Abcam) en gedurende 30 min geïncubeerd. Vervolgens werden cellen ontwikkeld met 50 L DAB bij 25°C gedurende 5 min, tegengekleurd met hematoxyline, gedifferentieerd met 0,1% zoutzuur, gedehydrateerd met alcohol, gevolgd door xyleenklaring en neutrale gomafdichting. Na het drogen werden de cellen gefotografeerd onder een omgekeerde microscoop.

Celgroepering en transfectie

De vasculaire endotheelcellen van het aneurysma in de logaritmische fase werden ingedeeld in 5 groepen:blanco groep (vasculaire endotheelcellen van het aneurysma zonder enige behandeling), sh-NC-groep (vasculaire endotheelcellen van het aneurysma getransfecteerd met sh-MALAT1 NC-plasmide), sh-MALAT1-groep ( aneurysma vasculaire endotheelcellen getransfecteerd met sh-MALAT1-plasmide), Oe-NC-groep (aneurysma vasculaire endotheelcellen getransfecteerd met Oe-MALAT1 NC-plasmide) en Oe-MALAT1-groep (aneurysma vasculaire endotheelcellen getransfecteerd met Oe-MALAT1-plasmide). De bovenstaande plasmiden werden gesynthetiseerd door Genechem. Celtransfectie werd uitgevoerd in overeenstemming met de instructies van de lipofectamine ^TM 2000 reagens (11668-027, Invitrogen, Carlsbad, Californië, VS).

3-(4,5-dimethylthiazol-2-Yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-assay

De vasculaire endotheelcellen van elke groep werden uitgezaaid op een plaat met 96 putjes met een dichtheid van 3 × 10 ⁴ cellen/ml en gekweekt bij 37 °C, 5% CO₂ voor 48u. Elke groep werd ingesteld met 5 parallelle putjes en aan elk putje werd 20 L verse MTT-oplossing (5  mg / ml, Sigma, St. Louis, MO, VS) toegevoegd. Na een reactie van 4 uur werden de cellen gemengd met 200 L dimethylsulfoxide. Na volledige oplossing werd de optische dichtheidswaarde van cellen in elke groep gemeten door een microplaatlezer (BioRad, Hercules, Californië, VS) bij 490 nm.

Flowcytometrie

De verdeling van de celcyclus werd getest door propidiumjodide (PI) kleuring. Vasculaire endotheelcellen werden losgemaakt, gecentrifugeerd, opnieuw gesuspendeerd met voorgekoelde 75% ethanol en overnacht vastgemaakt bij -20 ° C. De cellen werden gecentrifugeerd om het supernatant weg te gooien. Cellen werden toegevoegd in 450 L PBS, toegevoegd aan 100 L Rnase A en gekleurd met 400  μL PI bij 4  ° C gedurende 30 min waarbij licht werd vermeden. Een flowcytometer (FACSCalibur, Becton, Dickinson and Company, NJ, VS) werd gebruikt om de celcyclusdistributie te testen.

Celapoptose werd getest door annexine V/PI dubbele kleuring. Losgemaakte endotheelcellen werden verzameld en driemaal gewassen met PBS. Cellen werden opnieuw gesuspendeerd met 100 L voorgekoelde 1 x bindingsbuffer en gemengd met respectievelijk 5 L Annexin en 5  μL PI. Celapoptose werd getest met een flowcytometer. Met AnnexinV als transversale as en PI als longitudinale as, stond het linker bovenste kwadrant voor mechanisch beschadigde cellen (AnnexinV ⁻ /PI ⁺ ), het rechter bovenste kwadrant voor late apoptotische cellen of necrotische cellen (AnnexinV ⁺ /PI ⁺ ), het linker onderste kwadrant voor negatieve normale cellen (AnnexinV ⁻ /PI ⁻ ), en het kwadrant rechtsonder voor vroege apoptotische cellen (AnnexinV ⁺ /PI ⁻ ). Het totale aantal apoptotische cellen (AnnexinV ⁺ /PI ⁻ en AnnexinV ⁺ /PI ⁺ ) werden berekend en uitgedrukt als een percentage.

Reverse transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR)

De totale RNA's in de weefsels en cellen werden geabstraheerd door Trizol (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China) en de concentratie en zuiverheid van RNA werden bepaald. Het proces van reverse transcriptie van RNA in complementair DNA werd uitgevoerd in overeenstemming met de instructies van reverse transcription kit (K1621, Fermentas, Maryland, NY, VS). MALAT1-, miR-143- en VEGFA-primersequenties (tabel 1) werden bedacht en samengesteld door Genechem. Om de expressie van lncRNA, miRNA of mRNA te evalueren, werd RT-qPCR uitgevoerd met behulp van SYBR GreenPCR Master Mix (Takara, Tokyo, Japan) met Roche Real-Time PCR-systeem (Roche). U6 werd ingesteld als een interne parameter van miR-143, terwijl MALAT1 en VEGFA, met glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) als interne parameters. De relatieve transcriptionele niveaus van doelgenen werden berekend door 2 ^−△△Ct methode.

Western Blot-analyse

Totaal eiwit uit weefsels en cellen werd geabstraheerd. De eiwitconcentratie werd bepaald door de instructies van de bicinchoninezuurkit (Boster Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Hubei, China). Het eiwit werd gescheiden door elektroforese met 10% polyacrylamidegel (Boster Biological Technology). Het membraan werd overgebracht op een polyvinylideenfluoridemembraan en vervolgens gedurende 1 uur afgesloten met 5% BSA. Het membraan werd geïncubeerd met primair antilichaam tegen Ki-67 (1:1000), VEGFA (1:1000), vWF (1:1000) en matrix metalloproteïnase (MMP)-9 (1:1000, Abcam, Cambridge, VK) , Cyclin D1 (1:1000), Bax (1:1000) en Bcl-2 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californië, VS), en GAPDH (1:2000, Jackson Immuno Research, Grove, Pennsylvania, VS) en met het secundaire antilichaam (1:500, Jackson Immuno Research) gelabeld met mierikswortelperoxide. Het membraan werd verkregen door Odyssey tweekleuren infrarood fluorescentiescanning-beeldvormingssysteem en de grijswaarden van banden werden gemeten met Quantity One-beeldanalysesoftware.

Dual Luciferase Reporter Gene Assay

De bindingsplaatsen van MALAT1 en miR-143 werden voorspeld en uiteengezet door de bioinformatica-website (//cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/). De bindingsrelatie tussen MALAT1 en miR-143 werd verder geverifieerd door luciferase-reportergentest. Het synthetische MALAT1 3-niet-vertaalde regio (3'UTR) genfragment werd geïntroduceerd in pmiR-Report luciferase-reportervectoren (Thermo Fisher Scientific) om MALAT1-wildtype (MALAT1-WT) te genereren door endonucleaseplaats Bamh1 en Ecor1. De complementaire sequentiemutatieplaats van de sequentie werd bedacht op MALAT1-WT en het doelfragment werd ingevoegd in de pmiR-Report luciferasereportervectoren om MALAT1-mutanttype (MALAT1-MUT) te produceren door T4-DNA-ligase na digestie met restrictie-endonuclease. De correct gesequenced MALAT1-WT en MALAT1-MUT werden gecotransfecteerd met mimic NC en miR-143 mimic in vasculaire endotheelcellen. De cellen werden 48 uur na transfectie geoogst en gelyseerd en de luciferase-activiteit werd getest door een luciferase-detectiekit (BioVision, San Francisco, CA, VS) met een luminometer (Glomax20/20, Promega, Madison, Wisconsin, VS).

De doelrelatie van miR-143 en VEGFA en de bindingsplaats van miR-143 en VEGFA 3'UTR werden voorspeld via de bioinformatica-website (//www.targetscan.org/vert_72/). De sequentie van het VEGFA 3'UTR-promotergebied dat de miR-143-bindingsplaats bevat, werd samengesteld en gekloond in pmiR-Report luciferasereportervectoren om VEGFA-WT te genereren. Op basis van deze reporter werd de bindingsplaats van VEGFA-WT en miR-143 gemuteerd om VEGFA-MUT te vormen. VEGFA-WT- of VEGFA-MUT-reporter werd gemengd met mimic NC of miR-143 mimic en vervolgens gedurende 48 uur gecotransfecteerd in vasculaire endotheelcellen. Daarna werden de cellen gelyseerd en werd de luciferase-activiteit getest met een luciferase-detectiekit.

RNA-pull-down-assay

Om de bindingsrelatie tussen miR-143 en MALAT1 te verifiëren, werd een RNA-pull-down-assay geïmplementeerd. Drie biotine-gelabelde miRNA-sequenties Bio-miR-143-WT, Bio-miR-143-MUT en Bio-miR-NC werden ontworpen en toevertrouwd aan GenePharma Company (Shanghai, China). Deze gebiotinyleerde oligonucleotiden werden gedurende 48 uur in cellen getransfecteerd. Vervolgens werden de cellen geoogst en gedurende 10 min geïncubeerd met een specifiek cellysaat (Ambion, Austin, Texas, VS). Daarna werd het lysaat uitgebroed met M-280 streptavidine-kralen die vooraf waren gecoat met RNase-vrij en gist-tRNA (allemaal van Sigma) bij 4 ° C gedurende 3 uur, vervolgens tweemaal schoongemaakt met een koude lysis-oplossing, driemaal met een lage zoutbuffer en eenmaal met een hoogzoutbufferoplossing. Een antagonistische miR-143-sonde werd vastgesteld als een NC. Totaal RNA werd geabstraheerd met Trizol en vervolgens werd het MALAT1-verrijkingsniveau getest met RT-qPCR.

Statistische analyse

Alle gegevens werden uiteengezet door de SPSS 21.0-software (IBM Corp. Armonk, NY, VS). De meetgegevens werden weergegeven door gemiddelde ± standaarddeviatie. Vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd door een onafhankelijke steekproef t test, terwijl vergelijkingen tussen meerdere groepen werden beoordeeld door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA), en paarsgewijze vergelijking werden geïmplementeerd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest. De relatie tussen MALAT1-expressie en de klinisch-pathologische kenmerken van IA werd bepaald met een chi-kwadraattest. P waarde van minder dan 0,05 was indicatief voor een statistisch significant verschil.

Resultaten

MALAT1 en VEGFA worden tot overexpressie gebracht en miR-143 wordt gedownreguleerd in IA-weefsels

ET-1- en vWF-expressie in serum in de IA-groep en controlegroep werden gedetecteerd door ELISA, en de resultaten toonden aan dat ET-1- en vWF-expressie toenamen in de IA-groep versus de controlegroep (beide P <0,05) (Fig. 1a, b).

MALAT1 en VEGFA worden tot overexpressie gebracht en miR-143 wordt gedownreguleerd in IA-weefsels. een ET-1-expressie in serum van IA-patiënten en temporale epilepsiepatiënten door ELISA. b vWF-expressie in serum van IA-patiënten en temporaalkwab-epilepsiepatiënten door ELISA. c Pathologische observatie van IA-weefsels en normale arteriële weefsels door HE-kleuring. d Morfologische observatie van IA-weefsels en normale arteriële weefsels door een transmissie-elektronenmicroscoop. e MALAT1-, miR-143- en VEGFA-mRNA-expressie in IA-weefsels en normale arteriële weefsels door RT-qPCR. v VEGFA-, MMP-9- en vWF-eiwitexpressie in IA-weefsels en normale arteriële weefsels door Western-blot-analyse. Endotheelcellen (EC's), interne elastische lamina (IEL), gladde spiercellen (SMC). Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie; vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd door een onafhankelijke steekproef t testen

De pathologische veranderingen van IA-weefsels werden waargenomen door HE-kleuring. Er werd geen duidelijke schade aan endoderm, endotheelcellen en gladde spiercellen gezien in normale arteriële weefsels, en de cellen waren netjes gerangschikt en hadden een volledige structuur. De IA-weefsels vertoonden beschadigde endotheelcellen, gedegenereerde gladde spiercellen, verzwakte arteriële wand, gescheurde elastische vezels en geïnfiltreerde ontstekingscellen (figuur 1c).

Ultrastructuurveranderingen van IA en normale arteriële weefsels werden waargenomen door een transmissie-elektronenmicroscoop. Er werd gevonden dat de endotheelcellen compleet waren en dat de adventitia-structuur intact was; geen gebroken intern elastisch membraan of apoptotische gladde spiercellen werden gezien in normale arteriële weefsels. In IA-weefsels werd het gepresenteerd met ernstige degeneratie van de bloedvatwand, voornamelijk gemanifesteerd als het verdwijnen van de meeste endotheelcellen, ernstig gebroken interne elastische laag, ernstig beschadigde en gedegradeerde gladde spiercellen en de stoornis van het buitenmembraan van het bloedvat (Fig. 1d).

RT-qPCR werd uitgevoerd voor het bepalen van MALAT1-, miR-143- en VEGFA-mRNA-expressie, terwijl Western-blot-analyse voor VEGFA-, MMP-9- en vWF-eiwitexpressie in IA-weefsels en normale arteriële weefsels. Er werd aangetoond dat in tegenstelling tot de normale arteriële weefsels, MALAT1-, VEGFA-, MMP-9- en vWF-expressieniveaus waren verhoogd en dat miR-143-expressie werd afgebroken in IA-weefsels (alle P <0,05) (Fig. 1e, f).

Hunt-Hess-graad, mate van endotheliale schade en rookgeschiedenis zijn gecorreleerd met MALAT1-expressie in IA-weefsels

In het licht van de mediane expressie van MALAT1 werden de patiënten ingedeeld in twee groepen:een groep met een lage expressie en een groep met een hoge expressie. De relatie tussen MALAT1-expressie en de klinisch-pathologische kenmerken van patiënten met IA werd geanalyseerd. De resultaten suggereerden dat Hunt-Hess-graad, mate van endotheelbeschadiging en rookgeschiedenis geassocieerd waren met MALAT1-expressie (alle P <0,05), terwijl leeftijd, geslacht en chirurgische modus niet gerelateerd waren aan MALAT1-expressie (alle P> 0,05) (Tabel 2).

Downregulated MALAT1 onderdrukt de bloeddruk, de expressie van ET-1, vWF en MMP-9, evenals de apoptotische index van vasculaire endotheelcellen van ratten met IA

Zoals weergegeven in Tabel 3, verslechterde de MALAT1-knockdown, terwijl de MALAT1-restauratie de bloeddruk verhoogde in de 4e en 12e week.

ELISA onthulde dat MALAT1-downregulatie verminderde, terwijl MALAT1-upregulatie de ET-1- en vWF-expressie verhoogde in serum van ratten met IA (Fig. 2a, b).

Neerwaarts gereguleerde MALAT1 onderdrukt de bloeddruk, de expressie van ET-1, vWF en MMP-9, evenals de apoptotische index van vasculaire endotheelcellen van ratten met IA. een ET-1-expressie in serum van ratten door ELISA. b vWF-expressie in serum van ratten door ELISA. c Pathologische veranderingen van IA-weefsels bij ratten waargenomen door HE-kleuring. d De ultrastructuur van IA-weefsels bij ratten waargenomen door een transmissie-elektronenmicroscoop. e Apoptose van vasculaire endotheelcellen door TUNEL-kleuring. v Vasculaire endotheelcel-apoptotische index van ratten. g MALAT1-, miR-143- en VEGFA-mRNA-expressie in IA-weefsels van ratten door RT-qPCR. u VEGFA-, MMP-9- en vWF-eiwitexpressie in IA-weefsels van ratten door Western-blot-analyse. * P <0,05 vs. de sh-NC-groep, # P <0,05 vs. de Oe-NC-groep. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie, en vergelijkingen tussen meerdere groepen werden beoordeeld door eenrichtingsanalyse van variantie gevolgd met Tukey's meervoudige vergelijkingstest

De pathologische veranderingen van IA-weefsels in elke groep werden onderzocht met HE-kleuring. De blanco groep, sh-NC-groep en Oe-NC-groep manifesteerden zich met een beschadigd binnenmembraan, geëxfolieerde endotheelcellen, gedegenereerde gladde spiercellen, verminderde cellen en lagen en een dunnere slagaderwand. In de sh-MALAT1-groep waren de endodermis, endotheelcellen, gladde spiercellaag en buitenste membraanlaag van intracraniale slagader licht beschadigd maar netjes gerangschikt. De Oe-MALAT1-groep vertoonde een verdwenen intimalaag, geëxfolieerde endotheelcellen, gebroken elastische vezels en geïnfiltreerde ontstekingscellen (Fig. 2c).

De IA-weefsels van ratten in elke groep werden waargenomen door een transmissie-elektronenmicroscoop. Er werd aangetoond dat gedenatureerde endotheelcellen, gedesintegreerde subendotheliale laag, verdwenen interne elastische laag en verminderde gladde spiercellen werden gepresenteerd in de blanco groep, sh-NC-groep en Oe-NC-groep. De sh-MALAT1-groep demonstreerde met platte endotheelcellen, ovale kern en verhoogde collageenvezels maar zonder elastische laag. De Oe-MALAT1-groep werd gekenmerkt door verdwenen endotheelcellen en gescheiden elastische laag van de spierlaag, die uiteenviel in het lumen (Fig. 2d).

De apoptotische index van vasculaire endotheelcellen bij IA-rat werd getest door TUNEL-kleuring. Silencing MALAT1 verminderde de apoptotische index van vasculaire endotheelcellen, terwijl tot overexpressie gebrachte MALAT1 het tegenovergestelde effect vertoonde (Fig. 2e, f).

RT-qPCR-detectie van MALAT1-, miR-143- en VEGFA-mRNA-expressie en western-blot-analyse van VEGFA-, MMP-9- en vWF-eiwitexpressie in IA-weefsels toonden aan dat MALAT1-eliminatie de MALAT1-, VEGFA-, MMP-9- en vWF-expressie onderdrukte en verhoogde miR-143-expressie. Integendeel, MALAT1-verhoging legde de tegenovergestelde invloeden op deze genexpressies op (Fig. 2g, h).

Lage expressie van MALAT1 bevordert de levensvatbaarheid en beperkt apoptose van vasculaire endotheelcellen in IA

Immunohistochemische kleuring werd gebruikt om de expressie van endotheelspecifieke marker vWF te detecteren. Het bleek dat het cytoplasma van IA-vasculaire endotheelcellen bedekt was met fijne bruine deeltjes, wat positief was, terwijl het cytoplasma in zijn NC-groep geen bruine deeltjes had. De resultaten bevestigden dat de gekweekte cellen endotheelcellen waren (Fig. 3a, b).

Low expression of MALAT1 advances viability and restrains apoptosis of vascular endothelial cells in IA. een vWF immunohistochemical staining in IA vascular endothelial cells:IA vascular endothelial cells were covered with fine yellow particles. b vWF immunohistochemical staining in IA vascular endothelial cells:IA vascular endothelial cells showed no brown particles in the NC group. c Vascular endothelial cell viability in each group by MTT assay. d Protein expression of CyclinD1 and Ki-67 in each group by western blot analysis. e Cell cycle changes in each group by PI staining. v Cell apoptosis rate in each group by Annexin V/PI double staining. g Bax and Bcl-2 protein expression in each group by western blot analysis. * P <0.05 vs. the sh-NC group, # P <0.05 vs. the Oe-NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way analysis of variance followed with Tukey’s multiple comparisons test

MTT assay, flow cytometry, together with western blot analysis were utilized to test vascular endothelial cell viability and apoptosis. It was displayed that MALAT1 diminution promoted vascular endothelial cell viability (heightened Cyclin D1 and Ki-67 expression) and depressed apoptosis (decreased G0/G1 phase cells and increased S and G2/M phase cells, reduced Bax and elevated Bcl-2 expression). However, MALAT1 upregulation functioned in an opposite way to that of MALAT1 diminution on cell viability and apoptosis (Fig. 3c–g).

MiR-143 Is Bound to MALAT1 and VEGFA Is a Target Gene of miR-143

MALA1, miR-143, and VEGFA expression in vascular endothelial cells of each group were verified through RT-qPCR and western blot analysis. The results presented that MALA1 knockdown depressed MALA1 and VEGFA expression and enhanced miR-143 expression. On the contrary, MALA1 upregulation led to the increment in MALAT1 and VEGFA expression and the reduction in miR-143 expression (Fig. 4a, b).

MiR-143 is bound to MALAT1 and VEGFA is a target gene of miR-143. een MALAT1, miR-143, and VEGFA mRNA expression in vascular endothelial cells of aneurysm in each group. b VEGFA protein expression in vascular endothelial cells of aneurysm in each group. c The binding sites of MALAT1 and miR-143 predicted by the bioinformatics website. d The regulatory relation of MALLA1 and miR-143 validated by dual luciferase reporter gene assay. e The binding relationship between MALAT1 and miR-143 verified by RNA-pull down assay. v The binding sites of miR-143 and VEGFA predicted by the bioinformatics website. g The regulatory relation of miR-143 and VEGFA validated by dual luciferase reporter gene assay. * P <0.05 vs. the sh-NC group, # P <0.05 vs. the Oe-NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, comparisons between two groups were assessed by independent sample t test, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way analysis of variance followed with Tukey’s multiple comparisons test

The specific binding region between MALAT1 and miR-143 was divined by online analysis software (Fig. 4c). The results of dual luciferase reporter gene assay revealed that the luciferase activity was impaired in the MALAT1-WT + miR-143 mimic group versus the MALAT1-WT + mimic-NC group (P <0,05). However, there was no distinct difference in luciferase activity in the MALAT1-MUT + miR-143 mimic group relative to that in the MALAT1-MUT + mimic-NC group (P> 0.05), indicating that miR-143 was specifically bound to MALAT1 (Fig. 4d). The results of RNA-pull down assay reported that the enrichment level of MALAT1 in the Bio-miR-143-WT group was heightened compared to the Bio-miR-NC group (P <0.05), but there was no distinct difference in MALAT1 enrichment level in the Bio-miR-143-MUT group (P> 0.05) (Fig. 4e).

Bioinformatics software divined a targeted relationship between miR-143 and VEGFA (Fig. 4f). The results of luciferase activity showed that the relative luciferase activity repressed after VEGFA-WT and miR-143 mimic co-transfected into vascular endothelial cells (P <0,05). However, the relative luciferase activity of vascular endothelial cells was not affected by co-transfection of VEGFA-MUT and miR-143-mimic (P> 0.05) (Fig. 4g). It was indicated that VEGFA was a direct target gene of miR-143.

Discussion

IA is a serious intracranial disease, which mainly leads to subarachnoid hemorrhage [18]. A previous study has demonstrated the involvements of lncRNA-related competitive endogenous RNA networks in IA [19]. Also, a recent study has provided a proof that functional polymorphism in miR-143/145 gene promoter region is connected with the risk of IA [20]. In a study conducted by Xu et al. , it is shown that overexpression of angiogenic factors, such as VEGFA, may be related to IA formation and rupture [21]. In order to explain the molecular mechanism of MALAT1 in IA, a series of assays have been conducted and the results revealed that IA induced by vascular endothelial injury was regulated by MALAT1/miR-143/VEGFA signal axis.

Firstly, our study has provided substantial evidence that MALAT1 and VEGFA are upregulated and miR-143 is downregulated in IA tissues. A recent study has presented that MALAT1 is one of the most upregulated lncRNAs in the process of cerebral ischemia [22]. Another study has presented that MALAT1 is upregulated in ovarian cancer cells and intends to participate in the processes of ovarian cancer cell apoptosis, migration, and proliferation [23]. A study concerning to the expression profile of unruptured and ruptured IA has demonstrated that the expression of angiogenic factors such as VEGFA is upregulated in ruptured aneurysm [21]. Moreover, a clinical study has presented that the miR-143/145 cluster of IA patients is downregulated compared to healthy subjects [11]. In addition, it is previously discussed that miR-143/145 takes part in various biological processes associated with aneurysm formation and is downregulated in patients with IA [20]. All these findings are more or less echoed with the previous exploration outcomes.

Except for the abovementioned findings, this study has also explored the functional role of MALAT1 in IA through gain-off-function and loss-of-function assays. It could be summarized that downregulation of MALAT1 reduced blood pressure, serum levels of ET-1, and vWF and MMP-9 expression in IA tissues. It has been suggested previously that downregulation of MALAT1 restrains the upregulation of the glucose-induced ET-1 transcription product [24]. Also, it is reported that ectopic MALAT1 expression is the inducer of vWF generation [25]. Another study has verified that the depletion of MALAT1 in bone marrow-derived macrophages inhibits the expression of MMP-9 [26].

Also, cell experiments have been conducted for further confirmation of the functions of MALAT1 in IA. The results have suggested that MALAT1 knockdown promoted vascular endothelial cell viability and depressed apoptosis in IA. Similarly, it has been documented that disturbance of MALAT1 improves aortic mural architecture and retards aneurysm growth [8]. Supplementary to our study finding, there is research highlighting that poor expression of MALAT1 induces apoptosis and restrains proliferation of acute myeloid leukemia cells [27]. Another study has also demonstrated the inhibitory effects of MALAT1 knockdown on proliferation of human osteoarthritis cartilage cells [28]. Besides that, a prior research generally confirms that downregulation of MALAT1 can induce apoptosis and attenuate the proliferation of glioma cells [29]. Moreover, low expression of MALAT1 induced by RNA interference promotes apoptosis and suppresses proliferation of multiple myeloma cells [30]. Collectively, these studies have explained the molecular mechanism of MALAT1 in IA to some extent.

In addition, this study has evidenced that miR-143 is bound to MALAT1 and VEGFA is a target gene of miR-143. Similarly, a paper contends that MALAT1 binds directly to miR-143 and suppresses its expression [10]. Zhu et al. have found that MALAT1 exerts its roles via interacting with miR-143 in cervical carcinoma cells [31]. It is further confirmed that MALAT1 indirectly modulate VEGFA via miR-200b-3p [32]. Moreover, another study has suggested that miR-143-3p mediates ZFPM2 effect on a number of protein targets in blood, including VEGFA [33]. Nevertheless, the interactions among MALAT1, miR-143, and VEGFA in IA have not been discussed and need further study.

Conclusion

From these results, it is clear that MALAT1 knockdown depresses apoptosis and promotes viability of vascular endothelial cells in IA by modulating miR-143/VEGFA axis. The co-expression network suggests the connection between MALAT1 and miR-143 with the involvement of VEGFA. The findings in this study partially disclose the pathogenesis of IA initiation and progression, and the studied targets may be a notably potential entry point to reveal pathology of IA from another perspective. Limitedly, further large-scale studies are required to comprehensively illustrate the mechanisms of MALAT1/miR-143/VEGFA axis in IA.