Ferumoxytol verzwakt de functie van MDSC's om door LPS geïnduceerde immunosuppressie bij sepsis te verbeteren

Abstract

Door sepsis geïnduceerde immunosuppressie wordt erkend als een van de belangrijkste kenmerken die verantwoordelijk zijn voor therapeutische mislukkingen. Van myeloïde afgeleide suppressorcellen (MDSC's), die voornamelijk worden gekenmerkt door hun onderdrukkende eigenschappen, is gemeld dat ze bij sepsis worden uitgebreid. Van ferumoxytol (FMT), een door de FDA goedgekeurd ijzersupplement, is aangetoond dat het immuunmodulerende eigenschappen bezit in tumoren. Het is echter onduidelijk of FMT de functies van MDSC's verandert om late-sepsis immunosuppressie te verminderen. Hier toonden we een immunomodulerend effect van FMT op MDSC's om door lipopolysaccharide (LPS) geïnduceerde immunosuppressie in het late stadium van sepsis te verbeteren. Scheiding van cellen met geïnternaliseerde FMT en detectie van het intracellulaire ijzergehalte toonde aan dat MDSC's FMT konden opnemen. Lage doses FMT hadden geen effecten op de cellevensvatbaarheid van MDSC's, maar FMT remde de expansie van MDSC's in vitro. Bovendien verlaagde FMT de expressieniveaus van Arg-1, S100A8, S100A9 en p47phox aanzienlijk, evenals de ROS-productie in MDSC's. FMT verlaagde het percentage granulocytische MDSC's (G-MDSC's) en bevorderde de differentiatie van MDSC's in macrofagen. Bovendien verminderde FMT de rekrutering van witte bloedcellen en verdikking van de alveolaire wand in de longen en gebieden met necrose in de lever, evenals enkele biochemische markers van leverdisfunctie. FMT verlaagde het percentage G-MDSC's en monocytische MDSC's (M-MDSC's) in de milten van LPS-geïnduceerde septische muizen. Merk op dat FMT de T-cel-immunosuppressieve functies van zowel G-MDSC's als M-MDSC's verminderde. Naar verwachting verminderde FMT ook significant de Arg-1- en p47phox-genexpressie in milt CD11b⁺ Gr-1⁺ cellen geïsoleerd uit LPS-uitgedaagde muizen. Deze gegevens geven aan dat FMT de immunosuppressieve functies van MDSC's verminderde door de productie van Arg-1 en ROS te verminderen, wat suggereert dat FMT de immunosuppressie op lange termijn in het late stadium van sepsis kan verminderen.

Inleiding

FMT, een ijzersupplement goedgekeurd door de Food and Drug Administration, is gebruikt voor de behandeling van bloedarmoede door ijzertekort bij volwassenen met chronische nierziekte (CKD) [1], en FMT wordt ook veel gebruikt als contrastmiddel en drager van geneesmiddelen [2] . Eerdere studies toonden aan dat FMT immunomodulerende eigenschappen had, zoals het vermogen om een fenotypische verschuiving in M2-macrofagen te induceren naar een hoge CD86⁺ , TNF-α-positief M1-macrofaagsubtype [3, 4]. De effecten van FMT op andere immuuncellen zijn echter niet onderzocht.

MDSC's zijn een heterogene populatie van onrijpe myeloïde cellen met een krachtige immuunonderdrukkende capaciteit [5]. Bij muizen zijn MDSC's herkenbaar als Gr-1⁺ CD11b⁺ cellen, terwijl menselijke MDSC's de Gr-1-homoloog missen en worden gedefinieerd als CD14⁻ HLA-DR⁻ CD11b⁺ CD33⁺ of CD14⁺ HLA-DR⁻ CD11b⁺ CD33⁺ cellen [6]. MDSC's bestaan uit twee grote groepen cellen, granulocytische of PMN-MDSC's en M-MDSC's, en beide populaties hebben immuunonderdrukkende functies door de productie van iNOS, ROS en Arg-1. De verhoogde activiteit van Arg-1 put l-arginine uit en het tekort aan l-arginine remt de proliferatie van T-cellen door de expressie van de CD3-zeta-keten te verminderen. INOS genereert NO, dat de functies van zowel JAK3 als STAT6 in T-cellen remt, evenals de expressie van MHC II. ROS induceert de posttranslationele modificatie van T-celreceptoren en kan ervoor zorgen dat antigeenspecifieke T-cellen niet meer reageren [7]. M-MDSC's komen voort uit monocyt-precursoren en kunnen onder geschikte cytokine-omstandigheden differentiëren in macrofagen en DC's. De meeste van onze kennis over MDSC's komt voort uit kankeronderzoeken. In de afgelopen jaren is ook een uitbreiding van MDSC's beschreven bij acute en chronische ontstekingsziekten, waaronder ontstekingen, brandwonden en auto-immuunziekten [8, 9]. Onlangs werd een hoog niveau van opname van fluorescerende nanodeeltjes door MDSC's in de slokdarm en milt van muizen gerapporteerd in beeldvormende onderzoeken [10]. Het is echter onduidelijk of FMT de functie verandert van MDSC's die betrokken zijn bij de ontwikkeling van ontstekingsziekten.

Sepsis, een ontregelde ontstekingsreactie van de gastheer op een ernstige infectie die levensbedreigende orgaandysfunctie kan veroorzaken, is de meest voorkomende doodsoorzaak op de intensive care. Sepsis veroorzaakt een overweldigende pro-inflammatoire respons die, als deze niet vroeg wordt behandeld, snel verandert in langdurige immunosuppressie. De uitbreiding van MDSC's is beschreven in de milten en lymfeklieren in septische diermodellen [8, 11], evenals bij patiënten met sepsis [12,13,14]. De activering van immunosuppressieve cellen zoals MDSC's is van cruciaal belang voor een juiste controle van de hyperreactiviteit van het aangeboren immuunsysteem, maar hun overmatige expansie kan leiden tot hyperimmunosuppressie, wat de belangrijkste drijvende kracht is voor secundaire infectie en mortaliteit bij late sepsis. Verhoogde aantallen MDSC's correleren met de onderdrukking van de proliferatie van lymfocyten. Er is gemeld dat MDSC's hun fenotype verwerven in het beenmerg en vervolgens migreren naar secundaire lymfoïde organen om T-celreacties te remmen en hun proliferatie te onderdrukken in muizen met LPS-immunosuppressie [8]. De meeste patiënten met langdurige sepsis vertonen een immunosuppressieve status, en de meeste sepsismortaliteit is te wijten aan late-sepsis immunosuppressie. Het elimineren van MDSC's kan gunstige effecten hebben bij late sepsis door de immuunrespons te herstellen [15]. Daarom veronderstelden we dat FMT de functies van MDSC's zou kunnen moduleren om late-sepsis immunosuppressie te verminderen.

Hier toonden we een immunomodulerend effect van FMT op MDSC's. We gebruikten de magnetische eigenschappen van FMT om te onthullen dat MDSC's FMT in vitro konden fagocyteren. Bovendien vonden we dat FMT de immunosuppressieve functie van MDSC's verzwakte via downregulatie van Arg-1 en ROS. Bovendien bevestigden in vivo experimenten dat FMT het late stadium van LPS-geïnduceerde sepsis bij muizen verbeterde door het vermogen van MDSC's om T-cellen te remmen te verzwakken. Onze gegevens suggereren dat de immunomodulerende functie van FMT kan worden gebruikt om de immunosuppressie die optreedt bij late sepsis te behandelen.

Materialen en methoden

Muizen

Mannelijke C57BL/6-muizen (8-10 weken oud) werden gekocht bij het Model Animal Research Center van Nanjing University (Nanjing, China). De muizen werden gefokt onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden in een 24-uurs licht/donkercyclus en kregen vrije toegang tot voedsel en water. Alle experimenten met muizen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Nanjing University.

Pruisische blauwe kleuring

Intracellulaire FMT-distributie werd gedetecteerd met behulp van Perl's Pruisische blauwe kleuringskit (Solarbio, China) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werden cellen gedurende 15 min gefixeerd in 4% paraformaldehyde en vervolgens gedurende 25-30 min geïncubeerd met 10% kaliumferrocyanide, gevolgd door wassen en tegenkleuring met nucleair snel rood gedurende 10 min. Cellen met blauwe deeltjes in het cytoplasma waren positief voor Pruisische blauwe kleuring.

Generatie van beenmerg-afgeleide MDSC's

Beenmergcellen werden verkregen door de dijbenen en tibia's van wildtype muizen te spoelen, gevolgd door RBC-lysis. De beenmergcellen werden gekweekt in compleet RPMI-1640-medium met 10% FBS, 1% v/v penicilline en streptomycine (Gibco, CA), 40 ng/ml granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) (Miltenyi Biotech, Duitsland) en 40 ng/mL IL-6 (Miltenyi Biotech, Duitsland) bij 37 °C in een 5% CO₂ incubator voor 4 dagen. Niet-adherente cellen werden verzameld voor verdere experimenten.

Cell Viability Assay

De levensvatbaarheid van de cellen werd geanalyseerd met behulp van de Cell Counting Kit-8 (Dojino, Kumamoto, Japan) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort, MDSC's (5 × 10³ ) werden uitgeplaat in kweekplaten met 96 putjes en geïncubeerd in een 5% CO₂ atmosfeer bij 37°C voor de behandeling. Het medium werd vervolgens vervangen door vers medium met verschillende concentraties FMT (250, 500, 1000, 2000 g/ml) gedurende 24 u. Het supernatant werd vervolgens weggegooid en vers medium met CCK-8-oplossing werd toegevoegd. Na 3 uur geïncubeerd te zijn bij 37°C, werd de absorptie gemeten bij 450 nm met behulp van een Gen5 microplaatlezer (BioTek, VS).

Isolatie van totaal RNA en realtime PCR

Totaal RNA werd uit cellen geëxtraheerd met behulp van het TRIzol-reagens (Invitrogen, VS) en gekwantificeerd met een Nanodrop-spectrofotometer (Thermo Scientific, VS) voordat het omgekeerd werd getranscribeerd met behulp van de HiScript II 1e streng cDNA-synthesekit (Vazyme Biotech Co., Ltd, China) volgens de instructies van de fabrikant. Realtime kwantitatieve polymerasekettingreactie (PCR) werd uitgevoerd met behulp van de SYBR Green PCR-kit (Bio-Rad, Hercules, CA) op een Applied Biosystems StepOne-Plus realtime qPCR-systeem (Applied Biosystems, Forster City, CA). Genexpressie werd genormaliseerd naar GAPDH met behulp van de 2^−ΔΔCt methode. De primersequenties staan vermeld in Aanvullend bestand 1:Tabel S1.

Flowcytometrie

Weefsels werden bereid als eencellige suspensies met collagenase type D (1 mg / ml) en DNase I (0,1 mg / ml) in Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) bij 37 ° C gedurende 30 min, en vervolgens de rode cellen van de milt was gelyseerd. De celsuspensies werden gefiltreerd door celzeven van 70 m en de lymfocyten werden verzameld door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 min bij 4 °C. Na het wassen werden de cellen onmiddellijk voorbereid voor door fluorescentie geactiveerde celsortering. Enkele cellen werden gedurende 10 min geïncubeerd met FcR-blokkerend reagens (Miltenyi Biotech, Duitsland), gevolgd door kleuring met de volgende antilichaamconjugaten gedurende 20 min:FITC-gelabeld anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD4 en anti-CD8; PE-gelabeld anti-Ly6G; APC-gelabeld anti-Ly6C, anti-CD3, anti-F4/80 en anti-MHC II (BioLegend, CA). Na het wassen werden cellen gedetecteerd met een FACS Calibur (BD, CA) en werden de gegevens geanalyseerd met FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., VS)

H&E-kleuring

Lever- en longweefsels werden gefixeerd in 4% fosfaatgebufferde formaldehyde. Vast weefsel werd ingebed in paraffine en coupes van 5 μm dik werden gekleurd met hematoxyline en eosine voor lichtmicroscopie.

Enzym-Linked Immunosorbent Assay

Serumniveaus van TNFa, MCP-1 en IL-1β werden bepaald met behulp van specifieke ELISA-kits (Dakewe, China) volgens de instructies van de fabrikant. Elk monster werd in tweevoud uitgevoerd.

Detectie van ROS

Intracellulaire ROS werd gemeten met behulp van de 2,7-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DCFH-DA) kit (Beyotime, China) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werden de cellen tweemaal gewassen met PBS en 30 min geïncubeerd met 5 M DCFH-DA bij 37 °C in het donker, vervolgens gewassen met RPMI-1640-medium en opnieuw gesuspendeerd in PBS. Cellen werden geanalyseerd op intracellulaire groene fluorescentie met behulp van een flowcytometer (BD, CA).

T-celproliferatietest

Totaal aantal CD3⁺ T-cellen werden verrijkt uit de milt van wildtype muizen met behulp van een CD3ε MicroBead-kit (Miltenyi Biotech, Duitsland) en geïncubeerde CFSE-kleuring (Invitrogen, VS). Voor anti-CD3/CD28-antilichaam-geïnduceerde T-celproliferatie werden T-cellen geactiveerd met anti-CD3-antilichaam (1 g/ml) en anti-CD28-antilichaam (1 μg/ml). G-MDSC's (Gr-1^hoog Ly-6G⁺ ) en M-MDSC's (Gr-1^dim Ly-6G⁻ ) geïsoleerd uit milten van met FMT behandelde of met drager behandelde muizen met behulp van een Myeloid-Derived Suppressor Cell Isolation-kit (Miltenyi Biotech, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. MDSC's werden samen gekweekt in een verhouding van 1:1 met CFSE-gelabelde CD3⁺ T-cellen in platen met 96 putjes met vlakke bodem gedurende 3 dagen. CFSE wordt bij elke deling gelijk verdeeld over dochtercellen; daarom werd proliferatie bepaald door flowcytometrie. De zuiverheid van de cellen na sortering was> 90%.

Statistieken en gegevensanalyse

Alle statistieken werden berekend met behulp van de GraphPad Prism 6-software (GraphPad Software, CA) en worden weergegeven als de gemiddelden ± standaarddeviaties (SD). Verschillen tussen twee groepen werden geanalyseerd door de Mann–Whitney U test of ongepaarde, tweezijdige Student's t test. One-way ANOVA werd gebruikt voor de vergelijking van meerdere groepen. Alle experimenten werden minstens drie keer herhaald. Verschillen met p waarden <0,05 werden als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Een groot aantal MDSC's Opname FMT

Om te verifiëren of cellen met geïnternaliseerde FMT worden gescheiden door MACS MicroBeads, hebben we Pruisische blauwe kleuring gebruikt om het intracellulaire ijzergehalte te detecteren in macrofagen die gedurende 24 h met FMT (1000 ng / ml) zijn behandeld. De cellen werden in drie groepen verdeeld:vóór magnetische scheiding, FMT-positieve cellen die magnetisch waren geselecteerd (FMT+) en die niet magnetisch geïsoleerd waren (FMT-). Pruisische blauwe kleuring toonde aan dat de meeste magnetisch geselecteerde cellen Pruisisch blauw positief waren (Fig. 1a). Om het vermogen om FMT te fagocyteren tussen MDSC's, macrofagen en DC's te vergelijken, isoleerden we splenocyten van naïeve C57BL/6-muizen die gedurende 6 uur, 12 uur, 24 uur en 48 uur met FMT waren behandeld. Splenocyten werden verdeeld in twee subsets:vóór magnetische scheiding en FMT-positieve cellen. Flowcytometrische analyse onthulde dat bijna 60% van de MDSC's en meer dan 60% van de macrofagen FMT accumuleerden na 12-48 h (Fig. 1b, c). Slechts ongeveer 40% van de DC's was FMT-positief na 24 h. Deze gegevens toonden aan dat MDSC's, net als macrofagen, FMT kunnen opnemen en suggereerden dat FMT de MDSC-functie kan beïnvloeden.

Vaardigheden van MDSC's, macrofagen en DC's om FMT op te nemen. een Macrofagen werden behandeld met FMT (1000 ng/ml) gedurende 24 u, daarna gekleurd met Pruisisch blauw om de cellulaire aanwezigheid en afzetting van ijzer tussen drie groepen vast te stellen:vóór magnetische scheiding, magnetisch geselecteerd (FMT+), niet magnetisch geïsoleerd (FMT-) . b Splenocyten van naïeve C57BL/6-muizen werden 6 uur, 12 uur, 24 uur en 48 uur met FMT geïncubeerd. FACS-analyse van de percentages MDSC's, macrofagen en DC's in twee subsets:vóór magnetische scheiding, FMT-positieve cellen. c De verhouding van FMT-positieve cellen tot cellen vóór magnetische scheiding. Alle gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten voor elke experimentele groep en worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie

FMT remt de uitbreiding van MDSC's in vitro

Er is gemeld dat FMT een fenotypische verschuiving induceert in M2-macrofagen naar een hoge CD86⁺ , TNF-α-positief M1-macrofaagsubtype [3]. Aangezien er een groot aantal MDSC's is die FMT kunnen opnemen, veronderstelden we dat FMT de functie van MDSC's zou kunnen veranderen. Eerst werden de cytotoxische effecten van FMT bij 250, 500, 1000 en 2000 g/mL op MDSC's geëvalueerd met de CCK8-cellevensvatbaarheidstest. De resultaten toonden aan dat FMT geen effect had op de levensvatbaarheid van cellen bij lage doses en slechts matige cytotoxiciteit vertoonde bij de maximale dosis van 2000 g / ml (Fig. 2a). Vervolgens hebben we getest of FMT bij verschillende concentraties de generatie van MDSC's zou beïnvloeden. Beenmergcellen geïsoleerd uit naïeve C57BL/6-muizen werden gedurende 4 dagen behandeld met medium of verschillende concentraties FMT (250, 500, 1000 en 2000 g/ml), gevolgd door karakterisering met flowcytometrie op dag 4. GM-CSF en IL-6 werd op dag 0 toegevoegd. De resultaten van drie onafhankelijke experimenten onthulden dat FMT bij 1000 en 2000 g/ml de expansie van MDSC's significant verminderde (Fig. 2b, c).

Flowcytometrische kwantificering van het percentage CD11b⁺ Gr-1⁺ cellen na behandeling met FMT bij 250, 500, 1000, 2000 μg/ml in vitro. een De levensvatbaarheid van MDSC-cellen werd gedetecteerd met behulp van CCK8-assays na behandeling met verschillende concentraties FMT gedurende 24 h. b , c Beenmergcellen geïsoleerd uit C57BL/6-muizen werden gedurende 4 dagen gekweekt met GM-CSF en IL-6 in aanwezigheid van verschillende concentraties FMT, en de celfenotypes werden geëvalueerd door middel van flowcytometrie. Alle gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten voor elke experimentele groep en worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 zoals bepaald door t . van een ongepaarde Student test versus cellen behandeld met alleen vehiculum

FMT vermindert het immunosuppressieve vermogen van MDSC's

MDSC's gebruiken verschillende mechanismen om de proliferatie en effectorfunctie van T-cellen te remmen, met als best beschreven de productie van ROS en Arg-1. Expressie van de p47phox-component van het nicotinamide-adenine-dinucleotide-fosfaat-oxidase (NOX) -complex is verantwoordelijk voor de ROS-productie in MDSC's [5]. Er werd gemeld dat S100A8/A9 wordt gesynthetiseerd en uitgescheiden door MDSC's in een autocriene inflammatoire lus en dat dit belangrijk is bij de onderdrukking van de dendritische celfunctie in muismodellen [16]. Om te bepalen of FMT de functie van MDSC's zou kunnen veranderen, hebben we BM-afgeleide MDSC's verkregen zoals eerder beschreven en RT-PCR gebruikt om mRNA-expressie te meten in met FMT behandelde MDSC's versus onbehandelde controles. De resultaten onthulden dat met FMT behandelde MDSC's de expressieniveaus van Arg-1, S100A8, S100A9 en p47phox significant downreguleerden in vergelijking met onbehandelde MDSC's (Fig. 3a-h). Vervolgens evalueerden we ROS-niveaus in controle-MDSC's en FMT-behandelde MDSC's. De resultaten onthulden dat met FMT behandelde MDSC's een significant lager niveau van ROS vertoonden dan controlecellen (Fig. 3i, j). Vervolgens vergeleken we de veranderingen in de MDSC-subpopulaties in de met FMT behandelde en onbehandelde groepen. De resultaten toonden aan dat FMT het percentage G-MDSC's verlaagde, waarbij ook een lichte toename van M-MDSC's werd waargenomen (Fig. 3k, l).

FMT verandert de functie van MDSC's in vitro. Van beenmerg afgeleide MDSC's behandeld met vehikel of FMT gedurende 24 h. een –u Arg-1-, S100A8-, S100A9- en p47phox-genexpressie van behandelde MDSC's zoals gemeten met kwantitatieve RT-PCR. ik Van BM afgeleide MDSC's werden 24 uur lang met FMT geïncubeerd en ROS-productie werd gedetecteerd door FCM. j Kwantitatieve gegevens van i . k Subpopulaties van MDSC's in de met FMT behandelde en controlegroepen. ik FACS-analyse van de percentages G-MDSC's en M-MDSC's. Alle gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten voor elke experimentele groep en worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie. *p <0,05, **p <0.01, ***p <0,001 zoals bepaald door t . van een ongepaarde Student test versus cellen behandeld met alleen vehiculum

FMT bevordert de differentiatie van MDSC's in macrofagen

Om te bepalen of FMT de uiteindelijke differentiatie van MDSC's in macrofagen stimuleert, behandelden we cellen met 1000 g/mL FMT op dag 0 en voerden we flowcytometrie uit voor de macrofaag-geassocieerde markers CD11b en F4/80 op dag 1, 3 en 5. De resultaten toonden aan dat 1 dag na de toevoeging van 1000 g/mL FMT het aandeel macrofagen significant meer dan 2-voudig toenam in vergelijking met onbehandelde cellen. Evenzo waren 3 dagen en 5 dagen na behandeling met FMT de verhoudingen van macrofagen ook significant verhoogd (Fig. 4a, b).

Effect van FMT op de differentiatie van MDSC's. een , b Van beenmerg afgeleide MDSC's werden behandeld met of zonder 1000 g / ml FMT en het aantal macrofagen werd beoordeeld na 1 dag, 3 dagen en 5 dagen door FACS. Alle gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten voor elke experimentele groep en worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie. *p <0,05, versus cellen behandeld met alleen vehiculum

FMT verbetert symptomen bij LPS-geïnduceerde septische muizen

Er is gemeld dat sepsis geassocieerd is met weefselbeschadiging en leidt tot orgaanfalen en endotheeldisfunctie [17]. Om te onderzoeken of FMT late sepsissymptomen vermindert, werd de mate van orgaanschade bij de experimentele muizen na 10 dagen geëvalueerd. Een histopathologisch onderzoek van de longen bij door LPS geïnduceerde sepsis gaf aan dat FMT de rekrutering van witte bloedcellen en de verdikking van de alveolaire wand verminderde in vergelijking met de met drager behandelde muizen. H &E-kleuring onthulde ook dat het gebied van levernecrose kleiner was in de met FMT behandelde muizen in vergelijking met de met drager behandelde muizen (Fig. 5a, b). Bovendien waren aspartaattransaminase-serumspiegels, gebruikt als een biochemische marker van leverdisfunctie bij deze dieren, significant lager in de levers van met FMT behandelde muizen in vergelijking met de controle (Fig. 5c). FMT had echter geen invloed op de niveaus van alanine-aminotransferase (figuur 5d). Bovendien wordt gedacht dat sepsis geassocieerd is met nadelige uitkomsten zoals verhoogde productie van inflammatoire cytokines; daarom hebben we veranderingen in de niveaus van pro-inflammatoire cytokines in het serum beoordeeld. Het niveau van TNF-α in het serum was enigszins, maar niet significant, lager in met FMT behandelde muizen 3 uur na LPS-injectie, en er werden geen verschillen in MCP-1- of IL-1β-niveaus waargenomen tussen met FMT behandelde muizen en vehikel -behandelde muizen (Fig. 5e-g).

FMT verbetert leverbeschadiging bij door LPS geïnduceerde septische muizen. een Muizen ontvingen ofwel PBS ofwel een i.p. injectie van 5 mg/kg lichaamsgewicht van bacterieel LPS op dag 0. Na 1 uur en 5 dagen werd FMT in een dosis van 10 mg/kg of 100 µL zoutoplossing toegediend via de staartader. Muizen werden verdeeld in vier groepen (n =6):controle, ontvangend voertuig; LPS, alleen LPS ontvangend; FMT, alleen FMT ontvangen; en LPS + FMT, die LPS en FMT ontvangt. b Long- en leverweefsels werden gekleurd met hematoxyline en eosine. c-d Serumtransaminasen (ALT en AST) werden gemeten (n =6). Cytokineniveaus (TNF-a, IL-1β en MCP-1) werden gemeten met ELISA. e -g Effecten van door LPS geïnduceerde sepsis op cytokineproductie in met drager of met ferumoxytol behandelde muizen. Cytokineniveaus gemeten met ELISA in het serum van met drager of ferumoxytol behandelde muizen volgend op i.p. LPS-uitdaging (50 mg/kg). **p <0,01 zoals bepaald door t . van een ongepaarde Student testen

FMT verlaagt het aantal MDSC's in de milt van LPS-geïnduceerde septische muizen

Steeds meer bewijs ondersteunt dat sepsis-geassocieerde immunosuppressie de mortaliteit verhoogt [18], en MDSC's worden beschouwd als een belangrijk onderdeel van het immunosuppressieve netwerk [8]. Er is gemeld dat G-MDSC's specifieker zijn uitgebreid bij septische patiënten en belangrijke actoren lijken te zijn van door sepsis geïnduceerde immuunsuppressie [12]. Om te bepalen of FMT MDSC-populaties moduleert in wildtype muizen, kregen C57BL/6-muizen FMT toegediend via de staartader op uur 1 en dag 5. De resultaten toonden aan dat er geen significante verschillen in het percentage MDSC's werden gedetecteerd in de milt of het bot merg tussen de controle en FMT-behandelde muizen (Fig. 6a, e). Merk op dat FMT de LPS-afhankelijke uitbreiding van CD11b⁺ . heeft verminderd Gr-1⁺ cellen in zowel het beenmerg als de milt (Fig. 6a, e), wat consistent is met in vitro-onderzoeken. Bovendien verlaagde FMT ook het percentage G-MDSC's en M-MDSC's in de milt, terwijl alleen het percentage G-MDSC's in het beenmerg was verlaagd (Fig. 6c, g). Deze gegevens geven aan dat FMT het aantal MDSC's in de milt van door LPS geïnduceerde septische muizen verlaagt.

FMT vermindert het aantal MDSC's in door LPS geïnduceerde septische muizen. Muizen werden verdeeld in vier groepen (n =6):controle, ontvangend voertuig; LPS, alleen LPS ontvangend; FMT, alleen FMT ontvangen; en LPS + FMT, die LPS en FMT ontvangt. een CD11b⁺ Gr-1⁺ celpopulaties in het beenmerg werden gedetecteerd door FACS. b Kwantitatieve gegevens van a . c Flowcytometrie dot plot van Ly6C- en Ly6G-expressie in de gated CD11b⁺ cellen uit de milt. d Kwantificering van de percentages van de subsets van granulocyten en monocyten. e CD11b⁺ Gr-1⁺ celpopulaties in de milten werden gedetecteerd door FCM. v Kwantitatieve gegevens van e . g Flowcytometrie dot plot van Ly6C- en Ly6G-expressie in de gated CD11b + -cellen van milten. u Kwantificering van de percentages van de subsets van granulocyten en monocyten. *p <0,05 zoals bepaald door t . van een ongepaarde Student testen

FMT vermindert de T-cel immunosuppressieve eigenschappen van MDSC's in vivo

De numerieke reductie van meerdere immuuncelpopulaties, waaronder CD4- en CD8-T-cellen, is een belangrijk kenmerk van de adaptieve immuunrespons na sepsis. Het wordt geassocieerd met een verhoogd risico op overlijden, evenals andere slechte resultaten [19, 20]. Er is aangetoond dat MDSC's de proliferatie van T-cellen onderdrukken door de T-cel-zeta-keten-expressie bij sepsispatiënten te verminderen [21]. Om het aandeel lymfocyten in sepsis in een laat stadium te evalueren, hebben we het aandeel CD4- en CD8-T-cellen gemeten in een murine sepsismodel. De resultaten toonden aan dat de FMT een toename van CD4- en CD8-T-cellen in de milten van de door LPS geïnduceerde muizen veroorzaakte (Fig. 7a, b). Er waren geen verschillen in percentages CD4- en CD8-T-cellen in de milt van met FMT behandelde muizen in vergelijking met controlemuizen (Fig. 7a, b). Om de rol van MDSC's bij het onderdrukken van T-celproliferatie in vivo verder te bevestigen, werden G-MDSC's en M-MDSC's geïsoleerd uit de milten van drager of FMT-behandelde LPS-uitgedaagde muizen door MACS en samen gekweekt met CD3 T-cellen bij een 1:1 verhouding. Onze resultaten toonden aan dat FMT-behandeling de T-cel-immunosuppressieve functies van zowel G-MDSC's als M-MDSC's verminderde (Fig. 7e, f). Verder hebben we ook de niveaus van Arg-1- en p47phox-expressie gemeten in MDSC's geïsoleerd uit de milt van muizen. Zoals verwacht was de genexpressie van Arg-1 en p47phox significant verminderd in milt CD11b⁺ Gr-1⁺ cellen geïsoleerd uit met FMT behandelde LPS-uitgedaagde muizen in vergelijking met LPS-uitgedaagde muizen (Fig. 7g, h). Deze gegevens geven aan dat FMT de immunosuppressieve functies van MDSC's verminderde door de productie van Arg-1 en ROS te verminderen, wat suggereert dat FMT de immunosuppressie op lange termijn bij sepsis in een laat stadium kan verminderen.

FMT vermindert de immunosuppressieve eigenschappen van MDSC's. een CD3⁺ CD4⁺ celpopulaties in milten werden gedetecteerd door FACS. b Kwantitatieve gegevens van a . c CD3⁺ CD8⁺ celpopulaties in milten werden gedetecteerd door FACS. d Kwantitatieve gegevens van a . e Het vermogen van G-MDSC's van muizen om T-celproliferatie geïnduceerd door anti-CD3/CD28-stimulatie te onderdrukken, werd gemeten met FACS (n =3 per groep). Er wordt een representatief histogram weergegeven. v Het vermogen van M-MDSC's van met vehikel of FMT behandelde LPS-uitgedaagde muizen om T-celproliferatie geïnduceerd door anti-CD3/CD28-stimulatie te onderdrukken, werd gemeten met FACS (n =3 per groep). Er wordt een representatief histogram weergegeven. g , u Arg-1- en p47phox-mRNA-expressie in MDSC's van met vehikel of FMT behandelde LPS-uitgedaagde muizen

Discussie

Het door de FDA goedgekeurde ijzersupplement FMT wordt veel gebruikt als medicijndrager en contrastmiddel bij MRI-scans. Er werd gevonden dat FMT de groei van kanker remt door een pro-inflammatoire immuunrespons te induceren met M1-macrofaagpolarisatie [3], wat aangeeft dat FMT immuunmodulerende functies heeft. In deze studie hebben we het effect van FMT op MDSC's geëvalueerd door het fenotype en de functie van met FMT behandelde MDSC's te vergelijken met onbehandelde controle-MDSC's. Eerdere studies hebben aangetoond dat MDSC's magnetische nanodeeltjes kunnen opnemen [10], en onze gegevens hebben verder aangetoond dat FMT de immunosuppressieve functies van MDSC's in de milt verzwakt via downregulatie van Arg-1 en ROS. Onze gegevens gaven ook aan dat FMT een direct effect heeft op MDSC-differentiatie, waarbij ongeveer een vijfde van de cellen gelijkmatig differentieert in macrofagen na 5 dagen in in vitro-experimenten. Hoewel we het fenotype van macrofagen die zijn blootgesteld aan FMT niet hebben onderzocht, veronderstelden we dat ze van het pro-inflammatoire M1-subtype waren. De resultaten toonden duidelijk aan dat FMT de differentiatie en rijping van MDSC's verbetert, en suggereert dus dat dit ten grondslag ligt aan de vermindering van de MDSC-populatie die we hebben waargenomen tijdens late sepsis.

Sepsis initieert een complexe immuunrespons die in de loop van de tijd varieert en gepaard gaat met zowel pro-inflammatoire als anti-inflammatoire reacties. Eerdere studies hebben aangetoond dat overlijden in de vroege stadia van sepsis te wijten is aan overmatige ontsteking. Derive en collega's meldden dat adoptieve overdracht van MDSC's op dag 10 naar septische muizen de peritoneale cytokineproductie verzwakte en de overlevingskans verbeterde [22]. Meer recentelijk hebben Namkoog et al. waargenomen dat voorbehandeling met claritromycine de overleving verbeterde in een muismodel van LPS-geïnduceerde shock door de CD11b⁺ uit te breiden Gr-1⁺ celpopulatie [23]. They described that MDSCs play a protective role in sepsis, however, it should be noted that they were concerned about the early stages of sepsis. Most patients with sepsis display rapid signs of profound immunosuppression, and deaths in this phase are typically due to the acquisition of a secondary hospital-acquired infection, often with opportunistic pathogens [24]. Overzealous MDSC proliferation may facilitate a physiological syndrome of persistent immunosuppression, causing poor outcomes [25]. McClure et al. reported that they did not observe any protective effects from MDSC transfer once the mice entered the late immunosuppressive state [26]. They had previously shown that MDSCs massively expand in the bone marrow, spleen, and lymph nodes of mice with ongoing septic processes and contribute to sepsis-induced T cell suppression [11]. Additionally, Uhel reported that M-MDSCs and G-MDSCs strongly contribute to T cell dysfunction in patients with sepsis [12]. Our data demonstrated that FMT significantly decreased the percentage of MDSCs and attenuated the functions of MDSCs to restore the number of T cells present in mice during late sepsis. Therefore, when studying the role of MDSCs in sepsis, it is crucial to clearly distinguish the early and late stages of sepsis.

Mohus et al. suggested that iron deficiency was associated with increased risk of future bloodstream infections that cause sepsis, indicating that the immune defense mechanisms may be depressed compared to bacterial iron sequestration in low iron environments [27]. Controversies shown in iron supplemental studies reported that intravenous iron therapy was associated with an increased risk of infection [28]. It should be noted the iron supplements differ significantly in their physicochemical properties, which give them different biological properties [29]. With FMT, an iron core is wrapped in a carbohydrate shell, which leads to low toxicity, lysosomal uptake and degradation [30, 31]. It has been reported that FMT does not cause liver toxicity in patients or animal models and is typically metabolized within 2 months [32]. Our data showed that FMT does not increase the production of inflammatory cytokines in early sepsis, indicating that FMT can be administered in sepsis.

Conclusion

This study demonstrated a novel immune-modulatory property of FMT; however, further studies are needed to elucidate the mechanism of FMT suppression of MDSCs. Furthermore, we provide an attractive therapeutic approach for the treatment of sepsis-associated immunosuppression and targeting MDSCs may provide a promising new option for restoring the immune response during sepsis.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

De datasets die tijdens het huidige onderzoek zijn gebruikt en/of geanalyseerd, zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de corresponderende auteur.

Afkortingen

ALT:: Alanine-aminotransferase
Arg1:: Arginase 1
AST:: Aspartaataminotransferase
FMT:: Ferumoxytol
G-MDSCs/PMN-MDSCs:: Polymorphonuclear MDSCs/granulocytic MDSCs
HE:: Hematoxylin–eosin
IL-1β:: Interleukin-1β
iNOS:: Inducible nitric oxide synthase
LPS:: Lipopolysaccharide
MCP 1:: Monocyte chemotactic protein 1
MDSC:: Myeloid-derived suppressor cell
MHC II:: Major histocompatibility complex
M-MDSCs:: Monocytic MDSCs
PBS:: Phosphate-buffered saline solution
ROS:: Reactieve zuurstofsoorten
TLR:: Toll-like receptor
TNF-α:: Tumor necrosis factor α

Fotogalvanisch effect in met stikstof gedoteerde monolaag MoS2 van First Principles Lithia-gebaseerde nanocomposieten geactiveerd door Li2RuO3 voor nieuwe kathodematerialen geworteld in de zuurstof-redoxreactie

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal