Ferumoxytol verlaagt MDSC-activiteit en verlicht LPS-geïnduceerde immunonderdrukking bij sepsis

Samenvatting

Immunonderdrukking geïnduceerd door sepsis wordt erkend als een van de belangrijkste kenmerken verantwoordelijk voor therapeutische mislukkingen. Myeloïde afgeleide suppressorcellen (MDSC's), die voornamelijk gekenmerkt worden door hun suppressieve eigenschappen, zijn uitgebreid in sepsis. Ferumoxytol (FMT), een door de FDA goedgegeven ijzersupplement, heeft immunmodulerende eigenschappen getoond in tumoren. Het is echter onduidelijk of FMT de functies van MDSC's verandert om late-sepsis immunonderdrukking te verminderen. Hier tonen we een immunomodulerend effect van FMT op MDSC's aan om lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde immunonderdrukking in het late stadium van sepsis te verlichten. Scheiding van cellen met geïnternaliseerd FMT en detectie van de intracellulaire ijzerinhoud toonden aan dat MDSC's FMT kunnen opnemen. Lage doses FMT hadden geen effect op de celviabiliteit van MDSC's, maar FMT remde de expansie van MDSC's in vitro. Bovendien verlaagde FMT significant de expressieniveaus van Arg-1, S100A8, S100A9 en p47phox evenals ROS-productie in MDSC's. FMT verlaagde het percentage granulocytaire MDSC's (G-MDSC's) en bevorderde de differentiatie van MDSC's naar macrofagen. Verder verminderde FMT de witte bloedcelrecrutering en alveolaire wandverdikking in de longen en necrosegebieden in de lever, evenals sommige biochemische markers van leverdysfunctie. FMT verlaagde het percentage G-MDSC's en monocytaire MDSC's (M-MDSC's) in de milten van LPS-geïnduceerde septische muizen. Opvallend was dat FMT de T-cel immunosuppressieve functies van zowel G-MDSC's als M-MDSC's reduceerde. Verwacht naar verwachting verlaagde FMT ook significant de Arg-1 en p47phox genexpressie in splenische CD11b⁺Gr-1⁺ cellen geïsoleerd van LPS-uitgedaagde muizen. Deze gegevens tonen aan dat FMT de immunosuppressieve functies van MDSC's vermindert door de Arg-1 en ROS-productie te verlagen, wat suggereert dat FMT langdurige immunonderdrukking in het late stadium van sepsis kan verminderen.

Inleiding

FMT, een door de Food and Drug Administration goedgegeven ijzersupplement, wordt gebruikt voor de behandeling van ijzerdeficiëntie-anemie bij volwassenen met chronische niersiekte (CKD), en FMT wordt ook breed gebruikt als contrastmiddel en medicijnendrager. Eerdere studies toonden aan dat FMT immunmodulerende eigenschappen had, zoals de inductie van een fenotypische verschuiving in M2 macrofagen naar een hoge CD86⁺, TNF-α positieve M1 macrofaag-subtype. De effecten van FMT op andere immuuncellen zijn echter niet onderzocht.

MDSC's zijn een heterogene populatie van onrijpe myeloïde cellen met een krachtige immuonderdrukkende capaciteit. In muizen zijn MDSC's identificeerbaar als Gr-1⁺CD11b⁺ cellen, terwijl humane MDSC's de Gr-1-homoloog missen en gedefinieerd worden als CD14⁻HLA-DR⁻CD11b⁺CD33⁺ of CD14⁺HLA-DR⁻CD11b⁺CD33⁺ cellen. MDSC's bestaan uit twee grote groepen cellen, granulocytaire of PMN-MDSC's en M-MDSC's, en beide populaties hebben immuonderdrukkende functies door productie van iNOS, ROS en Arg-1. De verhoogde activiteit van Arg-1 ontneemt l-arginine, en het tekort aan l-arginine remt T-celproliferatie door de expressie van de CD3 zeta-keten te verlagen. iNOS genereert NO, wat de functies van zowel JAK3 als STAT6 in T-cellen remt, evenals de expressie van MHC II. ROS induceert posttranslationele modificatie van T-celreceptoren en kan antigen-specifieke T-cellen onvoelig maken. M-MDSC's ontstaan uit monocytaire precursoren en kunnen zich differentieren tot macrofagen en DC's onder geschikte cytocinecondities. De meeste kennis over MDSC's stampt uit kankerstudies. In de laatste jaren is een expansie van MDSC's ook beschreven in acute en chronische inflammatoire ziekten, inclusief inflammatie, brandwonden en auto-immuunziektes. Recent werd een hoge opname van fluorescentie nanopartikels door MDSC's in de slokdarm en milt van muizen gerapporteerd in imagingstudies. Het is echter onduidelijk of FMT de functie van MDSC's verandert die betrokken zijn bij de ontwikkeling van inflammatoire ziekten.

Sepsis, een gedysreguleerde gastheer-inflammatoire reactie op een zware infectie die levensbedreigende orgaandysfunctie kan veroorzaken, is de meest voorkomende doodsoorzaak op de intensive care. Sepsis initieert een overweldigende pro-inflammatoire reactie die, indien niet vroegtijdig behandeld, snel omzet in langdurige immunonderdrukking. De expansie van MDSC's is beschreven in de milt en lymfeklieren in septische diermodellen, evenals in patiënten met sepsis. De activatie van immuonderdrukkende cellen zoals MDSC's is cruciaal voor een adequate controle van de hyperreactiviteit van het aangeboren immuunsysteem, maar hun overmatige expansie kan leiden tot hyperimmunonderdrukking, wat de predominante drijvende kracht is voor secundaire infectie en sterfte in late sepsis. Verhoogde aantallen MDSC's correleren met de onderdrukking van lymfocytproliferatie. Het is gerapporteerd dat MDSC's hun fenotype in het beenmerg verwerven en daarna migreren naar secundaire lymfoïde organen om T-celreacties te remmen en hun proliferatie te onderdrukken in LPS-geïmmunonderdrukte muizen. De meeste patiënten met langdurige sepsis vertonen een immuonderdrukte status, en de meeste sepsis-sterfte is te wijten aan late-sepsis immunonderdrukking. Elimineren van MDSC's kan gunstige effecten hebben in late sepsis door de immuunreactie te herstellen. Daarom veronderstelden we dat FMT de functies van MDSC's kan modelleren om late-sepsis immunonderdrukking te verminderen.

Hier tonen we een immunomodulerend effect van FMT op MDSC's aan. We gebruikten de magnetische eigenschappen van FMT om aan te tonen dat MDSC's in vitro in staat waren FMT te fagocyteren. Bovonden we dat FMT de immuonderdrukkende functie van MDSC's verzwakte via downregulatie van Arg-1 en ROS. Verder bevestigten in vivo experimenten dat FMT het late stadium van LPS-geïnduceerde sepsis in muizen verbeterde door de capaciteit van MDSC's om T-cellen te remmen te verzwakken. Onze gegevens suggereren dat de immunomodulerende functie van FMT kan worden gebruikt om de immunonderdrukking te behandelen die optreedt in late sepsis.

Materialen en Methodes

Muizen

Mannelijke C57BL/6 muizen (8–10 weken oud) werden gekocht bij het Model Animal Research Center van Nanjing Universiteit (Nanjing, China). De muizen werden geteeld onder specifieke pathogen-vrije (SPF) omstandigheden op een 24-uurs licht/donker cyclus met vrije toegang tot voedsel en water. Alle experimenten met muizen werden goedgekeurd door de Nanjing University Institutional Animal Care and Use Committee.

Prussisch Blau Kleuring

Intracellulaire FMT-distributie werd gedetecteerd met behulp van het Perl's Prussisch blau kleuringskit (Solarbio, China) volgens de instructies van de fabrikant. Kortweg, cellen werden vastgezet in 4% paraformaldehyde gedurende 15 min, en daarna geïnculeerd met 10% kaliumferrocyanide gedurende 25–30 min, gevolgd door wassen en tegenkleuring met nucleaire snelle rood gedurende 10 min. Cellen met blauwe deeltjes in het cytoplasma waren positief voor Prussisch blau kleuring.

Generatie van Beenmerg-afgeleide MDSC's

Beenmergcellen werden verkregen door de femora en tibia's van wild-type muizen te spoelen, gevolgd door RBC-lyse. De beenmergcellen werden gekweekt in compleet RPMI-1640 medium met 10% FBS, 1% v/v penicilline en streptomycine (Gibco, CA), 40 ng/mL granulocyte-macrofage colony-stimulerende factor (GM-CSF) (Miltenyi Biotech, Duitsland) en 40 ng/mL IL-6 (Miltenyi Biotech, Duitsland) bij 37 °C in een 5% CO₂ incubator gedurende 4 dagen. Niet-hechtende cellen werden verzameld voor verdere experimenten.

Celviabiliteitsanalyse

Celviabiliteit werd geanalyseerd met behulp van de Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) volgens de instructies van de fabrikant. Kortweg, MDSC's (5 × 10³) werden in 96-gats cultuurplaten gezaaid en geïnculeerd in een 5% CO₂ atmosfeer bij 37 °C voor behandeling. Het medium werd vervolgens vervangen door vers medium met verschillende concentraties FMT (250, 500, 1000, 2000 μg/mL) gedurende 24 uur. Het supernatans werd vervolgens verwijderd en vers medium met CCK-8 oplossing werd toegevoegd. Na incubatie bij 37 °C gedurende 3 uur, werd de absorbantie gemeten bij 450 nm met een Gen5 microplaatlezer (BioTek, VS).

Isolatie van Totale RNA en Real-time PCR

Totale RNA werd geëxtraheerd uit cellen met behulp van TRIzol reagent (Invitrogen, VS) en gekwantificeerd met een Nanodrop Spectrofotometer (Thermo Scientific, VS) voordat het omgekeerd getranscribeerd werd met de HiScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme Biotech Co., Ltd, China) volgens de instructies van de fabrikant. Real-time kwantitatieve polymeraseketenreactie (PCR) werd uitgevoerd met het SYBR Green PCR Kit (Bio-Rad, Hercules, CA) op een Applied Biosystems StepOne-Plus real-time qPCR systeem (Applied Biosystems, Forster City, CA). Genexpressie werd genormaliseerd ten opzichte van GAPDH met behulp van de 2^−ΔΔCt methode. De primer sequenties zijn vermeld in Additioneel bestand 1: Tabel S1.

Flowcytometrie

Weefsels werden voorbereid als enkelvoudige celsuspensies met collagenaas type D (1 mg/mL) en DNase I (0,1 mg/mL) in Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) bij 37 °C gedurende 30 min, en daarna werden de rode cellen van de milt gelyst. De celsuspensies werden gefiltreerd door 70-μm celfilters, en de lymfocyten werden verzameld door centrifugatie bij 300 g gedurende 5 min bij 4 °C. Na wassen werden de cellen direct voorbereid voor fluorescentie-geactiveerde celsorting. Enkelvoudige cellen werden geïnculeerd met FcR blokkeringsreagens (Miltenyi Biotech, Duitsland) gedurende 10 min, gevolgd door kleuring met de volgende antistof-conjugaten gedurende 20 min: FITC-gelabeld anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD4 en anti-CD8; PE-gelabeld anti-Ly6G; APC-gelabeld anti-Ly6C, anti-CD3, anti-F4/80 en anti-MHC II (BioLegend, CA). Na wassen werden cellen gedetecteerd met een FACS Calibur (BD, CA) en de gegevens werden geanalyseerd met FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., VS).

H&E Kleuring

Lever- en longweefsels werden vastgezet in 4% fosfaat-gebufferde formaldehyde. Vastgezet weefsel werd ingebed in paraffin, en 5-μm-dikke coupes werden gekleurd met hematoxyline en eosin voor lichtmicroscopie.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Serum niveaus van TNFα, MCP-1 en IL-1β werden bepaald met behulp van specifieke ELISA-kits (Dakewe, China) volgens de instructies van de fabrikant. Elk monster werd in dubbel uitgevoerd.

Detectie van ROS

Intracellulaire ROS werd gemeten met behulp van de 2,7-dichlorodihydrofluoresceine diacetaat (DCFH-DA) kit (Beyotime, China) volgens de instructies van de fabrikant. Kortweg, de cellen werden tweemaal gewassen met PBS en geïnculeerd met 5 μM DCFH-DA bij 37 °C in het donker gedurende 30 min, daarna gewassen met RPMI-1640 medium en heropgelost in PBS. Cellen werden geanalyseerd op intracellulaire groene fluorescentie met een flowcytometer (BD, CA).

T-cel Proliferatieanalyse

Totale CD3⁺ T-cellen werden verrijkt uit de milten van wild-type muizen met behulp van een CD3ε MicroBead kit (Miltenyi Biotech, Duitsland) en geïnculeerd met CFSE-kleuring (Invitrogen, VS). Voor anti-CD3/CD28 antistof-geïnduceerde T-celproliferatie werden T-cellen geactiveerd met anti-CD3 antistof (1 μg/mL) en anti-CD28 antistof (1 μg/mL). G-MDSC's (Gr-1^highLy-6G⁺) en M-MDSC's (Gr-1^dimLy-6G⁻) geïsoleerd uit de milten van FMT-behandelde of voertuig-behandelde muizen met behulp van een Myeloid-Derived Suppressor Cell Isolatie kit (Miltenyi Biotech, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. MDSC's werden gecocultureerd in een 1:1 verhouding met CFSE-gelabelde CD3⁺ T-cellen in 96-gats platbodem platen gedurende 3 dagen. CFSE wordt gelijkmatig verdeeld onder dochtercellen bij elke deling; daarom werd proliferatie bepaald door flowcytometrie. De zuiverheid van de cellen na sortering was > 90%.

Statistiek en Data-analyse

Alle statistieken werden berekend met behulp van GraphPad Prism 6 software (GraphPad Software, CA) en worden gepresenteerd als gemiddelden ± standaarddeviaties (SD). Verschillen tussen twee groepen werden geanalyseerd met de Mann-Whitney U-toets of ongepaarde, tweezaagse Student's t-toets. Eénrichtings ANOVA werd gebruikt voor de vergelijking van meerdere groepen. Alle experimenten werden ten minste drie keer herhaald. Verschillen met p-waarden < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Een Groot Aantal MDSC's Neemt FMT Op

Om te verifiëren of cellen met geïnternaliseerd FMT gescheiden worden door MACS MicroBeads, gebruikten we Prussisch blau kleuring om de intracellulaire ijzerinhoud in macrofagen te detecteren die met FMT (1000 ng/mL) gedurende 24 uur behandeld waren. De cellen werden verdeeld in drie groepen: voor magnetische scheiding, magnetisch geselecteerde FMT-positieve cellen (FMT+), en die niet magnetisch geïsoleerd waren (FMT-). Prussisch blau kleuring toonde aan dat de meerderheid van de magnetisch geselecteerde cellen Prussisch blau positief was (Fig. 1a). Om de capaciteit om FMT te fagocyteren te vergelijken tussen MDSC's, macrofagen en DC's, isoleerden we splenocyten van naive C57BL/6 muizen behandeld met FMT gedurende 6 uur, 12 uur, 24 uur en 48 uur. Splenocyten werden verdeeld in twee subsetten: voor magnetische scheiding en FMT-positieve cellen. Flowcytometrische analyse onthulde dat bijna 60% van de MDSC's en meer dan 60% van de macrofagen FMT accumulateerden na 12–48 uur (Fig. 1b, c). Slechts ongeveer 40% van de DC's was FMT-positief na 24 uur. Deze gegevens tonen aan dat, net als macrofagen, MDSC's FMT kunnen opnemen en suggereren dat FMT de MDSC-functie kan beïnvloeden.

FMT Remt de Expansie van MDSC's In Vitro

Het is gerapporteerd dat FMT een fenotypische verschuiving in M2 macrofagen induceert naar een hoge CD86⁺, TNF-α positieve M1 macrofaag-subtype. Aangezien er een groot aantal MDSC's is dat FMT kan opnemen, veronderstelden we dat FMT de functie van MDSC's kan veranderen. Eerst werden de cytotoxische effecten van FMT bij 250, 500, 1000 en 2000 μg/mL op MDSC's geëvalueerd met de CCK8 celviabiliteitsanalyse. De resultaten toonden aan dat FMT geen effect had op de celviabiliteit bij lage doses en alleen matige cytotoxiciteit vertoonde bij de maximale dosis van 2000 μg/mL (Fig. 2a). Vervolgens testten we of FMT bij verschillende concentraties de generatie van MDSC's zou beïnvloeden. Beenmergcellen geïsoleerd van naive C57BL/6 muizen werden behandeld met medium of verschillende concentraties FMT (250, 500, 1000 en 2000 μg/mL) gedurende 4 dagen, gevolgd door karakterisering door flowcytometrie op dag 4. GM-CSF en IL-6 werden op dag 0 toegevoegd. De resultaten van drie onafhankelijke experimenten onthulden dat FMT bij 1000 en 2000 μg/mL de expansie van MDSC's significant verminderde (Fig. 2b, c).

FMT Verlaagt de Immunonderdrukkende Capaciteit van MDSC's

MDSC's gebruiken verschillende mechanismen om de proliferatie en effectorfunctie van T-cellen te remmen, waarvan de productie van ROS en Arg-1 het best beschreven is. Expressie van het p47phox-component van het nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat-oxidase (NOX) complex is verantwoordelijk voor ROS-productie in MDSC's. Het is gerapporteerd dat S100A8/A9 gesynthetiseerd en gesecreteerd wordt door MDSC's in een autocrine inflammatoire lus en dat dit belangrijk is in de onderdrukking van dendritische cel-functie in muizenmodellen. Om te bepalen of FMT de functie van MDSC's kon veranderen, verkreggen we beenmerg-afgeleide MDSC's zoals eerder beschreven en gebruikten we RT-PCR om mRNA-expressie in FMT-behandelde MDSC's te meten versus onbehandelde controles. De resultaten onthulden dat FMT-behandelde MDSC's de expressieniveaus van Arg-1, S100A8, S100A9 en p47phox significant downreguleerden vergeleken met onbehandelde MDSC's (Fig. 3a–h). Vervolgens evalueerden we ROS-niveaus in controle MDSC's en FMT-behandelde MDSC's. De resultaten toonden aan dat FMT-behandelde MDSC's een significant lager niveau van ROS vertoonden dan controle cellen (Fig. 3i, j). Vervolgens vergelijken we de veranderingen in de MDSC-subpopulaties in de FMT-behandelde en onbehandelde groepen. De resultaten toonden aan dat FMT het percentage G-MDSC's verlaagde, met een lichte toename in M-MDSC's ook waargenomen (Fig. 3k, l).

FMT Bevordert de Differentiatie van MDSC's naar Macrofagen

Om te bepalen of FMT de finale differentiatie van MDSC's naar macrofagen stimuleert, behandelden we cellen met 1000 μg/mL FMT op dag 0 en voerden we flowcytometrie uit voor de macrofaag-geassocieerde markers CD11b en F4/80 op dagen 1, 3 en 5. De resultaten toonden aan dat 1 dag na toevoeging van 1000 μg/mL FMT het aandeel macrofagen significant met meer dan 2-voudig toename vergeleken met onbehandelde cellen. Op dezelfde manier waren de aandeel macrofagen 3 dagen en 5 dagen na behandeling met FMT ook significant toegenomen (Fig. 4a, b).

FMT Verbetert Symptomen in LPS-geïnduceerde Septische Muizen

Het is gerapporteerd dat sepsis geassocieerd is met weefselschade en leidt tot orgaanfalen en endotheldysfunctie. Om te onderzoeken of FMT late sepsis-symptomen vermindert, werd de mate van orgelschade in de experimentele muizen geëvalueerd na 10 dagen. Een histopathologisch onderzoek van de longen in LPS-geïnduceerde sepsis toonde aan dat FMT de witte bloedcelrecrutering en alveolaire wandverdikking verminderde vergeleken met voertuig-behandelde muizen. H&E-kleuring onthulde ook dat het gebied van levernecrose kleiner was in de FMT-behandelde muizen vergeleken met de voertuig-behandelde muizen (Fig. 5a, b). Bovendien waren aspartaat transaminase serum niveaus, gebruikt als biochemische marker van leverdysfunctie in deze dieren, significant lager in de leveren van FMT-behandelde muizen vergeleken met de controle (Fig. 5c). Echter, FMT beïnvloede de niveaus van alanine aminotransferase niet (Fig. 5d). Verder wordt sepsis geassocieerd met nadelige uitkomsten zoals verhoogde productie van inflammatoire cytokines; daarom beoordeelden we veranderingen in de niveaus van pro-inflammatoire cytokines in het serum. Het niveau van TNF-α in het serum was iets, maar niet significant, lager in FMT-behandelde muizen op 3 uur na LPS-injectie, en er werden geen verschillen waargenomen in MCP-1 of IL-1β niveaus tussen FMT-behandelde muizen en voertuig-behandelde muizen (Fig. 5e–g).

FMT Vermindert het Aantal MDSC's in de Milt van LPS-geïnduceerde Septische Muizen

Toenemende bewijzen ondersteunen dat sepsis-geassocieerde immunonderdrukking de sterfte verhoogt, en MDSC's worden beschouwd als een belangrijk onderdeel van het immuonderdrukkende netwerk. Het is gerapporteerd dat G-MDSC's specifieker uitgebreid zijn in septische patiënten en de belangrijkste actoren lijken te zijn van sepsis-geïnduceerde immuonderdrukking. Om te bepalen of FMT MDSC-populaties in wild-type muizen moduleert, werden C57BL/6 muizen FMT via de staartvane gegeven op uur 1 en dag 5. De resultaten toonden aan dat er geen significante verschillen in het percentage MDSC's werden gedetecteerd in de milt of het beenmerg tussen de controle en FMT-behandelde muizen (Fig. 6a, e). Opvallend was dat FMT de LPS-afhankelijke expansie van CD11b⁺Gr-1⁺ cellen in zowel het beenmerg als de milt verminderde (Fig. 6a, e), wat consistent is met in vitro studies. Bovendien verlaagde FMT ook het percentage G-MDSC's en M-MDSC's in de milt, terwijl alleen het percentage G-MDSC's in het beenmerg verlaagd werd (Fig. 6c, g). Deze gegevens wijzen erop dat FMT het aantal MDSC's in de milt van LPS-geïnduceerde septische muizen vermindert.

FMT Vermindert de T-cel Immunonderdrukkende Eigenschappen van MDSC's In Vivo

De numerieke reductie van meerdere immuuncelpopulaties, inclusief CD4 en CD8 T-cellen, is een belangrijk kenmerk van de adaptieve immuunreactie na sepsis. Het is geassocieerd met een verhoogd risico op sterfte, evenals andere slechte uitkomsten. Er is aangetoond dat MDSC's T-celproliferatie onderdrukken door de T-cel zeta-keten expressie te beeinträchtigen in sepsis-patiënten. Om het aandeel lymfocyten in late stadium sepsis te evalueren, maatten we het aandeel CD4 en CD8 T-cellen in een muur sepsis model. De resultaten toonden aan dat FMT een toename veroorzaakte in CD4 en CD8 T-cellen in de milten van de LPS-geïnduceerde muizen (Fig. 7a, b). Er waren geen verschillen in percentages van CD4 en CD8 T-cellen in de milt van FMT-behandelde muizen vergeleken met controle muizen (Fig. 7a, b). Om de rol van MDSC's in het onderdrukken van T-celproliferatie in vivo verder te bevestigen, werden G-MDSC's en M-MDSC's geïsoleerd uit de milten van voertuig- of FMT-behandelde LPS-uitgedaagde muizen door MACS en gecocultureerd met CD3 T-cellen in een 1:1 verhouding. Onze resultaten toonden aan dat FMT-behandeling de T-cel immunonderdrukkende functies van zowel G-MDSC's als M-MDSC's verminderde (Fig. 7e, f). Bovendien maatten we ook de niveaus van Arg-1 en p47phox expressie in MDSC's geïsoleerd uit de milten van muizen. Verwacht naar verwachting was Arg-1 en p47phox genexpressie significant verlaagd in splenische CD11b⁺Gr-1⁺ cellen geïsoleerd van FMT-behandelde LPS-uitgedaagde muizen vergeleken met LPS-uitgedaagde muizen (Fig. 7g, h). Deze gegevens tonen aan dat FMT de immuonderdrukkende functies van MDSC's vermindert door de Arg-1 en ROS-productie te verlagen, wat suggereert dat FMT langdurige immunonderdrukking in late-sepsis kan verminderen.

Discussie

Het door de FDA goedgegeven ijzersupplement FMT is breed gebruikt als medicijendrager en contrastmiddel in MRI-scanning. Er werd ontdekt dat FMT kankergroei remt door een pro-inflammatoire immuunreactie te induceren met M1 macrofaag-polarisatie, wat aangeeft dat FMT immuun-modulerende functies heeft. In deze studie evalueerden we het effect van FMT op MDSC's door de fenotype en functie van FMT-behandelde MDSC's te vergelijken met controle onbehandelde MDSC's. Eerdere studies hebben getoond dat MDSC's in staat zijn magnetische nanopartikels op te nemen, en onze gegevens toonden verder aan dat FMT de immuonderdrukkende functies van MDSC's in de milt verzwakt via downregulatie van Arg-1 en ROS. Onze gegevens gaven ook aan dat FMT een direct effect heeft op MDSC-differentiatie, waarbij ongeveer een vijfde van de cellen na 5 dagen in in vitro experimenten gelijkmatig differentieerden tot macrofagen. Hoewel we de fenotype van macrofagen blootgesteld aan FMT niet onderzochten, veronderstelden we dat ze van de pro-inflammatoire M1-subtype waren. De resultaten toonden duidelijk aan dat FMT de differentiatie en rijping van MDSC's verbetert, en suggereert dus dat dit de reductie in de MDSC-populatie verklaart die we waarnamen tijdens late sepsis.

Sepsis initieert een complexe immuunreactie die in de loop van de tijd varieert en vergezeld gaat van zowel pro-inflammatoire als anti-inflammatoire reacties. Eerdere studies hebben getoond dat sterfte in de vroege stadia van sepsis te wijten is aan overmatige inflammatie. Derive en collega's rapporteerden dat adoptieve overdracht van dag 10 MDSC's in septische muizen de peritoneale cytocineproductie verlaagde en de overleving verbeterde. Meer recent waarnamen Namkoog et al. dat clarithromycine prebehandeling de overleving in een muizenmodel van LPS-geïnduceerde shock verbeterde door de CD11b⁺Gr-1⁺ celpopulatie uit te breiden. Ze beschreven dat MDSC's een beschermende rol spelen in sepsis, maar het moet worden opgemerkt dat ze zich bezighielden met de vroege stadia van sepsis. De meeste patiënten met sepsis vertonen snelle tekenen van diepgaande immunonderdrukking, en sterftes in deze fase zijn meestal te wijten aan de verwerving van een secundaire in het ziekenhuis verworven infectie, vaak met opportunistische pathogenen. Overmatige MDSC-proliferatie kan een fysiologisch syndroom van persistente immunonderdrukking faciliteren, wat leidt tot slechte uitkomsten. McClure et al. rapporteerden dat ze geen beschermende effecten van MDSC-overdracht waarnamen zodra de muizen het late immuonderdrukkende stadium bereikten. Ze hadden eerder getoond dat MDSC's massaal uitbreiden in het beenmerg, de milt en de lymfeklieren van muizen met lopende septische processen en bijdragen aan sepsis-geïnduceerde T-cel onderdrukking. Daarnaast rapporteerde Uhel dat M-MDSC's en G-MDSC's sterk bijdragen aan T-cel dysfunction in patiënten met sepsis. Onze gegevens toonden aan dat FMT het percentage MDSC's significant verlaagde en de functies van MDSC's verzwakte om het aantal T-cellen in muizen tijdens late sepsis te herstellen. Daarom is het cruciaal om bij het bestuderen van de rol van MDSC's in sepsis de vroege en late stadia van sepsis duidelijk te onderscheiden.

Mohus et al. suggereerden dat ijzerdeficiëntie geassocieerd was met een verhoogd risico op toekomstige bloedstroominfecties die sepsis veroorzaken, wat aangeeft dat de immuunafweer mechanismen mogelijk onderdrukt zijn vergeleken met bacteriële ijzersequestratie in lage ijzeromgevingen. Controversen in ijzersupplementatiestudies toonden aan dat intraveneuze ijzertherapie geassocieerd was met een verhoogd risico op infectie. Het moet worden opgemerkt dat ijzersupplementen significant verschillen in hun fysicochemische eigenschappen, wat hen verschillende biologische eigenschappen geeft. Bij FMT is een ijzerkern omhuld door een koolhydraatschel, wat leidt tot lage toxiciteit, lysosomale opname en afbraak. Er is gerapporteerd dat FMT geen levertoxiciteit veroorzaakt in patiënten of diermodellen en doorgaans binnen 2 maanden gemetaboliseerd wordt. Onze gegevens toonden aan dat FMT de productie van inflammatoire cytokines in vroege sepsis niet verhoogt, wat aangeeft dat FMT in sepsis kan worden toegediend.

Conclusie

Deze studie toonde een nieuwe immuun-modulerende eigenschap van FMT aan; echter, verdere studies zijn nodig om het mechanisme van FMT-onderdrukking van MDSC's te verduidelijken. Verder bieden we een aantrekkelijke therapeutische benadering voor de behandeling van sepsis-geassocieerde immunonderdrukking en het richten op MDSC's kan een veelbelovende nieuwe optie bieden voor het herstellen van de immuunreactie tijdens sepsis.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

De datasets gebruikt en/of geanalyseerd tijdens de huidige studie zijn beschikbaar bij de corresponderende auteur op redelijke verzoek.

Afkortingen

ALT:

Alanine aminotransferase

Arg1:

Arginase 1

AST:

Aspartate aminotransferase

FMT:

Ferumoxytol

G-MDSC's/PMN-MDSC's:

Polymorfonucleaire MDSC's/granulocytaire MDSC's

HE:

Hematoxyline–eosine

IL-1β:

Interleukine-1β

iNOS:

Induceerbare nitrique oxide synthase

LPS:

Lipopolysaccharide

MCP-1:

Monocytaire chemotactische proteïne 1

MDSC:

Myeloïde afgeleide suppressorcellen

MHC II:

Major histocompatibiliteitscomplex

M-MDSC's:

Monocytaire MDSC's

PBS:

Fosfaat-gebufferde zoutoplossing

ROS:

Reactieve zuurstofsoorten

TLR:

Toll-achtige receptor

TNF-α:

Tumorenecrosefactor α