Magnetiet-nanocluster-gebaseerde theranostische agenten voor T₂-gewogen MRI en pH-responsieve doxorubiccine-afgifte

Samenvatting

Multifunctionele nanoestructuren die antikanker-geneesmiddelen combineren met anorganische nanokristallen, ontstaan als krachtige platforms voor tumordiagnose en -therapie. In deze studie fabriceren we magnetiet (Fe₃O₄) nanoclusters (NC's) door een olie-in-water micro-emulsie en een laag-voor-laag (LBL) assemblage te combineren. De Fe₃O₄ NC's werden eerst geassembleerd uit oleïnezuur-gekapte Fe₃O₄-nanodeeltjes (NP's). Opeenvolgende adsorptie van poly(allylamine hydrochloride) (PAH), poly(natrium 4-styreensulfonate) (PSS) en doxorubiccine hydrochloride (DOX) leverde Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanoestructuren op. Deze dragers vertonen pH-responsieve DOX-afgifte, verhoogde cytotoxiciteit tegen A549 longkankercellen en superieure T₂-gewogen MRI-contrast (r₂ = 651 mM⁻¹ s⁻¹). Fluorescerende DOX-emissie (λ_ex = 490 nm) vergemakkelijkt cellulaire imaging. Ons werk vestigt een robuust Fe₃O₄-gebaseerd theranostisch platform dat MRI, fluorescentie-imaging en gecontroleerde geneesmiddelafgifte integreert.

Inleiding

Recente vooruitgang in multifunctionele geneesmiddelafgiftesystemen heeft gelijktijdige imaging en therapie mogelijk gemaakt, met name door stimuli-responsieve ontwerpen die tumormicro-omgevingscues zoals zuurgraad (pH ≈ 6,5-6,8) benutten. Magnetiet-nanodeeltjes (Fe₃O₄) zijn bijzonder aantrekkelijk voor biomedische toepassingen vanwege hun superparamagnetisme, biocompatibiliteit en lage cytotoxiciteit. Echter, enkele Fe₃O₄ NP's lijden vaak onder lage magnetische responsiviteit en beperkte geneesmiddellading. Assemblage van Fe₃O₄ NP's in nanoclusters (NC's) versterkt collectieve magnetische effecten, wat T₂-relaxiviteit verhoogt en hogere geneesmiddellading mogelijk maakt gecombineerd met polyelektrolyet-multilagen. Ondanks deze voordelen hebben weinig studies Fe₃O₄ NC's gerapporteerd die gefunctionaliseerd zijn met PAH/PSS voor pH-getriggerde geneesmiddelafgifte.

Hier rapporteren we een schaalbare fabricageroute voor Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanoestructuren, combineren een micro-emulsie zelf-assemblage en LBL elektrostatische adsorptie. De resulterende dragers leveren DOX met gecontroleerde, pH-afhankelijke afgifte, tonen sterke T₂ MRI-contrast en doden A549-cellen efficiënt in vitro.

Materialen en Methodes

Materialen

FeCl₃·6H₂O (99,99%), FeCl₂·4H₂O (99,99%), oleïnezuur (OA, 90%), 1-octadeceen (ODE, 90%), natriumoleaat (NaOA), ethanol, hexaan, cyclohexaan, isopropanol, natriumdodecylbenzeensulfonate (SDBS), ammoniumfluoride (NH₄F), NaOH, DMSO en ammonia werden aangeschaft van Alfa Aesar en Sinopharm. PAH (MW 15 kDa), PSS (MW 70 kDa) en doxorubiccine hydrochloride (DOX, > 98%) werden verkregen van Sigma-Aldrich en Shanghai Sangon Biotech. APMI 1640 medium en foetale runderserum (FBS) verkregen van Hyclone. Alle reagentia werden zonder verdere zuivering gebruikt.

Bereiding van Ferric Oleaat

FeCl₃·6H₂O (2,59 g), NaOA (14,6 g), ethanol (32 mL), H₂O (24 mL) en hexaan (56 mL) werden gemengd in een 150 mL kolf en teruggekookt bij 70°C gedurende 4 uur om een transparante ferric-oleaat oplossing te vormen. De olielaag werd gescheiden, hexaan verwijderd door rotaire verdamping bij 70°C en het residu opgeslagen onder vacuum.

Synthese van Fe₃O₄ NP's

Ferric oleaat (7,2 g), OA (1,28 mL) en ODE (50 mL) werden verwarmd tot 300°C gedurende 40 min onder Ar; het mengsel werd vervolgens afgekoold en geoxideerd in lucht voor >12 uur. Nanokristallen werden geprecipiteerd met isopropanol, tweemaal gewassen met ethanol-water (1:1 v/v) en gedispergeerd in 200 mL cyclohexaan.

Bereiding van Fe₃O₄ NC's

200 µL van Fe₃O₄ NP's in cyclohexaan werd toegevoegd aan 4 mL waterige SDBS (14 mg). Ultrasonische behandeling (5 min × 4) vormde een vast-in-olie-in-water emulsie. Roeren bij kamertemperatuur gedurende 6 uur verdampte cyclohexaan, wat zelf-assemblage in quasi-sferische NC's toeliet. Het product werd driemaal gewassen met gedemineraliseerd water.

Bereiding van Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX Hybride Nanoestructuren

Fe₃O₄ NC's (3 mL) werden eerst gecoat met PAH (10 g/L, 4 mM NaCl) door druppelgewijze toevoeging en roeren gedurende 24 uur; overtollige PAH werd verwijderd door centrifugatie. De PAH-gecoate NC's werden vervolgens gecoat met PSS (10 g/L, 4 mM NaCl) onder identieke condities, gevolgd door centrifugatie. DOX (5 mg/mL) werd toegevoegd (60 µL) aan de Fe₃O₄ NC/PAH/PSS oplossing (3 mL) en 24 uur in het donker gerold. De finale Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanoestructuren werden geïsoleerd door centrifugatie.

MRI Metingen

Hybride nanoestructures werden gedispergeerd in 1,2 mL agarosa (1% w/v) bij Fe-concentraties variërend van 0 tot 0,065 mM. Imaging werd uitgevoerd op een 11,7 T Bruker micro-MRI systeem (TR = 300 ms, TE = 4,5 ms, 128 × 128 matrix, 1,2 mm slice, 2,0 × 2,0 cm FOV, 2 gemiddelden).

Cellulaire Opname en MR Imaging

A549-cellen werden geïnculeerd met hybride nanoestructuren (Fe = 0-13,5 µM) gedurende 2 uur, gewassen en geïmageerd door T₂-gewogen MRI.

Standaardcurve van DOX

DOX-fluorescentie (λ_ex = 490 nm) werd gemeten voor concentraties 0-0,03 mg/mL. De lineaire regressie gaf Y = 447,44 + 69.745 X (R² = 0,9992).

DOX Lading en Afgifte

Ladingsefficiëntie berekend uit het verschil tussen initiële DOX-massa (W₀) en de massa in het supernatans (W_s) na centrifugatie. Cumulatieve afgifte gemonitoord in PBS (pH 5,0 of 7,4) bij 37°C met een dialysezak, bemonstering 100 µL elk 1-3 uur.

In Vitro Cytotoxiciteit

A549-cellen gezaaid in 96-wellsplaten (8 × 10³ cellen/well) en behandeld met vrij DOX, Fe₃O₄ NC/PAH/PSS of Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX (0,1-2,0 µM DOX-equivalenten). Na 24 uur werd MTT (5 mg/mL) toegevoegd, 4 uur geïnculeerd en absorbantie gemeten bij 490 nm.

Karakterisatie

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, 200 kV) beoordeelde morfologie; dynamische lichtverstrooiing (DLS) meet hydrodynamische grootte en ζ-potentiaal; UV-vis spectroscopie bepaalde DOX-lading; fluorescentiespectroscopie monitoreerde DOX-afgifte; ICP-AES kwantificeerde Fe-inhoud.

Resultaten en Discussie

Nanoestructuur Morfologie en Grootte

TEM-afbeeldingen onthulden dat Fe₃O₄ NC's quasi-sferische aggregaten zijn (~57 nm, DLS) gevormd door zelf-assemblage van 15-nm primaire Fe₃O₄ NP's. Laagdepositie (PAH, PSS, DOX) bevestigd door ζ-potentiaal verschuivingen: -19,7 mV (NC), +32 mV (NC/PAH), -34 mV (NC/PAH/PSS), +1,9 mV (NC/PAH/PSS/DOX). De finale hybride nanoestructuren vertoonden een monodisperse grootte van ~84 nm (DLS).

Verbeterde T₂ MRI Contrast

Transversale relaxiviteit (r₂) was 651,38 mM⁻¹s⁻¹, wat veel commerciële agenten overtreft. Lineaire 1/T₂ versus Fe-concentratie bevestigde efficiënte T₂-contrast.

DOX Lading en pH-Responsieve Afgifte

UV-vis en fluorescentiespectra bevestigden DOX-adsorptie. De ladingsefficiëntie bereikte 24,4%. In PBS (pH 7,4) werd slechts ~20 gew% van DOX vrijgemaakt over 30 uur, terwijl bij pH 5,0 ~80 gew% vrijgekomen was binnen 15 uur, wat sterke pH-responsiviteit aantoont gedreven door protonatie van DOX en verminderde elektrostatische binding.

Cellulaire Opname en Cytotoxiciteit

Confocal microscopie toonde tijdsafhankelijke internalisatie van DOX-geladen hybriden, met sterke rode fluorescentie na 24 uur. MTT-assays onthulden verwaarloosbare cytotoxiciteit van Fe₃O₄ NC/PAH/PSS alleen (cellevensvatbaarheid > 85% bij 2 µM). Vrij DOX en DOX-geladen hybriden vertoonden dosis-afhankelijke dood van A549-cellen (IC₅₀ ≈ 1-2 µM). Verbeterde cytotoxiciteit van hybriden wordt toegeschreven aan duurzame, endosomale pH-getriggerde DOX-afgifte.

Cellulaire MRI

Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybriden geïinternaliseerd in A549-cellen en produceerden significante T₂-signaalreductie, wat hun nut als cellulaire MRI-contrastagenten bevestigt.

Conclusie

We hebben Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanoestructuren ontwikkeld die hoge T₂ MRI-contrast, pH-getriggerde DOX-afgifte en krachtige antitumour-activiteit in vitro combineren. Hun modulair ontwerp stelt verdere functionalisatie (bijv. targeterende liganden) toe voor in vivo toepassingen, wat ze positioneert als veelzijdige theranostische platforms voor kankerimaging en -therapie.