Amperometrische biosensor van matrix metalloproteïnase-7 verbeterd door Pd-gefunctionaliseerde koolstofnanocomposieten

Resultaten en discussie

Principe van de peptidesplitsingsbiosensor

Het constructieproces van de biosensor op basis van peptidesplitsing wordt geïllustreerd in Schema 1. Eerst werd Au-rGO via een elektrochemische methode op de glasachtige koolstofelektrode (GCE) afgezet, vervolgens werden peptiden geïmmobiliseerd op Au-rGO via Au-S-binding. Pd-CNC's werden samengesteld als een katalytische versterker en glutaaraldehyde werd geselecteerd als de chemische linker tussen het peptide en de versterkers. 4-CN en H₂ O₂ werden gebruikt als gekatalyseerde precipitatiesubstraten om de impedantie te verbeteren. In het bijzonder werd MMP-7 gekozen als het peptide-splitsingsenzym tussen alanine (A) en leucine (L) in peptiden [8], wat een onduidelijke stroomsignaalverandering veroorzaakte gemeten door SWV. Elektrodepositie van Au-rGO op de GCE heeft twee voordelen:(1) Au-rGO kan de geleidbaarheid van de detectie-interface effectief verbeteren; en (2) het staat de plaatsen toe om peptiden te immobiliseren. Gebruikmakend van de hoge impedantie en katalytische prestaties van de Pd-CNC's, werd ΔI vervolgens geamplificeerd door de Pd-CNC's te vervangen door de specifieke peptide (NH2-KKKRPLALWRSCCC-SH) splitsing. Dit fenomeen wordt bijgedragen aan de slechte elektrische geleidbaarheid van Pd-CNC's en de hoge impedantie van neerslag gegenereerd door de oxidatie van 4-CN met H₂ O₂ gekatalyseerd door Pd-CNC's.

Schematische illustratie van de Pd-gefunctionaliseerde koolstofnanosfeer als impedantieversterker voor amperometrische test van MMP-7

De katalytische precipitatiereactie op de GCE werd verder gekenmerkt door scanning-elektronenmicroscopie (SEM) door Pd-CNC's op het oppervlak van de peptiden / Au-rGO / GCE te incuberen (figuur 1a). Pd-CNC's werden na de precipitatiereactie gecoat met een onoplosbare laag, wat aangeeft dat de onoplosbare laag met slecht geleidend vermogen op de gemodificeerde elektrode werd gevormd (figuur 1b). Daarom werd met succes een biosensor voor ultragevoelige detectie van MMP-7 tot stand gebracht op basis van de gevoeligheidsamplificatie die wordt aangetrokken door zowel peptidesplitsing als katalytische precipitatie.

SEM-afbeeldingen van Pd-CNC's/peptiden/Au-rGO/GCE (a ) behandeld met katalytische precipitatiereactie (b )

Karakterisering van de Pd-CNC's

Door een typische hydrothermische methode werden homogene Pd-CNC's met succes bereid. De morfologieën van koolstofnanosferen, Pd-koolstofnanosferen en Pd-CNC's werden gekarakteriseerd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en energiedispersieve röntgenspectrometrie (EDS). Pd-nanodeeltjes werden gevormd en verdeeld over de koolstofnanosferen na de microgolfreactie (figuur 2b), wat de succesvolle bereiding van Pd-koolstof nanosferen met een diameter van 150 nm aantoont (figuur 2a). De morfologieën van Pd-CNC's worden getoond in figuur 2c. De EDS-resultaten bevestigen de chemische samenstelling van koolstofnanodeeltjes, Pd-koolstofnanosferen en Pd-CNC's, waaruit blijkt dat de koolstofnanodeeltjes C en O bevatten (Fig. 2d). Na de functionalisering van Pd-nanodeeltjes, bestond Pd ook in de spectra van Pd-koolstof nanosferen (Fig. 2e), terwijl S en N gevonden in de spectra van Pd-CNC's afkomstig zijn van BSA, dat werd gebruikt om Pd-koolstof nanosferen te blokkeren ( Afb. 2f). Deze resultaten onthullen intuïtief de succesvolle synthese van de Pd-CNC katalytische versterkers. HR-TEM-afbeeldingen van Pd-koolstof nanosferen (Fig. 3a) illustreren dat de gefunctionaliseerde Pd-nanodeeltjes (Fig. 3b) zich in face-center kubische (FCC) fase bevinden met een waarneembaar (1,1,1) roostervlak (Fig. 3c). Overeenkomstige snelle Fourier-transformatie (FFT) -beelden (Fig. 3d) ondersteunen ook de FCC-kristallijne aard van Pd-nanodeeltjes.

TEM-microfoto van koolstofnanosfeer (a ), Pd-koolstof nanosferen (b ) en Pd-CNC's (c ) EDS van koolstofnanosfeer (d ), Pd-koolstof nanosferen (e ) en Pd-CNC's (f )

HR-TEM-beelden van Pd-koolstof nanosferen (a ), vergrote afbeeldingen van Pd-nanodeeltjes (b, c ) en FFT-afbeeldingen van Pd-nanodeeltjes (d )

Karakterisering van constructieprocedures van de biosensor

De constructieprocedures van de biosensor werden gevolgd door SWV-metingen (Fig. 4a) en elektrochemische impedantiespectroscopie (EIS) (Fig. 4b). Vergeleken met het huidige signaal van kale GCE (curve bare GCE), nam de piekstroom in het potentiaalbereik toe tot ongeveer 420 μA (curve Au-rGO/GCE) na elektrodepositie van Au-rGO, wat kan worden toegeschreven aan de uitstekende geleidbaarheid van Au-rGO. Vervolgens nam de signaalstroompiek af na de immobilisatie van peptiden op de elektrode (curve-peptiden) en werd deze verder verlaagd na de koppeling tussen peptiden en Pd-CNC's vanwege de hoge impedantie van de peptiden en versterkers (curve Pd-CNC's). Na incubatie met MMP-7 nam de piekstroom toe (curve MMP-7-splitsing), wat kan worden veroorzaakt door de specifieke splitsing van peptiden door MMP-7 en gedeeltelijke verwijdering van versterkers van het elektrode-oppervlak. Onder dezelfde voorwaarden is de huidige wijziging (ΔI₁ ) tussen curven "Pd-CNC's" en "MMP-7-splitsing" werd berekend op 48,7 μA. Vervolgens werd de piekstroom verminderd na de katalytische precipitatiereactie van 4-CN, met een stroompiek van 136,1 A (curve MMP-7 splitsingsprecipitatie). Daarentegen induceerde de biosensor zonder MMP-7 een lagere stroompiek (54,9 μA, curve-precipitatie), die werd vermeld als het blanco signaal, na de gekatalyseerde neerslagreactie. In de gegeven omstandigheden, ΔI₂ was het huidige signaalverschil tussen curven "neerslag" en curve "MMP-7 splitsingsprecipitatie", toenemend van 48,7 naar 81,2 μA. EIS werd ook gebruikt om de fabricage van de biosensor te volgen. De weerstand tegen elektronenoverdracht kwam overeen met de halve cirkeldiameter van de Nyquist-grafieken (figuur 4b). Ter vergelijking:de plot van de peptiden/Au-rGO/GCE (curve peptiden) vertoont een grotere halve cirkel, en dus grotere weerstand, dan die van Au-rGO/GCE (curve Au-rGO/GCE) en kale GCE (curve kale GC) die de kleinste cirkel heeft, wat aangeeft dat peptiden met succes op de GCE zijn gemodificeerd. De weerstand nam toe wanneer peptiden via glutaaraldehyde aan de versterker werden gekoppeld (curve Pd-CNC's). De diameter van de halve cirkel nam enigszins af (kromme MMP-7-splitsing) na incubatie met MMP-7, wat kan worden toegeschreven aan de MMP-7 die de peptiden specifiek heeft gesplitst. Daarentegen nam de weerstand aanzienlijk toe wanneer de biosensor werd ondergedompeld in de oplossing van 4-CN en H₂ O₂ (neerslagcurve)_. Bij zowel peptidesplitsing als katalytische precipitatiereactie nam de weerstand duidelijk af (curve MMP-7 splitsingprecipitatie).

SWV (een ) en EIS (b ) reacties van modificatieproces van elektrode in 5 mM [Fe(CN)₆ ] ^3−/4- fosfaatgebufferd (0,1 M, pH = 7.4)

Optimalisatie van detectievoorwaarden

De hoeveelheid en incubatietijd van peptiden, als belangrijke factoren voor de detectieprestaties van de biosensor, werden verder geoptimaliseerd. Er werd gevonden dat het stroomsignaal dienovereenkomstig afnam wanneer de peptideconcentratie toenam van 20 tot 40 M en constant werd gehouden tussen 50 en 80 M (Fig. 5a). Om niet-specifieke adsorptie te voorkomen, kozen we 50 M voor daaropvolgende metingen en optimaliseerden vervolgens de incubatietijd van het 50 M-peptide (figuur 5b). De SWV-stroom nam geleidelijk af van 20 naar 40 min, en bleef na 40 min constant. Zo werd 40 min gekozen als de incubatietijd voor peptiden. De splitsingsreactietijd is ook een belangrijke factor voor de analytische prestaties van de biosensor (figuur 5c). Het signaal van de biosensor nam toe wanneer de splitsingstijd tussen 30 en 50 min lag, en bleef vervolgens constant na 50 min, wat suggereert dat het peptide volledig was gesplitst. Dus werd 50 min gekozen als de splitsingstijd voor de volgende experimenten. De neerslagreactie, die ook de gevoeligheid van de biosensor beïnvloedt (Fig. 5d), bleek binnen 50 minuten toe te nemen en het elektrochemische signaal nam continu af. Aangezien het huidige signaal constant bleef met een verdere toename van de reactietijd, werd 50 min geselecteerd als de neerslagreactietijd voor de volgende test.

Effecten van peptideconcentratie (a ), incubatietijd van 50 μM peptide (b ), peptidesplitsingstijd (c ) en neerslagreactietijd (d ) over de huidige reacties van de biosensor

Prestaties van voorgestelde biosensor

Na incubatie met verschillende concentraties MMP-7 onder de optimale omstandigheden, werd de prestatie van de voorgestelde biosensor bepaald. Zoals getoond in Fig. 6, met afnemende concentratie van MMP-7, nam het SWV-signaal af. De kalibratiegrafiek laat een goede lineaire relatie zien tussen de stroompieken en de logaritme van de analytconcentraties in het bereik van 0,1 pg ml ⁻¹ tot 100 ng mL ⁻¹ . De lineaire vergelijking werd bepaald als (I = − 16,53lgCMMP-7-137,26) met een correlatiecoëfficiënt van 0,9967. De detectielimiet van de biosensor was 17,38 fg mL ⁻¹ voor MMP-7 bij een signaal-ruisverhouding van 3 (S/N = 3; is de standaarddeviatie van het signaal in een blanco oplossing). Vergeleken met recente rapporten over peptide-splitsingsdetectie van MMP-7, vertoonde de biosensor betere analytische prestaties (tabel 1).

een SWV-reacties van elektrochemische detectie voor MMP-7 in 5 mM [Fe(CN)₆ ] ^3−/4− met fosfaat gebufferd (0,1 M, pH = 7.4) bij de concentraties van 100 fg mL ⁻¹ tot 100 ng mL ⁻¹ . b Lineaire kalibratiecurve van stroom en de logaritme van de concentratie van MMP-7. De foutbalken zijn standaarddeviaties voor n = 3

Evaluatie van de prestaties van de immunosensor

Om de reproduceerbaarheid van de biosensor te beoordelen, werden drie aangepaste elektroden geïncubeerd met 0,01, 0,1, 1, 10 en 100 ng ml ⁻¹ MMP-7. De overeenkomstige standaarddeviaties werden berekend op respectievelijk 1,3%, 1,4%, 4,0%, 1,0% en 3,0%, wat wijst op een goede reproduceerbaarheid van de biosensor. MMP-2, NSE, PSA, TBS en BSA werden gebruikt als afleiding om de specificiteit van deze biosensor te analyseren. Er werden geen duidelijke reacties waargenomen toen de biosensor werd geïncubeerd met individuele mengsels van 1 ng mL ⁻¹ MMP-7 met (100 ng mL ⁻¹ elk) MMP-2, NSE, PSA, TBS en BSA. Vergeleken met de biosensor die is geïncubeerd met slechts 1 ng mL ⁻¹ MMP-7 waren de huidige signalen van elk mengsel bijna hetzelfde (Fig. 7a), wat aantoont dat de biosensor een uitstekende specificiteit voor MMP-7 vertoont. Om de stabiliteit te onderzoeken, werd de geconstrueerde biosensor 28 dagen bewaard bij 4 ° C en de prestaties voor MMP-7-detectie werden elke 7 dagen geëvalueerd (figuur 7b). De relatieve standaarddeviaties (RSD) tussen parallelle experimenten waren allemaal minder dan 10%, wat een opmerkelijke stabiliteit van de biosensor impliceert.

Huidige SWV-antwoorden (a ) over het anti-interferentievermogen van de biosensor (de foutbalken zijn standaarddeviaties voor n = 3). De concentraties van afleiding:MMP-2 (100 ng mL ⁻¹ ), NSE (100 ng mL ⁻¹ ), PSA (100 ng mL ⁻¹ ), THR (100 ng mL ⁻¹ ) en BSA (100 ng mL ⁻¹ ), respectievelijk. Het mengsel bevat al die afleidingen (100 ng mL ⁻¹ ) en MMP-7 (1 ng mL ⁻¹ ). SWV-reacties (b ) van de voorgestelde biosensoren opgeslagen bij 4 ° C gedurende verschillende tijd voor de detectie van 1 ng ml ⁻¹ MMP-7

Om de uitvoerbaarheid van de voorgestelde methode te onderzoeken, werden recovery-experimenten uitgevoerd. De terugvorderingen varieerden van 86,3 tot 117,2% (tabel 2), wat verder wijst op de veelbelovende bruikbaarheid van de biosensor in klinische analyses.