Ontwikkeling van polymere micellen van oleanolzuur en evaluatie van hun klinische werkzaamheid

Resultaten en discussie

Bepaling van solubilisator, oppervlakteactieve stof en polymeer

De oplosbaarheid van oleanolzuur in biocompatibele solubilisatoren, in het bijzonder oppervlakteactieve stoffen en polymeren, wordt weergegeven in Tabel 1. Oleanolzuur heeft de neiging oplosbaar te zijn in hydrofobe oliën met een lage hydrofiele-lipofiele balans (HLB). Capryol® 90 heeft een iets hogere HLB-waarde in vergelijking met algemene oliën [26]. Oleanolzuur vertoont echter een relatief hoge oplosbaarheid in Capryol® 90. Bovendien kan Capryol® 90 gemakkelijk worden gestabiliseerd als de binnenste kern van micellen [27]. Na het selecteren van Capryol® 90 werden verschillende soorten oppervlakteactieve stoffen of poloxameren gescreend op het schilgedeelte van de oleanolzuurmicellen [27,28,29,30]. De oleanolzuurmicelsamenstellingen weergegeven in Tabel 2 zijn degene die onmiddellijk na verdunning met gedestilleerd water transparant waren. Sommige samenstellingen waren echter onstabiel en ondergingen precipitatie, fasescheiding of gelering binnen 24 h. Representatieve afbeeldingen van geprecipiteerde, fasegescheiden, transparante vloeistof- en geltoestanden worden getoond in Fig. 2. De uiteindelijke toestand van elke formule is samengevat in Tabel 3. Samenstellingen G en H bleven transparant, zelfs na 24 h. Hoewel de samenstelling I helder bleef, was het een gel in plaats van een vloeistof. Samenstellingen A tot D werden ondoorzichtig met neerslag na 24 h. Op basis van deze resultaten werden composities G en H geselecteerd voor verdere ontwikkeling.

Representatieve afbeeldingen van a neerslag, b fasescheiding, c transparante vloeistof, en d gelering van oleanolzuurmicellen

Kenmerken van de polymere micellen van oleanolzuur

De structuren van de polymere micellen van oleanolzuur werden onderzocht door middel van een kleurtest. Figuur 3 toont de afbeeldingen van het mengsel van Capryol® 90 en gedestilleerd water, Capryol® 90, gedestilleerd water en de polymere micellen van samenstelling G (PMO-G) en van samenstelling H (PMO-H), na toevoeging van methyleenblauw aan de oplossing. Er trad duidelijke fasescheiding op voor het mengsel van Capryol® 90 en gedestilleerd water. Neerslag van methyleenblauw werd waargenomen in het geval van Capryol® 90. Gedestilleerd water werd donkerblauw na toevoeging van methyleenblauw. PMO-G en PMO-H werden ook blauw, wat aangeeft dat de polymere micellen bestonden uit een binnenkern in de oliefase en een buitenschil in de waterfase. Met andere woorden, een amfifiel polymeer, poloxameer 407 in samenstelling G en H, dient als een buitenste schil en helpt om met succes polymere micellen van oleanolzuur te vormen door de binnenkern van Capryol® 90 die oleanolzuur bevat in te kapselen [31].

Kleurtest met methyleenblauw:(a ) mengsel van Capryol® 90 en gedestilleerd water, (b ) Capryol® 90, (c ) gedestilleerd water, (d ) PMO-G, en (e ) PMO-H

Deeltjesgrootte, grootteverdeling en vorm kunnen goede indicatoren zijn voor het voorspellen van de fysieke stabiliteit van micelformuleringen. De gemiddelde deeltjesgrootte van PMO-G was 80,4 nm en die van PMO-H was 57 nm (figuur 4). De histogrammen van PMO-A, G en H worden getoond in Fig. 5 om de grootteverdelingen te vergelijken die worden beïnvloed door de fasetoestand. Zoals weergegeven in tabel 3, is PMO-A ondoorzichtig vanwege neerslag en zijn PMO-G en H transparant. De deeltjesgrootte van PMO-A is meer dan 100 nm en PMO-A vertoont een grotere grootteverdeling dan PMO-G en H (Fig. 5). PMO-H vertoont een smallere deeltjesgrootteverdeling dan PMO-G en vertoont een vloeibaarheid die geschikt is voor cosmetische producten.

De gemiddelde deeltjesgrootte van PMO-G en PMO-H uit tabel 2:80,4 ± 11,1 nm (PMO-G) en 57 ± 5,24 nm (PMO-H)

Deeltjesanalysehistogram van drie verschillende PMO-monsters. een PMO-A, 121,28 nm; b PMO-G, 80,4 nm; en (c ) PMO-H, 57 nm

De inkapselingsefficiëntie voor zowel PMO-G als PMO-H was 99 tot 100%, wat aangeeft dat bijna 100% van het oleanolzuur was ingekapseld in de binnenste kern van PMO (Fig. 6).

Inkapselingswerkzaamheid van PMO-G en PMO-H met bijna 100% efficiëntie van medicijninkapseling:98,26 ± 0,17% (PMO-G) en 99,18 ± 1,06% (PMO-H)

De vorm van PMO-G en PMO-H werd onderzocht door middel van scanning elektronen cryomicroscopie (Cryo-SEM). Cryo-SEM toonde aan dat zowel PMO-G als PMO-H bolvormige polymere micellen waren. PMO-H polymere micellen waren echter consistenter in grootte en vorm dan PMO-G polymere micellen (Fig. 7).

Scanning elektronen cryomicroscopische beelden van a PMO-G en b PMO-H

In vitro onderzoek naar huidpermeatie van PMO

De totale hoeveelheid oleanolzuur die in de huid achterblijft, en de totale hoeveelheid oleanolzuur die door de huid is gedrongen als functie van de tijd, werden gemeten met behulp van de huid van een 6 weken oude vrouwelijke haarloze muis. Vier verschillende formuleringen, PMO-G, PMO-H, het mengsel van oleanolzuur en Tween 80 gedispergeerd in gedestilleerd water (OTw), en het mengsel van oleanolzuur en propyleenglycol gedispergeerd in gedestilleerd water (OPG) werden vergeleken wat betreft huid permeatie-efficiëntie van oleanolzuur. De totale hoeveelheden oleanolzuur die na 24 uur door de huid waren gedrongen, waren 29,49 ± 4,00% voor PMO-H, 21,39 ± 5,91% voor PMO-G, 13,66 ± 0,81% voor OTw en 5,90 ± 2,47% voor OPG. Zoals getoond in Fig. 7 was de eerste detectie van oleanolzuur in het geval van zowel PMO-G als PMO-H mogelijk bij 8 h, terwijl de eerste detectie van oleanolzuur in OTw mogelijk was bij 10  h en OPG bij 20 H. De hoeveelheden oleanolzuur die in de huid achterbleven waren 56,22 ± 13,50% voor PMO-H, 36,74 ± 0,72% voor PMO-G, 27,44 ± 7,02% voor OTw en 26,28 ± 5,42% voor OPG. PMO-H toonde de grootste hoeveelheid van zowel oleanolzuur dat door de huid dringt als oleanolzuur dat in de huid achterbleef (Fig. 8). Deze resultaten geven aan dat PMO's sneller en meer kunnen doordringen dan formuleringen die geen micellen vormen.

Totale hoeveelheid oleanolzuur in PMO-G, PMO-H, oleanolzuur en Tween 80-mengsel gedispergeerd in gedestilleerd water (Otw) en oleanolzuur en propyleenglycolmengsel gedispergeerd in gedestilleerd water (OPG) doordrongen door de huid en de hoeveelheid oleanolic zuur in elke formulering als functie van de tijd. Hoeveelheid oleanolzuur bleef in de huid achter na 24 h:36,74 ± 0,72% (PMO-G), 56,22 ± 13,50% (PMO-H), 27,44 ± 7,02% (Otw) en 26,28 ± 5,42% (OPG). Hoeveelheid doorgedrongen oleanolzuur na 24 h:21,39 ± 5,91% (PMO-G), 29,49 ± 4,00% (PMO-H), 13,66 ± 0,81% (Otw) en 5,90 ± 2,67% (OPG)

Stabiliteit van vloeibare oleanolzuur polymere micellen

Op basis van de karakterisering en in vitro permeatiestudies werd uiteindelijk PMO-H geselecteerd voor ampulbereiding. Voorafgaand aan de bereiding van de ampul werd de stabiliteit van ONM-H geëvalueerd. Voor het stabiliteitsonderzoek werd PMO-H gedurende 3  maanden bewaard in injectieflacons onder omstandigheden van het versnelde stabiliteitsonderzoek bij 40°C/75% RH. Neerslag, fasescheiding, kleurveranderingen en transparantie werden vervolgens visueel beoordeeld. De hoeveelheid oleanolzuur werd vervolgens gemeten met behulp van HPLC en er werd ook gecontroleerd op veranderingen in deeltjesgrootte. De stabiliteit werd in de loop van de tijd gecontroleerd. PMO-H bleef transparant zonder precipitatie of fasescheiding en de kleur veranderde niet gedurende 3  maanden onder de versnelde stabiliteitsomstandigheden. Het aandeel oleanolzuur zoals gemeten met HPLC en de veranderingen in de deeltjesgrootte in de tijd worden getoond in Fig. 9. Het aandeel oleanolzuur bleef meer dan 98% en de deeltjesgrootte van 49,6 ± 5 nm bleef bijna constant tijdens de stabiliteit van 3 maanden. studeer periode. Deze resultaten tonen aan dat PMO-H onder de versnelde stabiliteitsomstandigheden gedurende 3  maanden fysisch en chemisch stabiel is.

De inhoud en de deeltjesgrootte verandert van PMO-H tijdens een stabiliteitstest van 3 maanden onder acceleratieomstandigheden bij 40°C/75% RH. Aandeel oleanolzuur in PMO-H:100 ± 1,6% (0 maand), 99,9 ± 0,2% (1 maand), 99,5 ± 0,2% (2 maand) en 99,3 ± 0,2% (3 maand). Deeltjesgrootte van PMO-H:55,3 ± 6,5 nm (0 maanden), 54,6 ± 7 nm (1 maand), 51,0 ± 5,56 nm (2 maanden) en 49,6 ± 5 nm (3 maanden)

Klinische test

Menselijke irritatietest

Voorafgaand aan de klinische proef werd een menselijke irritatietest uitgevoerd op 25 gezonde vrouwelijke en mannelijke vrijwilligers in de leeftijd van 22-56 jaar. Het testproduct werd gedurende 24 uur op de bovenarm van de proefpersonen geplakt en de huidirritatie-index werd 30 minuten, 24 uur en 48 uur na het verwijderen van de pleister gemeten. Irritatie werd niet waargenomen met de cosmetica-ampullenformule die PMO-H bevatte 1 uur of 48 uur na het verwijderen van de pleister.

Klinische proef

De klinische proef werd uitgevoerd op 23 vrouwelijke proefpersonen in de leeftijd van 30~65 jaar met rimpels rond hun ogen; met uitzondering van de 3 drop-outs, voltooiden 20 proefpersonen de proef door zowel het testproduct, de PMO-H-ampul als de controle gedurende 8 weken afzonderlijk op de linker- of rechterkant van hun gezicht aan te brengen. Huidveranderingen werden geëvalueerd op basis van vijf parameters:gemiddelde ruwheid (R3) als primair eindpunt en vier aanvullende parameters als secundaire eindpunten, namelijk huidruwheid (R1), maximale ruwheid (R2), gladheidsdiepte (R4) en rekenkundig gemiddelde ruwheid (R5). De visuele evaluatiescore voegde nog een secundair eindpunt toe. De resultaten zijn samengevat in Tabel 4.

Het primaire eindpunt R3 was gedaald met 0,673% na 4 weken gebruik van het testproduct en statistisch significant met 7,835% na 8 weken gebruik (p =0,006). Met de controletoepassing was R3 na 4 weken gebruik met 5,127% gestegen en statistisch significant met 9,971% na 8 weken gebruik (p =0,010). The difference in R3 value between the areas treated by the test product and those treated by the control was statistically significant after 8 weeks of use (p =0.000) but not statistically significant after 4 weeks of use, perhaps due to inter-subject variation (Fig. 10).

Changes in primary endpoint value, R3, before, after 4 weeks use, and after 8 weeks use of an ampoule containing polymeric micelles of oleanolic acid and the control during clinical trial. R3 value of test product use:0.094 ± 0.023 before use, 0.093 ± 0.023 after 4 weeks use, 0.086 ± 0.020 after 8 weeks use. R3 value of control product:0.087 ± 0.023 before use, 0.091 ± 0.025 after 4 weeks use, 0.095 ± 0.024 after 8 weeks use (A.U. for arbitrary unit). * ¹ The wrinkle analysis of R3 value decreased statistically significantly. * ² The wrinkle analysis of R3 value increased statistically significantly

The analysis of the secondary endpoint R1 showed that the value had decreased by 4.629% after 4 weeks of test product use and statistically significantly by 9.973% after 8 weeks of use (p =0.017). With control application, R1 had increased by 8.037% after 4 weeks of use and 4.799% after 8 weeks of use. The difference in R1 values between the areas using the test product and the control was not statistically significant after 4 weeks of use but was after 8 weeks of use (p =0.024). The secondary endpoint R2 had decreased by 1.048% after 4 weeks of test product use and 5.803% after 8 weeks. With control application, it had increased by 7.261% after 4 weeks and 9.536% after 8 weeks. The difference in R2 value between the areas treated by the test product and those treated by the control was statistically significant after 8 weeks of use (p =0.016) but not after 4 weeks of use. The secondary endpoint R4 had significantly decreased by 8.594% (p =0.039) after 4 weeks of test product use and by 9.747% after 8 weeks of use. With the control, R4 had increased by 10.764% after 4 weeks of use and 3.491% after 8 weeks of use. Interestingly, the difference in R4 value between the areas using the test product and the control was statistically significant after 4 weeks of use (p =0.008) but not after 8 weeks. The secondary endpoint R5 had decreased by 6.333% after 4 weeks of test product use and 8.556% after 8 weeks of use. The difference in R5 value between the areas of using the test product and the control was not statistically significant following 4 weeks or even 8 weeks of use.

The analysis of the further secondary endpoint, the visual evaluation of wrinkles, showed that the visual evaluation score had decreased by 2.917% after 4 weeks of test product use and statistically significantly decreased by 8.333% after 8 weeks of use (p =0.034). With application of the control, the visual evaluation score had increased by 1.667% after 4 weeks and 4.167% after 8 weeks. The difference of the visual evaluation score between the areas treated by the test product and by the control was statistically significant after 8 weeks of use (p =0.046) but not after 4.

In summary, the analysis of the wrinkled area around the eyes showed that the difference in the primary endpoint value R3 between the areas treated by the test product and by the control was statistically significant after 8 weeks of use. In terms of the secondary endpoints, all values had decreased after test product use and increased after control use. The difference in R4 values between the areas treated by the test product and those treated by the control was statistically significant after 4 weeks of use, but the difference of the R1 and R2 values were statistically significant only after 8 weeks of use (Fig. 11). The visual evaluation score by professionals showed that all the average visual evaluation scores for wrinkles had decreased after 4 weeks and 8 weeks of test product treatment compared to the control (Table 5). The difference in the visual evaluation score between the areas treated by the test product and by the control was statistically significant after 8 weeks of use (Fig. 12). Overall, according to all endpoints, the cosmetics formula containing PMO-H as a primary ingredient was found to help improve wrinkles after 8 weeks of use (Fig. 13).

Results of secondary endpoint R1, R2, R4, and R5 for skin wrinkle measurement—before use, after 4 weeks use, and after 8 weeks use of the test product and the control. Please refer to Table 4 for the exact values (A.U. for arbitrary unit)

Results of visual evaluation of skin—before use, after 4 weeks use, and after 8 weeks use of the test product and the control. Test product:3.050 ± 0.887 before use, 2.95 ± 0.999 after 4 weeks use, and 2.75 ± 0.851 after 8 weeks. Control product:2.900 ± 0.887 before use, 2.95 ± 0.945 after 4 weeks use, and 3.000 ± 0.918 after 8 weeks use. * ¹ The visual evaluation grade of wrinkles by professionals decreased significantly. * ² The visual evaluation grade of wrinkles by professionals increased significantly

Pictures of the tested areas