Vervaardiging van hybride nanostructuren op basis van Fe3O4-nanoclusters als theranostische middelen voor magnetische resonantiebeeldvorming en medicijnafgifte

Resultaten en discussie

De Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren worden bereid door zelfassemblage van primair ijzeroxide (Fe₃ O₄ ) NP's resulterend in dicht opeengepakte bolvormige aggregaten door een micro-emulsie zelfassemblagetechniek zoals eerder beschreven met modificatie [17, 47], gevolgd door een LBL elektrostatische adsorptiemethode. Figuur 1 illustreert de schematische illustratie van de synthese van Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren. Hydrofoob met oliezuur gecoat magnetiet Fe₃ O₄ NP's werden aanvankelijk geproduceerd door het thermische ontledingsproces in organisch oplosmiddel [46]. Fe₃ O₄ NP's zijn bolvormig en uniform van grootte met een gemiddelde deeltjesgrootte van ongeveer 15 nm (aanvullend bestand 1:figuur S1). Voor de assemblage van magnetische NC's, de OA-gecoate Fe₃ O₄ NP's werden gedispergeerd in cyclohexaan en vervolgens druppelsgewijs toegevoegd aan een waterige oplossing die SDBS bevatte. De complexe oplossing werd ultrasoon behandeld om een ​​stabiele olie-in-water-emulsie te vormen. Na de verdamping van organisch oplosmiddel in de emulsie, Fe₃ O₄ NP's werden zelf samengesteld om bolvormige nanoclusters te vormen via hydrofobe interactie. Vervolgens de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren werden bereid via een LBL-methode door middel van elektrostatische aantrekkelijke interacties, die schematisch wordt geïllustreerd in Fig. 1.

Schematische weergave van de synthese van Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren als theranostische middelen voor MRI en medicijnafgifte

De morfologieën en afmetingen van de Fe₃ O₄ NC's en de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybride nanostructuren werden onderzocht met respectievelijk TEM en DLS. Zoals getoond in Fig. 2a en b, de Fe₃ O₄ NC's demonstreren de quasi-sferische clusters. De gemiddelde deeltjesgrootte gemeten door DLS is ongeveer 57 nm (figuur 2e). In eerdere rapporten werd PAK met positieve lading of PSS met negatieve lading afwisselend afgezet op het sjabloonoppervlak vanwege hun uitstekende elektrostatische eigenschappen [48,49,50,51]. Om de vorming te bestuderen van elke polyelektrolytlaag die is afgezet op de Fe₃ O₄ NC's werden de zeta-potentiaal-experimenten uitgevoerd. De variatie van zeta-potentiaal met de polyelektrolytlaag voor PSS/PAH- en DOX-coatings wordt weergegeven in aanvullend bestand 1:figuur S2. De ongerepte Fe₃ O₄ NC's hebben een negatief zeta-potentiaal van − 19,7 mV vanwege het bestaan ​​van SDBS. De absorptie van een positief geladen PAK enkele laag op Fe₃ O₄ NC's keren het oppervlaktepotentiaal om van − 19,7 naar + 32 mV. Vervolgens veroorzaakt afzetting van de negatief geladen PSS-laag een andere oppervlaktepotentiaalomkering van +-32 naar -34 mV. Dit duidt op een stapsgewijze laaggroei tijdens de fabricage van de magnetische NC hybride nanostructuren. Deze resultaten laten zien dat de PAK- en PSS-lagen met succes zijn gecoat op de Fe₃ O₄ NC's. Ten slotte werd DOX met succes geadsorbeerd op het oppervlak van de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren, wat werd bevestigd door de positieve zeta-potentiaal (+ -1,91 mV) (aanvullend bestand 1:figuur S2). De TEM-beelden met een andere vergroting van de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybride nanostructuren worden getoond in Fig. 2c en d. Er wordt geen significant structureel en morfologisch verschil waargenomen na polyelektrolytcoatings. In vergelijking met Fig. 2a en b kan het heldere contrast worden waargenomen en de grootte van de Fe₃ O₄ NC/PAK/PSS hybride nanostructuren worden iets verhoogd door de coating van PAK- en PSS-lagen. De gesynthetiseerde magnetische hybride nanostructuren vertonen een bijna mono-gedispergeerde quasi-sferische vorm met een gemiddelde grootte van ongeveer 84 nm volgens de resultaten van DLS-meting (Fig. 2f).

TEM-afbeeldingen van Fe₃ O₄ NC's (a , b ) en Fe₃ O₄ NC/PAK/PSS (c , d ) bij respectievelijk lagere en hogere vergroting. Grootteverdeling van Fe₃ O₄ NC's (e ) en Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybride nanostructuren (f )

Om de mogelijke toepassing van Fe₃ . te evalueren O₄ NC/PAH/PSS hybride nanostructuren in MRI, de transversale relaxatiesnelheden van protonen (1/T ₂ ) als functie van de Fe-ionenconcentratie werden bepaald met behulp van de Bruker AVANCE 500WB-spectrometer bij 11,7   T. Een lineair verband tussen relaxatiesnelheden met Fe-ionenconcentratie werd waargenomen, zoals weergegeven in figuur 3b. Verder zijn de transversale relaxatiesnelheden (1/T ₂ ) nam toe met toenemende concentratie van Fe₃ O₄ NC's vanwege de hoge mate van aggregatie van de Fe₃ O₄ magnetische NP-kern, wat aantoont dat de magnetische hybride nanostructuren een effectieve T . kunnen zijn ₂ -gewogen MRI-contrastmiddel (Fig. 3a). Gebaseerd op de helling van de plot in Fig. 3b, de transversale relaxiviteitswaarde (r ₂ ) werd vastgesteld op 651,38 mM ⁻¹ S ⁻¹ , wat hoger is dan die van het gerapporteerde werk [22]. Vergeleken met commerciële T ₂ contrastmedia kunnen de nanoclusters het contrastvermogen van Fe aanzienlijk verbeteren nadat de magnetische NP's zelf zijn samengesteld op basis van het collectieve effect, waardoor het angiografische effect aanzienlijk wordt verbeterd. In het vorige werk vertoonden de geassembleerde magnetiet-nanokristallen een hoger niveau van verzadigingsmagnetisatie dan individuele nanokristallen vanwege het collectieve effect van magnetische nanokristallen [43, 52].

een T ₂ -gewogen MRI-beelden van de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybride nanostructuren in verschillende concentraties in water. b Perceel van ontspanningspercentage r ₂ tegen Fe-concentratie in Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybride nanostructuren. De relaxiviteitswaarde r ₂ werd verkregen uit de helling van de lineaire aanpassing van de experimentele gegevens

Om de medicijnlaadcapaciteit van Fe₃ . te evalueren O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren als dragers voor medicijnafgifte, een in water oplosbaar antikankergeneesmiddel (DOX) werd gekozen als modelgeneesmiddel. De opslag van DOX in de hybride nanostructuren met een hoog rendement werd voor het eerst onthuld door de kleurverandering van de oplossing. De kleur van de oplossing van Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS en de zuivere DOX-oplossing waren respectievelijk geelachtig en rood (Fig. 4a en b). Na het vormen van de Fe₃ O₄ NC / PAH / PSS / DOX hybride nanostructuren, de kleur van de oplossing werd oranje (figuur 4c). Door de aanwezigheid van Fe₃ O₄ NP's, de DOX-geladen nanostructuren in de suspensie zouden kunnen worden gescheiden door een externe magneet, wat suggereert dat het grote potentieel van de verkregen hybride nanostructuren voor magnetisch gerichte medicijnafgifte (figuur 4d). UV–vis absorptiespectroscopie werd gebruikt om de effectieve DOX-opslagcapaciteit te bepalen. Figuur 4e toont de UV–vis absorptiespectra van de waterige DOX-oplossing voor en na de interactie met Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybride nanostructuren. Vergeleken met vrije DOX werden de vergelijkbare absorptiepiekkarakteristieken waargenomen in de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren, wat de recombinatie-absorptiepiek is van Fe₃ O₄ NC's en DOX. Het monster zonder DOX toont alleen de absorptiepiek van Fe₃ O₄ NC's. Deze gegevens geven aan dat DOX als medicijn met succes kan worden geabsorbeerd op het oppervlak van de hybride nanostructuren. Er is ook gevonden dat er een bovengrens is voor de adsorptieconcentratie van DOX geladen op het oppervlak van de hybride nanostructuren. Figuur 4f toont het PL-spectrum van de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren na centrifugatie wanneer verschillende concentraties DOX werden toegevoegd aan de Fe₃ O₄ NC/PAK/PSS-oplossing. De luminescentie-intensiteit van DOX neemt toe naarmate de toegevoegde DOX toeneemt tot een plafond (8 mg/ml) wordt bereikt met de concentratie van Fe₃ O₄ NC/PAK/PSS (1.30 × 10 ⁻² mg/ml) ongewijzigd. Daarna neemt de hoeveelheid insluiting af vanwege de overtollige DOX, die niet kan worden geadsorbeerd op het oppervlak van Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren. De sterkste fluorescentie-intensiteit van DOX komt overeen met de concentratie bij 8 mg/mL, en het overeenkomstige monster zou worden gebruikt voor verder onderzoek om biomedische experimenten uit te voeren. De gegarandeerde efficiëntie van het laden van geneesmiddelen van de hybride nanostructuren is cruciaal voor de klinische toepassing. De laadefficiëntie werd berekend door de oppervlakte-integraal van de DOX-fluorescentie-intensiteit met behulp van de standaardcurvemethode van DOX [53, 54]. De laadefficiëntie werd berekend tot 24,39% voor de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren. Daarom is er een theranostisch platform opgebouwd op basis van de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren dankzij de effectieve absorptie van antitumormiddel DOX.

Foto's (a –d ) van de verschillende geabsorbeerde stadia van DOX op de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybride nanostructuren. De UV–vis absorptiespectra (e ) van DOX, Fe₃ O₄ NC/PAK/PSS en Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren. De luminescentiespectra (f ) van Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren wanneer de verschillende concentraties DOX werden toegevoegd aan de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybride nanostructuuroplossing

De in vitro geneesmiddelafgevende profielen van Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren onder verschillende pH-waarden van de omgeving worden getoond in Fig. 5. De Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren werden gedialyseerd door een dialysemembraan in fosfaatbuffers bij 37°C. Het vrijgekomen DOX uit de hybride nanostructuren werd verzameld en vervolgens werd de vrijgekomen hoeveelheid DOX berekend door de fluorescentie-intensiteit van het supernatant. Bij fysiologische pH   7,4 is de waargenomen afgifte van het geneesmiddel een proces van langzame afgifte. Ongeveer 20 wt% DOX kwam vrij bij de eerste 5 h en ging toen de stabiele fase van langzame afgifte in. Bij pH   5,0, werd ongeveer 80 wt% DOX vrijgemaakt uit de hybride nanostructuren bij de eerste 15   uur voordat een afgifteplateau werd bereikt. De plateaupercentages van DOX-afgifte die werden waargenomen over een periode van 30 h waren respectievelijk 80 ± 3 wt% en 20 ± 3 wt% bij pH  5.0 en 7.4. Het is te zien dat de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren hebben een aanhoudende afgifteprofiel en een hogere DOX-afgiftesnelheid onthuld bij pH  5.0 dan bij pH 7.4. De lage pH van de omgeving versnelt de DOX-afgifte van de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren. Dat komt door de protonatie van de –NH₂ groep DOX onder zure omstandigheden, wat de elektrostatische interactie tussen DOX en PSS-polymeren bij lage pH-waarden vermindert [55]. De onderzoeken naar geneesmiddelafgifte wijzen op de goede stabiliteit van elektrostatisch gebonden geneesmiddelmoleculen in fysiologische pH en de getriggerde afgifte bij zure omstandigheden, vergelijkbaar met de gerapporteerde werken [56,57,58]. Daarom is de verkregen Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren zijn de pH-responsieve systemen voor DOX-medicijnafgifte en geschikt voor de specifieke behandeling van solide tumoren [59].

Plot van de release van DOX uit de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren in PBS-buffer bij respectievelijk pH 7.4 en 5.0

De cellulaire opname en cytotoxiciteit zijn sleutelfactoren om het potentieel van een nieuw medicijnafgiftesysteem te evalueren. De cellulaire opname en cytotoxiciteit van Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren op A549-cellijnen werden bestudeerd. De intercellulaire opname van Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren werden onderzocht met behulp van optische en fluorescentiemicroscopie, wat voornamelijk werd gerealiseerd door de fluorescentie van DOX te volgen. De Fe₃ O₄ Van hybride nanostructuren van NC/PAH/PSS/DOX is bewezen dat ze effectief zijn in het afleveren van DOX aan kankercellen. Zoals getoond in Fig. 6, werd sterke rode fluorescentie van DOX waargenomen in kankercellen na incubatie gedurende 24 h. De hybride nanostructuren werden voornamelijk geïnternaliseerd door endocytose [60]. Na celopname gaven de hybride nanostructuren DOX vrij in de zure omgeving rond het endosoom/lysosomen, waarbij een voldoende lage pH (4,3) een effectieve DOX-afgifte zou kunnen veroorzaken (pH   5,0, Fig. 5). De Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren vertoonden tijdsafhankelijke opname in A549-kankercellen, zoals weergegeven in Fig. 6. Op 0,5 h na incubatie was rode fluorescentie zichtbaar rond de cellen. De resultaten laten zien dat de hybride nanostructuren met DOX voornamelijk rond de A549-cellen bleven. Toen de incubatietijd echter toenam tot 24 h, nam het intercellulaire fluorescentiesignaal van de A549-cellen toe. Het is duidelijk dat veel hybride nanostructuren in de loop van de tijd de kankercellen kunnen binnendringen. Deze resultaten bevestigen dat de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren kunnen DOX efficiënt overbrengen naar A549-cellen. DOX dat vrijkomt uit de hybride nanostructuren in het cytoplasma passeert het kernmembraan en hoopt zich uiteindelijk op in de kern, waarbij cellen worden gedood door veranderingen in de DNA-conformatie te veroorzaken [61].

Confocale fluorescentiemicroscopische beelden van A549-cellen geïncubeerd met de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren bij 37 °C voor a 0,5 h en b 24u. Schaalbalk, 20 μm

Om de farmacologische activiteit van de Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybride nanostructuren, de cytotoxiciteit voor A549-cellen in vitro werd bepaald met de MTT-methode. Figuur 7 toont de celactiviteit van vrij DOX, Fe₃ O₄ NC/PAK/PSS en Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures with different concentrations after incubation with A549 cells for 24 h. The material amounts were calculated according to the concentration of DOX. The free DOX concentration was the same as the DOX concentration in Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, and the concentration of Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructure was the same as the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS concentration in the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures. Each sample was cultured with A549 cells for 24 h. The concentration of Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS ranged from 0.1 to 2.0 μΜ, and the cell survival rate exceeded 85%. This indicated that Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructures had no obvious cytotoxicity to cancer cells and had good biocompatibility. After incubating with cancer cells for 24 h, however, the free DOX and Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures showed obvious cytotoxicity. The cellular viability progressively decreased with increasing effective DOX concentration. As shown in Fig. 7, when the effective DOX concentration was increased from 0.1 up to 2.0 μM, the relative cell viability decreased from about 92% to about 50% for free DOX, and from about 89% to about 40 % for Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, respectively.

Relative viability of A549 cells incubated with free DOX, Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS, and Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at different concentrations for 24 h. Error bars were based on triplicate samples

These results indicate that both free DOX and Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures have dose-dependent cytotoxicity to cancer cells. The cytotoxicity originates from the loaded DOX rather than Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructures. Cell uptake of free DOX is faster than that of DOX-loaded hybrid nanostructures. This reason is that small DOX molecules can quickly spread into cells, while Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures must be endocytosis in order to enter cancer cells. Because of the hypoxia-induced coordinated upregulation of glycolysis, the acidic extracellular environment of solid tumors is stronger than that of normal tissues [62]. At the cellular level, the internalization of most of the hybrid nanostructures will take place through endocytosis. With the increase of DOX concentration, more and more hybrid nanostructures loaded with DOX are endocytosed into cancer cells. After cellular endocytosis, the DOX-loaded hybrid nanostructures usually enter the early endosomes, then enter the late endosomes/lysosomes, and finally fused with lysosomes. Furthermore, both endosomes (pH 5.0–6.0) and lysosomes (pH 4.5–5.0) have an acidic microenvironment. In our study, the pH-responsive Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were more likely to decompose and release drugs in acidic environments, thus effectively reducing side effects, prolonging half-life of drugs, and providing more effective and lasting treatment. Due to the main target of DOX being cell nucleus, DOX can bind to double-stranded DNA to form DNA adducts, inhibit the activity of topoisomerase and induce cell death (apoptosis) [63]. As a result, the released DOX molecules were located in the cell nucleus. Therefore, the obtained Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures may have good potential for cancer chemotherapy.

As discussed above, the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures exhibit high relaxivity in aqueous solution and can be uptaken efficiently by A549 cells. The intracellular MRI of the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were then investigated by incubation of A549 cells with the hybrid nanostructures with different Fe₃ O₄ concentraties. Figure 8 presents the T ₂ -weighted MRI of A549 cells. With the increase of Fe₃ O₄ concentration in Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, the cellular MRI signal increased gradually (Fig. 8). Currently, cell labeling is mainly accomplished by the endocytosis of Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures as T ₂ -negative contrast agents. These results demonstrate that the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures can be internalized into cells and exhibit good T ₂ -weighted MRI contrast for cellular imaging. Our current research is limited to the cellular level. Future in vivo studies would be necessary for the practical application of the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures. To specially target a specific site in animal studies, small ligands such as lactic acid and folic acid (both containing carboxyl groups) would require to be used to conjugate amino-terminated Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures.

T ₂ -weighted cellular MR images of A549 cells incubated with the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at a Fe concentration of 2.2, 4.5, 9.0, and 13.5 μM, respectively