Synthese en in vitro onderzoek van een dual-mode probe gericht op integrine αvβ3

Abstract

Kwaadaardige tumoren vormen een ernstige ziekte die het menselijk leven bedreigt, en vroege diagnose en voorspelling van metastase zijn van cruciaal belang voor de keuze van het behandelplan en de timing van de behandeling. Integrin α_v β₃ , dat brede aandacht heeft gekregen als een moleculaire marker van de tumorneovasculatuur, is een belangrijk doelwit voor het volgen van tumorigenese en progressie in onderzoek naar moleculaire beeldvorming. Deze studie rapporteert een magnetische resonantie (MR)/fluorescentie dual-mode moleculaire sonde, cRGD-Gd-Cy5.5, die gericht is op de integrine α_v β₃ receptor en gebruikt liposomen als drager. De verkregen nanosonde had een grootte van 60,08 ± 0,45 nm, met een goede dispersie in water, een uniforme verdeling van afmetingen, gewenste stabiliteit en een hoge relaxiviteit. Het r1-ontspanningspercentage was 10.515 mM⁻¹ s⁻¹ , veel hoger dan die van andere Gd-chelaten in klinisch gebruik. De sonde vertoonde geen cytotoxiciteit bij de geteste concentraties in vitro, en het vermogen om zich te richten op A549-cellen en SUNE-1-5-8F-cellen werd voorlopig geëvalueerd door middel van in vitro fluorescentiebeeldvorming en MR-beeldvorming. De resultaten toonden aan dat de cRGD-Gd-Cy5.5 nanoprobe goede eigenschappen had, met gewenste stabiliteit en bioveiligheid, een hoge T1-relaxatiesnelheid en sterke targeting en binding aan tumoren met hoge expressie van integrine α_v β₃ . Daarom is cRGD-Gd-Cy5.5 een veelbelovend middel voor de visuele monitoring van tumormetastase.

Achtergrond

Infiltratie van kwaadaardige tumoren en metastasen op afstand vormen de belangrijkste oorzaak van het falen van de behandeling. Het proces van kwaadaardige tumormetastase vereist de vernietiging van de extracellulaire matrix (ECM) en de tumorneovasculatuur [1]. Daarom is in vitro niet-invasieve monitoring van moleculaire markers gerelateerd aan tumorneovascularisatie vooral cruciaal bij het voorspellen van tumormetastase en vroege diagnose. Integrin α_v β₃ , een veel bestudeerde moleculaire marker van de tumor neovasculatuur, heeft uitgebreide aandacht gekregen. Dit integrine is nauw verbonden met de adhesie, proliferatie en differentiatie van vasculaire endotheelcellen tijdens tumorneovascularisatie [2].

De vooruitgang in moleculaire beeldvorming heeft niet-invasieve monitoring van tumorgroei op moleculair niveau mogelijk gemaakt. Moleculaire beeldvormingsstudies van de beoogde doelmoleculen moeten twee basiselementen hebben:(1) geschikte targetingcomponenten en (2) signaalcomponenten die kunnen worden gedetecteerd door beeldvormingstechnieken. Integrin α_v β₃ , dat specifiek de arginine-glycine-aspartaat (Arg-Gly-Asp, RGD) -sequentie in ECM-eiwitten herkent en eraan bindt, wordt geactiveerd door conformationele veranderingen. De RGD-sequentie is dus op grote schaal gebruikt bij de synthese van tracers voor tumortargeting als een belangrijke targetingcomponent [3]. Magnetische resonantie (MR) beeldvorming is een van de krachtigste diagnostische hulpmiddelen voor moleculaire beeldvorming geworden voor het volgen van tumoren vanwege de niet-ioniserende straling, hoge resolutie van zacht weefsel en niet-beperkende penetratiediepte [4, 5]. Statistische analyse gaf aan dat bij ongeveer 50% van de MR-onderzoeken contrastmiddelen nodig zijn om de kwaliteit van de beelden te verbeteren [6, 7]. Near-infrared fluorescent imaging is een soort optische beeldvorming en de golflengte van nabij-infrarood licht, het vroegst ontdekte niet-zichtbare licht, varieert van 700 tot 900 nm. Nabij-infrarood fluorescentie beeldvormingstechnieken stellen chirurgen in staat om tumoren te visualiseren, af te bakenen en te verwijderen tijdens operaties [8, 9]. Met veranderingen in het menselijke ziektespectrum voldoet single-mode moleculaire beeldvorming echter niet aan de vereisten van nauwkeurige diagnose vanwege de hoge fout-positieve en fout-negatieve percentages. Zo zullen moleculaire beeldvormingstechnieken gebaseerd op de integratie van meerdere modi een nieuwe trend zijn in de ontwikkeling van moleculaire beeldvorming [10].

In deze studie hebben we een dual-mode moleculaire sonde cRGD-Gd-Cy5.5 voorbereid die kan worden gebruikt bij de histologische en functionele beeldvorming van tumoren (schema 1). Vergeleken met de moleculaire probes met Fe₃ O₄ als de signaaleenheid [11, 12], was cRGD-Gd-Cy5.5 uitstekend met (a) hoog paramagnetisme (zeven ongepaarde elektronen rond Gd^{3 +} ); (b) vermogen om met de drager te binden om een stabiel chelatiemiddel te vormen, zoals Magnevist dat veel wordt gebruikt in de kliniek; (c) hoge ruimteresolutie en hogere beelddefinitie dan negatieve contrastmiddelen [13, 14]. We selecteerden liposomen als het dragermolecuul dat het MR-contrastmiddel koppelt aan het fluorescentiecontrastmiddel. Gemeenschappelijke fosfolipiden hebben twee lange hydrofobe koolwaterstofketens en een hydrofiele groep in hun moleculaire structuren. Wanneer ze aan water of bufferoplossing worden toegevoegd, nemen geschikte hoeveelheden fosfolipidemoleculen rangschikkingen aan in specifieke richtingen, met hun hydrofiele groepen aan beide kanten naar de waterfase gericht en de hydrofobe koolwaterstofketens naar elkaar gericht om de dubbellaag in liposomen te vormen. RGD-gerichte cyclische peptiden en Cy5.5-fluorescerende moleculen werden geconjugeerd aan het liposoomoppervlak via een geïntroduceerd polyethyleenglycol (PEG) fosfolipide met aminogroepen, en ten slotte werden Gd-ionen ingekapseld in de liposomen om de constructie van de gerichte multimodale moleculaire sonde te bereiken met gewenste kenmerken in termen van structuur, samenstelling, grootte, vorm, stabiliteit en MR-relaxiviteit. De cytocompatibiliteit ervan werd beoordeeld door middel van een cytotoxiciteitstest en observatie van celmorfologie. Ten slotte werd het potentieel van cRGD-Gd-Cy5.5 voor T1-gewogen MR-beeldvorming en fluorescentiebeeldvorming van in vitro kankercellen beoordeeld.

De synthetische route van de met Gd gedoteerde liposomen, gevolgd door RGD-conjugatie en Cy5.5 voor biotoepassingen, voor zeer gevoelige detectie van integrine α_v β₃

Resultaten

Karakterisering van de cRGD-Gd-Cy5.5 Nanoprobe

De cRGD-Gd-Cy5.5-oplossing was een lichtroze heldere vloeistof, zonder duidelijke neerslag na een tijdje staan, wat wijst op een goede dispersie. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) onthulde het uiterlijk van het cRGD-Gd-Cy5.5 liposomale complex als een bolvorm van uniforme grootte, zonder korrelaggregatie of schade na negatieve kleuring met 2% natriumfosfowolframaat, zoals weergegeven in Fig. 1a. De deeltjesgrootteverdeling was consistent, variërend van 50 tot 80 nm, met een gemiddelde deeltjesgrootte van 60,08 ± 0,45 nm. De gehydrateerde deeltjesgrootte van het cRGD-Gd-Cy5.5 liposomale complex gemeten via dynamische lichtverstrooiing (DLS) was 124,2 ± 0,215 nm (figuur 1b). Zoals te zien is in de figuur, vertoonden de nanodeeltjes een smalle grootteverdeling in water en een goede dispersie. De oppervlakte-zeta-potentiaal was 39,5 ±-1,65 mV, wat een positieve oppervlaktelading vertoont, wat consistent is met de aanwezigheid van aminogroepen op het oppervlak (Fig. 1c).

Karakteriseringsgegevens van CRGD-GD-CY5.5 nanosonde. een TEM-beelden met lage vergroting van cRGD-Gd-Cy5.5. b De deeltjesgrootte werd gedetecteerd door grootteanalyse en de gemiddelde grootte van de sonde was 124,2 nm. c Zeta-potentiaal is ongeveer 39,5 mV, het schijnbare oppervlak is elektropositief

Multifunctionele microplaattest toonde aan dat de blanco liposomen geen UV-absorptiegebied hebben en liposomen gekoppeld aan fluorescerend Cy5.5 in excitatielicht van 600 nm hebben een duidelijke absorptiepiek bij 685 nm (figuur 1a), consistent met de emissiegolflengte van fluorescerend Cy5.5 . Fluorescerende moleculen toonden aan dat Cy5.5 succesvol was gekoppeld. De resultaten van het fluorescentiebeeldvormingssysteem voor kleine dieren toonden aan dat onder het excitatielicht van 600 nm de liposoom-geconjugeerde fluorescerende Cy5.5 duidelijke rode fluorescentie had, terwijl het blanco liposoom geen fluorescentiesignaal had (Fig. 2b).

Fluorescentie-eigenschappen van cRGD-Gd-Cy5.5 nanosonde. een Het liposoom gelabeld met fluorescentie Cy5.5 werd gedetecteerd door een multifunctionele enzymanalysator en er was een zichtbare emissiepiek bij 670 nm bij excitatielicht van 600 nm. b Onder excitatielicht van 600 nm heeft de liposoom-gekoppelde fluorescerende Cy5.5 (links) een duidelijke luminescentie, terwijl de lege liposoom (rechts) geen fluorescentiebeeldvorming heeft.

MR-relaxometrie van de cRGD-Gd-Cy5.5 nanosonde

De r1-relaxatiesnelheid is een belangrijke parameter voor het evalueren van de beeldvormingsprestaties van T1 MR-contrastmiddelen. Daarom hebben we de T1-relaxatietijd van de probe cRGD-Gd-Cy5.5 met verschillende Gd-concentraties gemeten. Zoals weergegeven in figuur 3b, was de r1-relaxatiesnelheid van cRGD-Gd-Cy5.5 10.515 mM⁻¹ s⁻¹ na lineaire aanpassing, veel hoger dan die van het klinische product Magnevist (4,56 mM⁻¹ s⁻¹ ). De hoge r1-relaxatiesnelheid van cRGD-Gd-Cy5.5 kan het resultaat zijn van de speciale ruimtelijke structuur van de dragerliposomen en het biologische signaalversterkingseffect van de liposomen. Naarmate de Gd-concentratie toenam, verhoogde cRGD-Gd-Cy5.5 de MR-signaalintensiteit (figuur 3a). Deze resultaten toonden aan dat de synthetische cRGD-Gd-Cy5.5 voldoet aan de behoefte aan een hoog beeldcontrast bij MR-beeldvorming.

De relaxatie-eigenschappen van cRGD-Gd-Cy5.5 nanosondes. een T1- gewogen afbeeldingen (Siemens, Verio,3.0T, MOLLI, sequentie:TR = 5.8 ms, TE = 3.66 ms, TI = 16-3200 ms) van deze deeltjes in verschillende concentraties (Gd). b De passende curven van Gd-concentratie en relaxatietijd; de r1-waarde van cRGD-Gd-Cy5.5 was 10.515 mM⁻¹ s⁻¹

Cytotoxiciteitsonderzoek van de cRGD-Gd-Cy5.5 Nanoprobe

De in vitro cytotoxiciteit van cRGD-Gd-Cy5.5 werd beoordeeld door middel van de CCK-8-assay, in vergelijking met de levensvatbaarheid van cellen in de onbehandelde groep (100%). Alle cellen vertoonden een levensvatbaarheid van meer dan 70% binnen het bereik van geteste Gd-concentraties (50-400 μM) (Fig. 4), wat aangeeft dat deze moleculaire sonde een goede celcompatibiliteit heeft. Met name de levensvatbaarheid van de cellen was nog steeds hoger dan 70%, zelfs na 24 uur incubatie met 400 μM Gd, een concentratie die aanzienlijk hoger is dan de doseringen die in vitro en in vivo werden gebruikt.

Cytotoxiciteitstest. Cellevensvatbaarheid van humane longadenocarcinoom (A549), nasofaryngeale carcinoomcellijn (SUNE-1-5-8F), humane navelstrengendotheelcel (HUVEC) en normale borstcellijn (MCF10A) geïncubeerd met verschillende concentraties cRGD-Gd- Cy5.5 gedurende 24 uur

Immunofluorescentiekleuring en flowcytometrietest van integrine αvβ3

De resultaten van immunofluorescentie toonden aan dat de integrine avβ3-expressie in A549- en 5-8F-cellen gelokaliseerd was in het celmembraan en cytoplasma. De integrine van A549-cellen bevond zich voornamelijk in het celmembraan en de fluorescentie-intensiteit op het oppervlak van A549-cellen was hoger dan die van SUNE-1-5-8F-cellen. De fluorescentie-intensiteit van MCF-10A-cellen was extreem zwak, wat aantoont dat bijna geen integrine avβ3 tot expressie werd gebracht op het oppervlak van borstepitheelcellen (figuur 5a). De resultaten van de flowcytometrie worden getoond in figuur 5c. De integrine-vβ3-expressieniveaus zijn als volgt gerangschikt:A549 (89,07%)> SUNE-1-5-8F (63,84%)> MCF-10A (1,56%), wat aangeeft dat de avβ3-niveaus in kankercellen significant hoger waren dan die in normale borstklieren. kliercellen.

Confocale laser scanning microscopie (CLSM) beelden van A549, SUNE-1-5-8F en MCF-10A cellen. een Cellulaire immunofluorescentiebeelden van integrine avβ3. A549- en SUNE-1-5-8F-cellijn tot expressie gebracht in het celmembraan, MCF-10A-cellen bijna geen expressie van integrine α_v β₃ . b A549-, SUNE-1-5-8F- en MCF10A-cellen geïncubeerd met cRGD-Gd-Cy5.5 bij 200 μg mL⁻¹ concentratie bij 37 ° C gedurende 1 uur. De hoeveelheid sondes gebonden aan cellen komt overeen met de resultaten van cellulaire immunofluorescentie. c Flowcytometrietest voor het detecteren van de integrine-vβ3-expressies in de A549-, SUNE-1-5-8F- en MCF-10A-cellen

Cellulaire opname van cRGD-Gd-Cy5.5

Op basis van de resultaten van de immunofluorescentiekleuring werden A549- en 5-8F-cellen geïncubeerd met cRGD-Gd-Cy5.5 gebruikt als de experimentele groepen, terwijl de MCF-10A-cellen geïncubeerd met cRGD-Gd-Cy5.5 werden gebruikt als de controlegroep. Na incubatie met cRGD-Gd-Cy5.5 werden rode fluorescentiesignalen waargenomen in het membraan van zowel A549- als 5-8F-cellen, met de signaalintensiteit in A549-cellen hoger dan die in SUNE-1-5-8F-cellen (Fig. 5b). Dit resultaat is consistent met de expressie van integrine avβ3 gedetecteerd door immunofluorescentiekleuring. Er werd bijna geen rood fluorescentiesignaal gevonden in het membraan van de MCF-10A-cellen in de controlegroep.

In vitro MR-beeldvorming en fluorescentiebeeldvorming

Op basis van zijn hoge r1-relaxatiesnelheid en goede celcompatibiliteit, werd cRGD-Gd-Cy5.5 gebruikt als een positief contrastmiddel voor MR-beeldvorming van kankercellen in vitro. Zoals getoond in Fig. 6a, b, werd de kleur van de T1-gewogen MR-beelden geleidelijk helderder, wat aangeeft dat de MR-signaalintensiteit van A549-cellen behandeld met cRGD-Gd-Cy5.5 toenam met hogere Gd-concentraties. Het verschil in de T1-relaxatietijd tussen de twee groepen was statistisch significant, zoals aangegeven door de t test voor twee onafhankelijke steekproeven (p < 0.05). Deze gegevens suggereren dat synthetische cRGD-Gd-Cy5.5 het potentieel heeft voor gebruik als een positief contrastmiddel bij in vitro MR-beeldvorming van kankercellen. Evenzo vertoonde een fluorescentiesysteem voor kleine dieren een overeenkomstige toename in fluorescentie-intensiteit naarmate de probeconcentratie toenam (figuur 6c). Uit het beeldsignaal en de specifieke gegevens bleek het beeldvormende effect van de doelgroep (cRGD-Gd-Cy5.5) beter dan dat van de niet-targetinggroep (Gd-Cy5.5).

Cel magnetische resonantie en fluorescentie beeldvorming. een De cellen werden gedurende 2 uur geïncubeerd met A549-cellen volgens de Gd-concentraties:0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,04 en 0,08 (mM). De Gd-Cy5.5 werd gebruikt als controlegroep. b T1 relaxatietijd van het corresponderende magnetische resonantiebeeld. c Beelden van live-beeldvormingssysteem voor kleine dieren

In vivo MR en fluorescentiebeeldvorming

De vóór injectie van contrastmiddelen verkregen MRI-beelden toonden geen significante signaalverschillen tussen tumoren en andere perifere organen/weefsels. 5 min na injectie met CRGD-Gd-Cy5.5 begon de signaalintensiteit op de tumorplaatsen te worden versterkt, maar stabiele hyperintensiteit werd gehandhaafd sinds 6 uur na de injectie. In de testgroep werd sinds 30 minuten een geïntensiveerd tumorparenchym waargenomen en de versterking werd na 2 uur versterkt (figuur 7a). In de receptor-geblokkeerde groep werd echter slechts een zachte versterking gevonden aan de randen van tumoren, en de versterkingsgraad was na 2 uur verzwakt en was al verdwenen (figuur 7a). Op de fluorescentiebeelden nam de fluorescentie-intensiteit in de beoogde groep geleidelijk toe sinds de 30e minuut, maar was nog steeds hoog op het zesde uur (Fig. 7b), wat aangeeft dat de bloedcirculatie was verlengd en CRGD-Gd-Cy5.5 efficiënt geconcentreerd in tumoren. In de receptor-geblokkeerde groep werd op geen van de geteste tijdstippen een specifieke probeconcentratie waargenomen. Fluorescentie met hoge intensiteit aan de bilaterale nier werd waargenomen op het zesde uur (figuur 7b). We leiden af dat de metabole route van CRGD-Gd-Cy5.5 de klaring door het niersysteem kan zijn.

MR en fluorescentiebeeldvorming van naakte muizen nasofaryngeale carcinoom subcutane xenografting tumormodellen. een Naakte muizen werden verdoofd en afgebeeld met een 3,0-T MRI-scanner bij pre-injectie en op 0,5, 2 en 6 uur na injectie. b Naakte muizen werden 0,5, 2 en 6 uur na de injectie verdoofd en afgebeeld met een fluorescentiebeeldvormingssysteem

Discussie

Integrine avβ3 komt in hoge mate tot expressie, niet alleen in de endotheelcellen van de tumorneovasculatuur, maar ook op het oppervlak van een verscheidenheid aan tumorcellen, zoals kwaadaardig melanoom, kwaadaardig glioom, prostaatkanker, longkanker en borstkankercellen [15], terwijl avβ3 wordt niet tot expressie gebracht of in lage niveaus tot expressie gebracht in reguliere epitheelcellen en rijpe vasculaire endotheelcellen. Op basis van de bovenstaande eigenschappen is integrine avβ3 een ideaal doelwit geworden voor in vivo monitoring van tumormetastase [16]. De huidige methoden voor het meten van integrine-αvβ3-expressieniveaus hebben echter nog steeds problemen met niet-invasiviteit, herhaalbaarheid en tijdigheid van beeldvorming, die nog moeten worden opgelost. Met het oog op de bovenstaande objectieve problemen werd in deze studie een dual-mode moleculaire probe gesynthetiseerd voor realtime, dynamische monitoring van integrine-vβ3-expressie, waarmee indirect het doel werd bereikt om tumormetastase te voorspellen en te volgen.

Contrastmiddelen kunnen worden onderverdeeld in twee typen volgens het mechanisme van MR-beeldvorming:Gd-verbindingen (T1-positief contrastmiddel) en paramagnetische ijzeroxide-nanodeeltjes (T2-negatief contrastmiddel). Vergeleken met andere contrastmiddelen hebben Gd-verbindingen ongeëvenaarde voordelen in de klinische praktijk [17]. Het Gd-ion, een superparamagnetisch materiaal, levert een signaal met hoge intensiteit in T1-gewogen beelden. Gd kan zich ook binden aan een verscheidenheid aan stoffen om stabiele complexen te vormen met een hoge ruimtelijke resolutie en een hoge signaal-ruisverhouding. Elk type contrastmiddel heeft echter zijn eigen beperkingen (namelijk de korte bloedcirculatietijd van T1-contrastmiddelen en de magnetische gevoeligheidsartefacten van T2-contrastmiddelen) [18,19,20,21]. Traditionele Gd-verbindingen hebben de volgende beperkingen. (1) Traditionele Gd-chelaten hebben geen doelgericht effect. (2) De signaalintensiteit van Gd-chelaatcontrastmiddelen is lager dan die van ultrakleine superparamagnetische ijzeroxidedeeltjes (USPIO's) bij dezelfde concentratie. Om de bovenstaande problemen op te lossen, worden Gd-ionen gekoppeld aan macromoleculaire structuren (zoals liposomen, dendritische moleculen en dextran) om het T1-relaxatie-effect [22] te versterken, en het complex wordt vervolgens gekoppeld aan het ligand van tumordoelen om moleculaire sondes te bereiden en tumorgerichte beeldvorming te bereiken [23]. In deze studie werden liposomen geselecteerd als het dragermolecuul dat MR-contrastmiddelen koppelt aan fluorescerende contrastmiddelen. De speciale ruimtelijke structuur van liposomen heeft een biologisch signaalversterkingseffect en verbetert effectief de concentratie van Gd-ionen in lokale weefsels, waardoor de MR-signaalintensiteit wordt verbeterd. Zhou et al. [24] gebruikte β-cyclodextrine-gekoppelde polyedrische oligomere silsesquioxaan (POSS) nanodeeltjes als de drager om RGD aan Gd-verbindingen te koppelen om met succes een moleculaire sonde, cRGD-POSS-βCD-(DOTA-Gd), te verkrijgen met een T1-relaxatiesnelheid van 9,50 mM⁻¹ S⁻¹ . Het liposoom-cRGD-Gd-Cy5-complex dat in dit onderzoek werd verkregen, bleek een T1-relaxatiesnelheid te hebben van 10,515 mM⁻¹ S⁻¹ , wat meer dan twee keer de T1-relaxatiesnelheid is van het Gd-middel dat momenteel in klinisch gebruik wordt gebruikt (Magnevist), en dit complex vertoonde ook uitstekende MR-beeldvormingseigenschappen.

De nanosonde die door onze groep is bereid, heeft een uniforme grootte, een regelmatig uiterlijk en een goede dispergeerbaarheid. De zeta-potentiaal weerspiegelt de stabiliteit van de moleculaire probe, en een hogere positieve of negatieve waarde van de zeta-potentiaal wordt geassocieerd met een stabieler systeem en minder kans op aggregatie. Over het algemeen worden moleculen met zeta-potentialen hoger dan +-30 mV of lager dan -30 mV geacht een goede stabiliteit te hebben. De zeta-potentiaal op het oppervlak van het sondedeeltje dat in deze studie werd verkregen, was + 39,5 ± 1,65 mV, wat iets lager is dan + 30 mV. Desalniettemin werd er geen aggregatie waargenomen onder TEM.

Gd-middelen zijn het meest gebruikte MR-contrastmiddel in de huidige klinische praktijk en hun bioveiligheid kan niet worden genegeerd. Guo et al. [25] ontdekte dat een Gd-complex gekoppeld aan dendritisch hyaluronzuur een zeer veilig en effectief microdeeltje was als MR-contrastmiddel, met een hoge gevoeligheid en een lage resterende aanwezigheid in het menselijk lichaam. Door de studie van de in vitro cytotoxiciteit van de geconstrueerde moleculaire sonde, werd aangetoond dat deze moleculaire sonde een lage cytotoxiciteit en hoge bioveiligheid heeft voor zowel tumorcellen als niet-tumorcellen (epitheelcellen en vasculaire endotheelcellen). Wij zijn van mening dat liposomen een goede biocompatibiliteit hebben, en de lage biotoxiciteit kan een voordeel zijn van het liposoom dat de Gd-ionen inkapselt.

Op basis van eerdere studies [26,27,28], selecteerde onze groep de A549-longadenocarcinoomcellijn met hoge expressie van integrine avβ3 voor gebruik in de experimentele groep, met de innovatieve toevoeging van de SUNE-1-5-8F nasofaryngeale carcinoomcel lijn in de in vitro cel-targeting-experimenten; borstepitheelcellen met bijna geen expressie van integrine avβ3 werden opgenomen als de negatieve controlegroep. De moleculaire sonde bond goed aan het celmembraan van de A549-longadenocarcinoomcellen en de SUNE-1-5-8F nasofaryngeale carcinoomcellen, maar bond niet aan MCF-10A-cellen, wat aangeeft dat de sonde een uitstekend moleculaire targetingvermogen heeft, wat werd bevestigd door de resultaten van de immunofluorescentietest. MR-beeldvormingsresultaten bevestigden verder de targeting-eigenschap van de liposomale cRGD-Gd-Cy5.5 moleculaire sonde in MR, met signalen met een hogere intensiteit dan die van niet-gericht contrastmiddel (Gd-Cy5.5) in tumorcellen. In-vivo-experimenten bevestigen dat sondes stabiel kunnen blijven in het serum en zich gedurende ten minste 6 uur aanhoudend op de tumorplaatsen kunnen richten. De resultaten van de in vitro studies zorgen voor daaropvolgende in vivo studies van de moleculaire probe in een gemetastaseerd model van nasofarynxcarcinoom bij naakte muizen.

Conclusies

Samenvattend is de voorbereidingsmethode voor de dual-mode sonde cRGD-Gd-Cy5.5 gericht op integrine vβ3 haalbaar, en deze sonde heeft de gewenste stabiliteit en bioveiligheid en een hoog T1-relaxatiepercentage. De sonde vertoonde een sterk richtend effect op de cellen met een hoge integrine-vβ3-expressie, wat een solide basis legde voor niet-invasieve, efficiënte en realtime dynamische monitoring van tumormetastase op anatomisch niveau en moleculair metabolisch niveau via MR/fluorescentie moleculaire beeldvorming in vivo.

Methoden

Synthese van cRGD-Gd-Cy5.5

Aan 20 ml chloroform werden 70 mg lecithine, 20 mg cholesterol en 210 mg DSPE-PEG2000-NH toegevoegd en het mengsel werd in een ultrasone reiniger geplaatst om de stoffen volledig op te lossen (zoals aangegeven door een heldere oplossing zonder korrelige stoffen). De oplossing werd vervolgens in een peervormige kolf geplaatst voor roterende verdamping in een waterbad van 60 ° C totdat een honingraatachtige film (geen vloeistofresidu) was gevormd. Gd-trichloridehexahydraat (10 mg) werd nauwkeurig gewogen en opgelost in carbonaatbuffer bij pH 8,5 om een heldere oplossing te verkrijgen, die vervolgens werd gemengd met de bovenstaande honingraatachtige film voor hydratatie bij 50 ° C gedurende 1 uur; deze stap werd gevolgd door dispersie en verfijning door een ultrasone sonde in een ultrasone vloeistofprocessor (VCX 750, Sonics, VS). Ten slotte werd het mengsel verzameld en door een filter van 0,22 m geleid en onderworpen aan ultrafiltratie met een ultrafiltratiebuis van 10 kD om vrij Gd-trichloride te verwijderen en liposomen te verkrijgen die Gd-trichloride bevatten, die vervolgens bij 4 °C werden bewaard.

Het cyclische RGD-peptide werd vervolgens gekoppeld aan het fluorescerende Cy5.5-molecuul. RGD cyclisch peptide (5 mg) werd opgelost in 1 ml verdunde zoutzuurbuffer bij pH 5,0 en 1 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride (EDC) en 0,5 mg N -hydroxysuccinimide (NHS) werden toegevoegd en vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geactiveerd in een oscillator bij constante temperatuur. Het geactiveerde RGD-cyclische peptidemolecuul werd vervolgens gemengd met 100 μg van het Cy5.5-fluorescerende molecuul en het liposoom, en de pH werd gemeten als 8,4 met behulp van precisie-pH-testpapier. Het mengsel werd vervolgens 4 uur bij kamertemperatuur in een schudder geïncubeerd; deze stap werd gevolgd door de verwijdering van niet-gereageerd RGD cyclisch peptide en fluorescerend Cy5.5-molecuul door het gebruik van een ultrafiltratiebuis van 10 kD.

Karakterisering van nanodeeltjes

De deeltjesgrootte van de nanodeeltjes werd bepaald door TEM (GEOL Tokyo, Japan). Een kleine hoeveelheid liposoom-cRGD-Gd-Cy5.5-complex werd toegevoegd aan ultrapuur water (pH =-6,0) voor verdunning in een oplossing van 1 mg/ml. Een druppel van het monster werd op een gecoat koperen rooster geplaatst met behulp van een steriele transferpipet en 2% natriumfosfowolframaat werd na een paar minuten druppelsgewijs toegevoegd om te blijven zitten. Overmatige negatieve kleuroplossing werd na 1-2 minuten opgezogen. Het koperen rooster werd vervolgens gedroogd en ter observatie onder een 80 kV transmissie-elektronenmicroscoop geplaatst. Ongeveer 40 tot 50 nanodeeltjes werden willekeurig geselecteerd om hun morfologie en deeltjesgrootte te observeren, en afbeeldingen van 50 nm en 100 nm schaal werden opgeslagen. De deeltjesgrootte werd gemeten met behulp van de NanoMeasure-software en het gemiddelde werd berekend uit drie herhaalde metingen.

Een deeltjesgrootte-analysator (Malvern, VK) werd gebruikt om de hydrodynamische grootte en zeta-potentiaal van nanodeeltjes te meten. Een druppel liposoom-cRGD-Gd-Cy5.5-complexoplossing werd verdund met ultrapuur water en vervolgens overgebracht naar een Eppendorf-buis, die gedurende 5 minuten in een ultrasone reiniger werd geplaatst om de deeltjes gelijkmatig te verspreiden. De gedispergeerde deeltjes werden geëvalueerd door DLS in de nanodeeltjesgrootte-analysator om de deeltjesgrootte en zeta-potentiaal te bepalen.

De optische eigenschappen van het liposomale cRGD-Gd-Cy5.5-complex werden gekarakteriseerd met behulp van een multifunctionele microplaatlezer (BioTek, VS). Twee microliter liposoomoplossing en liposoom-cRGD-Gd-Cy5.5 werden toegevoegd aan 998 L fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)-buffer en goed gemengd voordat ze aan een kwartscuvet werden toegevoegd; de ultraviolette absorptie bij 400-800 nm werd vervolgens verkregen via een multifunctionele microplaatlezer. De liposoom-cRGD-Gd-Cy5.5-complex (1,5 ml) oplossing werd overgebracht naar een Eppendorf-buisje en dezelfde hoeveelheid lege liposoomoplossing werd gebruikt als een blanco controle. Fluorescentiebeeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een fluorescentiebeeldvormingssysteem voor kleine dieren.

De modificatie van oppervlakte-aminogroepen op liposomen werd bevestigd met behulp van FT-IR-spectroscopie (Nicolet-5700, VS). Het UV-vis-absorptiespectrum werd verkregen (UV 2550, Shimadzu, Japan); een concentratie van 0,1 mg/ml liposomaal cRGD-Gd-Cy5.5 werd gebruikt voor de meting.

Meting van het ontspanningspercentage

Het cRGD-gemodificeerde Gd-geladen liposomale fluorescentieprobemonster werd verdund met gedeïoniseerd water om de volgende Gd-concentraties te verkrijgen:0,18, 0,1275, 0,085, 0,0425 en 0,017 mM. Vijf milliliter van elk verdund monster werd in een flacon met een schroefdop geplaatst en de flacons werden vervolgens op een multifunctioneel buizenrek bevestigd in de volgorde van de concentratie. Het cRGD-gemodificeerde Gd-geladen liposomale fluorescerende sondemonster onderging MR-scanning door de hoofd- en nekspoelen om T1-gewogen beelden te verkrijgen voor de verschillende concentraties van de sonde. De scansequentie die werd gebruikt voor de T1-gewogen afbeeldingen was een aangepaste look-locker inversion recovery (MOLLI)-sequentie, waarbij de parameters als volgt waren ingesteld:herhalingstijd (TR) =-5,8 ms, echotijd (TE) =-3,66 ms, inversie hersteltijd (TI) = 16–3200 ms en scandikte = 5 mm. Nadat het scannen was voltooid, werd een pseudo-kleurenkaart verkregen. Een 0,3 cm² interessegebied werd afgebakend in de afbeelding van elk monster op de kaart en de bijbehorende T1-waarde werd afgelezen.

Celcultuur en cytotoxiciteitstest

A549 humane longadenocarcinoomcellen, SUNE-1-5-8F humane nasofaryngeale carcinoomcellen, humane navelstrengendotheelcellen (HUVEC's) en MCF-10A humane borstepitheelcellen werden verkregen van de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) . De cellen werden gekweekt in compleet 1640-medium (Euroclone-Lonza) dat 10% foetaal runderserum (Euroclone-Lonza), 100 eenheden/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine en 2 mM glutamine onder 5% CO2 bevatte. /sub> bij 37 °C.

De CCK-8-methode werd gebruikt om de cytotoxiciteit van de moleculaire sonde voor verschillende cellen te onderzoeken, waaronder normale epitheelcellen en tumorcellen. A549-cellen, 5-8F-cellen, HUVEC's en MCF-10A-cellen werden uitgezaaid in een plaat met 96 putjes met een dichtheid van 5 × 10³ cellen/putje en overnacht gekweekt. The adherent cells were then incubated with 100 μL of fresh 1640 medium containing cRGD-Gd-Cy5.5 of various Gd concentrations (0, 50, 100, 200, and 400 μM) for 24 h. Subsequently, the cells were washed three times with PBS and then incubated with 100 μL of Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) containing no fetal bovine serum (FBS). After 10% Cell Counting Kit-8 reagent (Dojindo, Japan) was added to each well, the sample was incubated for 10 h. The absorbance at 450 nm of each well was then measured using an ELISA microplate reader (Multiskan MK3, Thermo Scientific, Logan, UT). Cells treated with PBS only were employed as the control group. For each sample, five parallel wells were analyzed to obtain the mean and standard deviation.

Immunofluorescence Staining and Flow Cytometry Assay of Integrin αvβ3

A total of 20,000 A549, 5-8F, and MCF-10A cells each were seeded in confocal plates (Thermo Scientific) and cultured for approximately 24 h when the cells successfully grew on the slides. The cells were washed three times with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde (Boster) at room temperature for 30 min, and then washed three times (10 min each) in PBS. The cells were then incubated in 3% bovine serum albumin (PBST) for 30 min to block non-specific antibody binding and washed three times with PBS. The fixed cells were incubated with anti-integrin αvβ3 monoclonal antibody (1:500; Abcam, Cambridge, UK) at 4 °C overnight and then incubated with anti-mouse fluorescent secondary antibody (1:500) (Abcam) for 1 h. 4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1:1000; Sigma) was used to stain the nucleus. A laser confocal scanning microscope (Nikon A1, Tokyo, Japan) was used to detect the green fluorescence signal from integrin αvβ3 and the DAPI signal from nuclei.

The integrin αvβ3 expression levels in different cell lines were quantified using flow cytometry. In brief, three types of cells were collected:A549, SUNE-1-5-8F, and MCF-10A, which were washed in PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA). After being sealed with the PBS containing 5% BSA, the cells were cultivated in VNR-1 antibody (Abcam, Cambridge, MA, USA) at density 2 μg/1 × 10⁶ and 4 °C for 30 min. The secondary antibody was DyLight 488 goat anti-mouse IgG (H+L) (ab96879), diluted 1/500, and at 22 °C for 30 min. Quantitative assays were conducted on a flow cytometer (Gallios, Beckman Coulter, USA) at excitation wavelength 488 nm and emission wavelength 530 nm. Each time, at least 1 × 10⁵ cells (n = 3) were collected.

Binding Assay of the Molecular Probe to Integrin αvβ3

A549, SUNE-1-5-8F, and MCF-10A cells were inoculated into confocal plates. The cells were incubated at 37 °C for 1 h with the molecular probe of the same Gd concentration after the cells reached the logarithmic growth phase. The cells were then washed three times in PBS and placed under a laser confocal scanning microscope for observation.

In Vitro MR Imaging and Fluorescence Imaging of Tumor Cells

To verify the tumor cell-targeting ability of the cRGD-modified Gd-loaded liposomal fluorescent probe, the probe was incubated with A549 cells and then examined using MR imaging and a small animal fluorescence imaging system. A549 cells were seeded in six-well plates with 2 mL of 1640 medium containing 10% FBS and 1% penicillin–streptomycin in each well and then incubated at 37 °C and 5% CO₂ . In the experimental groups, cRGD-Gd-Cy5.5 was incubated with A549 cells for 2 h with Gd concentrations of 0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, and 0.08 mM. The cells of the control groups were incubated with the non-targeted gadolinium contrast agent (Gd-Cy5.5) for 2 h at the same Gd concentrations as the experimental groups. The cells were then washed with PBS, trypsinized, centrifuged, and finally placed in glass tubes containing 1 mL of PBS (with 0.5% agarose) for MR imaging. Specific imaging parameters were described above. A small animal live imaging system (IVIS Lumina XRMS Series III, MA, USA) was used for fluorescence imaging of the A549 cells.

In Vivo MR and Fluorescence Imaging

To validate whether CRGD-Gd-Cy5.5 had tumor targetability in vivo in animals, we conducted animal experiments following the Guide for Care and Use of Laboratory Animals, released by the Animals Ethics Committee of Laboratory Animal Center, Guangxi Medical University. We successfully established a Balb/c nude mice nasopharyngeal carcinoma subcutaneous xenografting tumor model for magnetic resonance/fluorescent scanning. A 3.0-T MRI scanner containing 40-mm-diameter mouse volume coils (Discovery 750, GE, Germany) was used for T1-weighted imaging, operated at field of view = 80 × 80 mm, repetition time = 742 ms, echo time = 69 ms, and layer thickness = 2.0 mm. The nude mice were divided into two groups (n = 3), including a test group and a receptor-blocked group. All mice were injected via tail vein with CRGD-Gd-Cy5.5 (0.05 mmol Gd/kg). Each mouse was scanned at four time points:before injection, 30 min, 2 h, and 6 h after injection. In the receptor-blocked group, 1 h before injection with CRGD-Gd-Cy5.5, each mouse was injected via the tail vein with free CRGD polypeptide (10 mg) and was MRI-scanned at the same four time points. The fluorescent images were photographed by a fluorescence imaging system (Bruker, USA). The grouping, drug injection, and scanning time points were all the same as described above. During the imaging, the mice (n = 3) were anesthetized using a gas mixture of oxygen and isoflurane. The nude mice were kept at heart rate 60–120/min and respiratory rate at 20–40/min. Finally, direct visual comparison of tumor images was conducted by two experienced radiologists.

Afkortingen

DLS:: Dynamische lichtverstrooiing
DMEM:: Dulbecco’s modified Eagle medium
ECM:: Extracellular matrix
EDC:: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride
FBS:: Containing no fetal bovine serum
HUVECs:: Human umbilical vein endothelial cells
MOLLI:: Modified look-locker inversion
MR:: Magnetic resonance
NHS:: N -Hydroxysuccinimide
PEG:: Polyethyleenglycol
RGD:: Arginine–glycine–aspartate
TE:: Echo time
TEM:: Transmissie-elektronenmicroscopie
TI:: Inversion recovery time
TR:: Repetition time
USPIOs:: Iron oxide particles

Adsorptie van overgangsmetalen op zwarte fosforen:een onderzoek naar de eerste beginselen Beoordeling van door gouden nanodeeltjes geremde cytochroom P450 3A4-activiteit en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de cellulaire toxiciteit ervan in humane hepatocellulaire carcin…

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal