Gelyofiliseerde hybride nanogestructureerde lipidedragers om de cellulaire opname van verapamil te verbeteren:statistische optimalisatie en in vitro evaluatie

Resultaten en discussie

Analyse met 2 ⁴ Volledig fabrieksontwerp

De waarden van de geselecteerde onafhankelijke variabelen, dwz homogenisatietijd (A), vaste lipideconcentratie (B), vloeibare lipideconcentratie (C) en oppervlakteactieve stofconcentratie (D) en de verkregen resultaten van de geselecteerde responsen, dwz PS, PDI , ZP en %EE worden weergegeven in tabel 2. Elke onafhankelijke variabele en hun interacties werden statistisch geëvalueerd met behulp van de ANOVA. De polynoomcoëfficiënt voor elke afhankelijke variabele werd gegenereerd door de Design-Expert®-software om het effect van elke onafhankelijke variabele te kwantificeren, zoals weergegeven in Vgl. 3, 4, 5 en 6. De vergelijkingen vertegenwoordigden alleen de significante factoren en hun interacties.

waar A is de homogenisatietijd (min), B is de vaste lipideconcentratie (mg), C is de vloeibare lipideconcentratie (mg), en D is de concentratie van oppervlakteactieve stoffen (mg). De positieve en negatieve tekens vóór elke factor of interactiefactoren in de vergelijkingen vertegenwoordigen respectievelijk een synergetisch of een antagonistisch effect. De responsoppervlaktegrafieken werden gegenereerd om het gelijktijdige effect van elke factor of factorinteracties op de responsparameters te observeren.

Effecten van variabelen op de gemiddelde deeltjesgrootte

Zoals getoond in Vgl. 3, factoren A , C , en D hebben antagonistische effecten op de deeltjesgrootte (PS). Geconcludeerd kan worden dat het verhogen van de homogenisatietijd (factor A ) wordt tegelijkertijd geassocieerd met een significante afname van de PS van NLC's (p < 0.05). Dit is waarschijnlijk te wijten aan de hoge afschuifkracht van homogenisatie die de lipidebolletjes efficiënt in kleinere deeltjes breekt. Evenzo, het verhogen van de vloeibare lipideconcentratie (C ) bleek tegelijkertijd de PS van de NLC's te verlagen. Dit kan worden toegeschreven aan het vermogen van oliezuur om de viscositeit van het systeem te verlagen, evenals de oppervlaktespanning in combinatie met Compritol 888 ATO®, waardoor een kleinere deeltjesgrootte van NLC's wordt geproduceerd. Het vermogen van het vloeibare lipide om de viscositeit van het systeem te verlagen wanneer het wordt gecombineerd met het vaste lipide werd ook gerapporteerd door Jenning et al. toen ze een SLN-dispersie maakten [5]. De auteurs merkten op dat het verhogen van de vloeibare lipideconcentratie van 0 tot 38% in de lipidematrixsamenstelling de deeltjesgrootte zou verminderen. Bovendien verhoogt het verhogen van de concentratie van oppervlakteactieve stoffen (D ) zou de PS verlagen, omdat een grotere hoeveelheid oppervlakteactieve stof die in het systeem aanwezig is, gemakkelijk de totale lipide-inhoud in de formulering zou emulgeren, en dus kleinere nanodeeltjes zou vormen.

Afbeelding 2 toont de significante (p < 0.05) effect van factoren (AC, BD en CD) interacties op de PS van de NLC. De positieve impact van factor (BD) en de negatieve impact van factoren (AC- en CD-interactie) toonden een significant effect op de NLC-deeltjesgrootte. De negatieve impact van factor (AC) toonde aan dat bij een langere homogenisatietijd en een hogere vloeibare lipideconcentratie een afname in PS veroorzaakte. De interactie tussen hogere concentraties vast lipide en oppervlakteactieve stof in de NLC-formulering (BD-interactie) toonde een significant positief effect op de deeltjesgrootte, wat resulteerde in grotere deeltjesgrootte. Daarentegen vertoonde de interactie tussen hogere concentraties van het vloeibare lipide en oppervlakteactieve stof (CD-interactie) een significant negatief effect op de deeltjesgrootte waar kleinere afmetingen werden geproduceerd.

Responsoppervlakplot die de significantie weergeeft (p < 0.05) effect van homogenisatietijd, vloeibare lipideconcentratie, oppervlakteactieve stofconcentratie en interactie tussen a AC, b BD, en c CD op de PS van HVD-NLC's. A homogenisatietijd, B vast lipide, C vloeibaar lipide, D oppervlakteactieve stof

Effecten van variabelen op PDI

Zoals geïllustreerd in Vgl. 4 is aangetoond dat oliezuur een negatief effect heeft op de PDI, wat betekent dat een toenemende oliezuurconcentratie de PDI-waarden zou verlagen en zou leiden tot een betere verdeling van de NLC-deeltjes. Een vergelijkbaar effect van oliezuur op NLC werd ook waargenomen door sommige onderzoeken [6]. Figuur 3 geeft de interactie weer tussen de homogenisatietijd en de vloeibare lipideconcentratie (AC-interactie). Deze interactie vertoonde een significant negatief effect op de PDI. Het betekent dat een langere homogenisatietijd en een hogere vloeistoflipideconcentratie zouden leiden tot een verlaging van de PDI-waarden. Bovendien toonde de interactie tussen de vloeibare lipide- en oppervlakteactieve stofconcentraties (CD-interactie) een synergetisch effect op de PDI-waarden. Het gelijktijdig verhogen van de concentraties van vloeibare lipiden en oppervlakteactieve stoffen zou dus de PDI-waarden verhogen en minder homogene HVD-NLCs-deeltjes produceren. Dit kan te wijten zijn aan een verdere toename van de concentratie van oppervlakteactieve stoffen boven de geoptimaliseerde waarde, wat een accumulatie van de oppervlakteactieve stof aan de buitenoppervlakken van nanodeeltjes kan veroorzaken, wat op zijn beurt de PDI-waarden verhoogt. Hetzelfde patroon werd ook waargenomen door Shamma et al., waarbij het verhogen van de concentratie van oppervlakteactieve stoffen een toename van de PDI-waarden van NLC's veroorzaakte [7].

Responsoppervlakplot met de significante (p < 0.05) effect van vloeibare lipideconcentratie en interacties tussen a AC en b CD op PDI van HVD-NLC's. A homogenisatietijd, C vloeibaar lipide, D oppervlakteactieve stof

Effecten van variabelen op ZP

De formuleringen van HVD-NLC's hadden de negatieve lading vanwege de ionisatie van glycerylbehenaat (een vetzuur in Compritol 888 ATO®), oliezuur en dextraansulfaatresidu. Gebaseerd op vgl. 5, had het verhogen van de hoeveelheid oliezuur een negatief effect op de nanodeeltjes, en resulterend in een toename van de negatieve lading van de nanodeeltjes, waardoor de ZP van HVD-NLC's toenam. Dit is mogelijk te wijten aan overmatige ionisatie van overvloedige carboxylgroepen in het oliezuur (vloeibare lipide) [8]. Bovendien vertoonde glycerylbehenaat (vast lipide) ook een negatief effect op de ZP-waarden, waarbij het verhogen van de concentratie de ZP van nanodeeltjes verhoogt. Dit komt door een hogere ionisatie van carbonzuur in het glycerylbehenaat, wat leidt tot hogere negatieve ladingen aan het buitenoppervlak van de nanodeeltjes.

De BD-interactie had een significant positief effect op de ZP van NLC's, terwijl CD-interactie een negatief effect vertoonde (Fig. 4). Het verhogen van de concentratie van vast lipide en het verlagen van de concentratie van oppervlakteactieve stof vermindert de negatieve lading van de nanodeeltjes en verlaagt de ZP-waarden. Waarschijnlijk zou in dit stadium een ​​lagere concentratie van oppervlakteactieve stoffen niet in staat zijn om de totale hoeveelheid vast lipide te ioniseren, wat zou leiden tot het verminderen van de negatieve ladingen op het oppervlak van nanodeeltjes, waardoor de ZP van HVD-NLC's wordt verminderd. Bovendien zou het gelijktijdig verhogen van de concentratie van vloeibaar lipide en oppervlakteactieve stof (CD-interactie) de ZP-waarde van HVD-NLC's aanzienlijk verhogen. Dit komt omdat er meer carbonzuur zou worden geïoniseerd in aanwezigheid van een hogere concentratie oppervlakteactieve stoffen in de formulering.

Responsoppervlakplot met de significante (p < 0.05) effect van vloeibare lipideconcentratie, oppervlakteactieve stofconcentratie en interacties tussen a BD en b CD op de ZP van HVD-NLC's. B vast lipide, C vloeibaar lipide, D oppervlakteactieve stof

Effecten van variabelen op %EE

Vergelijking 6 toonde aan dat het aanzienlijk verhogen van de homogenisatietijd (p <-0,05) verlaagt het %EE van het geneesmiddel. Een langere homogenisatietijd zou de medicijnmoleculen die aan het buitenoppervlak van de nanodeeltjes zijn bevestigd kunnen strippen of afpellen, wat resulteerde in een lager %EE van het medicijn in de HVD-NLC's. Daarentegen resulteerde het verhogen van de concentratie van oppervlakteactieve stoffen in een hoger %EE van het geneesmiddel in de HVD-NLC's. Dit zou te wijten kunnen zijn aan een hogere concentratie van oppervlakteactieve stoffen, waardoor de buitenste oppervlaktecoating van NLC's zou toenemen, waar een deel van het medicijn erin zou worden opgesloten. Zhuang et al. en Das et al. suggereerde dat een adequate concentratie van oppervlakteactieve stof essentieel is voor de solubilisatie van geneesmiddelmoleculen in het lipidenrooster en aan het buitenoppervlak van nanodeeltjes [9, 10].

Zoals weergegeven in figuur 5, had AD-interactie een significante (p <-0,05) negatieve impact, waarbij het verhogen van de homogenisatietijd en het verminderen van de hoeveelheid oppervlakteactieve stof het %EE van het geneesmiddel in de HVD-NLC's verlaagt. Daarentegen vertoonde de interactie tussen vaste lipide- en oppervlakteactieve stofconcentraties (BD-interactie) een positief effect op %EE van het geneesmiddel. Daarom zal het verhogen van de concentratie van vast lipide en oppervlakteactieve stof het %EE van het geneesmiddel in de HVD-NLC's verhogen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de hogere concentratie van oppervlakteactieve stoffen die de overtollige geneesmiddelmoleculen zou oplossen, en tegelijkertijd heeft een grotere hoeveelheid vaste lipiden in het systeem de overtollige geneesmiddelmoleculen geaccommodeerd, waardoor het %EE van het geneesmiddel in de HVD- NLC's.

Responsoppervlakplot met de significante (p < 0.05) effect van homogenisatietijd, vloeibare lipideconcentratie, oppervlakteactieve stofconcentratie en interacties tussen a AD en b BD op EE van verapamil in HVD-NLC's. A homogenisatietijd, B vast lipide, D oppervlakteactieve stof

Selectie van geoptimaliseerde HVD-NLC's met behulp van de wenselijkheidsfunctie

De HVD-NLC-formuleringen met de code nrs. VER-9, VER-11, VER-13 en VER-15 hadden hogere wenselijkheidswaarden van respectievelijk 0,863, 0,852, 0,811 en 0,840. Deze formuleringen werden geselecteerd voor verder onderzoek omdat de wenselijkheidswaarden dichter bij 1 lagen. De individuele en gecombineerde wenselijkheidsfunctie van alle responsen voor de geselecteerde formuleringen is weergegeven in figuur 6. De gemiddelde PS, PDI, ZP en %EE hiervan formuleringen lagen in het bereik van respectievelijk 173,46 ± 0,757 tot 190,3 ± 8,22, 0,451 ± 0,033 tot 0,501 ± 0,019, − 46,73 ± 1,13 tot − 49,16 ± 1,55 en 93,95 ± 4,10 tot 98,81 ± 1,01.

Bar graph displaying the individual and combined desirability of several responses on selected HVD-NLCs formulations. een VER-9, b VER-11, c VER-13, and d VER-15

Lyophilization Study

Lyophilization is one of the commonly used methods in the pharmaceutical field to change aqueous formulation into the dried form to prolong the physical and chemical stability of the nanoparticle during storage [11, 12]. However, the lyophilization step produces various stresses to the sample during the process. So, the need of cryoprotectant is essential to avoid the stress condition and protect the sample. Among the screened cryoprotectants, trehalose was found to be the most suitable one for protecting the HVD-NLCs formulations from aggregation after the lyophilization process. The HVD-NLCs formulations protected with trehalose had the smallest particle size and lowest PDI (Table 3). Trehalose offers many advantages over other cryoprotectants including less chemical interactions and exhibit higher glass transition temperature which may help to prolong the stability of nanoparticles. Furthermore, trehalose has been demonstrated as an efficient cryoprotectant for freeze drying of Compritol 888 ATO® (Glyceryl behenate) in the lipid-based nanoparticles [13, 14]. Thus, in the present study, trehalose was selected as cryoprotectant for the HVD-NLCs formulations.

In the next study, different ratios of trehalose were used in the HVD-NLCs formulations after or during the homogenization process. Table 4 shows the effects of different ratios of trehalose added into the formulations after homogenization on PS, PDI, and %EE.

The mean PS was found in the nano size range, while PDI was < 1 in all ratios of lipids to trehalose used in the study. However, the %EE of verapamil was decreased significantly with increasing the ratio of trehalose to lipids. The %EE of lipid:trehalose at the ratio of 1:1 was significantly higher than the lipid:trehalose ratio of> 1:1. Increasing the amount of trehalose beyond the lipid trehalose ratio of 1:1 enhanced the removal of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex. This is possibly due to the interaction between trehalose and dextran at the outer surface of nanoparticles, which promotes the displacement of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex and hence, lowers the %EE of drug in the HVD-NLCs. The interaction between trehalose and dextran takes place due to the formation of sugar-salt complex (trehalose-dextran complex), in that the trehalose (sugar) competes with cationic verapamil and forms complex with polyanionic dextran [15]. Miller et al. measured the viscosity and glass transition temperature of trehalose with boric acid and proposed the formation of chemical complex between trehalose and borate ion (B(OH)₄ ⁻ ) [15]. Therefore, based on the obtained results, the lipid to trehalose ratios of 1:1 and 1:2 were selected for the next study of trehalose addition during homogenization. Table 5 shows that the results of PS, PDI, and %EE were significantly better when trehalose were added during homogenization. This could be due to better mixing of trehalose in the HVD-NLCs formulation by the homogenization process. It is evident from the data that there was no significant difference in the %EE of lipid:trehalose ratios of 1:1 and 1:2. Therefore, formulation VER-9 and VER-11 at lipid:trehalose ratio of 1:1 was selected for further studies.

In Vitro Release of HVD-NLCs

The release profile of verapamil solution from the selected HVD-NLCs formulations (VER-9 and VER-11) in SGF and SIF are shown in Fig. 7. The release profile of verapamil from the VER-9 and VER-11 formulations was significantly longer than verapamil solution in both SGF and SIF media. Verapamil was loaded as an ionic complex with dextran sulfate in the HVD-NLCs formulation. This could be the reason for the sustained release of verapamil from the HVD-NLCS. The formulations released about ~ 85% of verapamil after 48 h and the drug had a prolonged release profile up to 72 h. On the other hand, the verapamil solution released approximately 99% of verapamil within 4 h. The release profiles of the selected formulations VER-9 and VER-11 were found almost similar in SGF and SIF release media. However, the release of verapamil from VER-9 was found slightly better as compared to VER-11 in the SGF release medium. The percentage cumulative release of verapamil at 72 h from VER-9 (95.91 ± 1.40) was found significantly higher as compared to VER-11 (90.67 ± 1.16) in the SGF medium. Therefore, VER-9 was selected as a final formulation and proceeded for further investigations.

Cumulative percentage of verapamil released in a SIF (pH 6.8) and b SGF (pH 1.2) release media for 72 h

DSC Study

The DSC analysis of verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, physical mixture (including Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), lyophilized blank formulation (Placebo), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 8. Verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, and trehalose had the melting peak at 144.96 °C, 220.41 °C, 72.46 °C, 50.80 °C, and 100.13 °C, respectively. The thermograms showed that there was no significant shift in the peaks of physical mixture, lyophilized blank formulation, and HVD-NLCs formulation (VER-9) when compared to the individual peak components such as Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate. This indicated the physical compatibility between the components. The endothermic peak of verapamil at 144.96 °C was no longer seen in the thermogram of HVD-NLCs formulation (VER-9) (Fig. 8f), which could be due to verapamil that had changed to amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs matrix [16].

DSC thermograms of a Compritol 888 ATO, b Polomxamer 188, c verapamil HCl, d dextran sulfate, e trehalose, f verapamil HCl and dextran sulfate physical mixture, g physical mixture (including Compritol 888 ATO, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), h placebo, and i HVD-NLCs formulation (VER-9)

WAXS Study

The WAXS/2θ scans of pure verapamil, dextran sulfate, bulk Compritol 888 ATO®, trehalose, lyophilized blank formulation (containing Compritol 888 ATO®, oleic acid, poloxamer 188, Tween 80®, trehalose, and dextran sulfate), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 9. The diffraction peaks of pure verapamil showed specific crystalline nature of the drug at 2θ scattered angles 14.42°, 16.67°, 17.07°, 18.07°, 18.82°, 20.22°, 23.77°, and 26.27° [17]. However, the WAXS/2θ scans of HVD-NLCs formulation (VER-9) showed that the peaks of verapamil diminished indicating a decrease in the crystallinity of the drug when incorporated in the lipids of HVD-NLCs. The scan also showed the predominant peaks at 2θ scattered angles 12.47°, 15.17°, 16.87°, 21.07°, and 23.82° which possibly attributed to the crystalline structure of Compritol 888 ATO® and trehalose because none of these peaks showed similarity with any of the pure verapamil peaks [10]. The results suggested that verapamil was in the amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs formulation. The Compritol 888 ATO® revealed polymorphic crystalline transformation upon heating, whereby it changed to a more stable form, and showed reduced intensity peaks at 21.1° and 23.3° in the HVD-NLCs and blank formulations. The WAXS pattern of pure dextran sulfate indicated its amorphous form.

X-ray patterns of a lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9), b lyophilized blank formulation, c trehalose, d dextran sulfate, e verapamil HCl, and f Compritol 888 ATO

Electron Microscopic Examinations

The particle shape and size of the HVD-NLCs formulation (VER-9) were examined using the electron microscope. The liquid preparation of HVD-NLCs formulation (VER-9) observed under transmission electron microscope (TEM) showed that the particles had a spherical shape with the size less than 200 nm (Fig. 10). In contrast, observation under scanning electron microscope (SEM) revealed that the nanoparticles no longer had a spherical shape following lyophilization of the formulation without trehalose. However, the cryoprotective effect of trehalose could be seen when it was incorporated in the HVD-NLCs formulation (VER-9). The SEM image indicated that the trehalose helped to protect the structure of the nanoparticle to such extent when compared to the lyophilized formulation without the cryoprotectant (Fig. 11).

TEM image of VER-9 before lyophilization

SEM images of VER-9 formulation a without trehalose; b with trehalose

Cellular Uptake Study of HVD-NLCs

Caco-2 cells have been extensively used to study drugs intestinal cellular uptake [18]. The Caco-2 cells lines is spontaneously differentiating to form monolayer which has significant morphological and biological resemblance to the intestinal epithelium [19]. Several researchers have reported the in vitro cytotoxicity studies of Compritol ATO 888® [20], oleic acid [21, 22], Tween 80® [23, 24], and poloxamer 188 [25]. These substances were used as excipients in the optimized formulation of HVD-NLCs (VER-9). Based on their finding, these excipients were safe within the concentration used, the cell line type, and cell density that have been employed in the present study. The concentration of verapamil in the samples of VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex used in the cellular uptake study was in the range of 10.03 μg/200 μL to 30.1 μg/200 μL. It was found that the verapamil cellular uptake was increased with increasing the verapamil concentration in the samples. The cellular uptake values of verapamil from VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex were increased from 6.45 ± 2.62 to 15.92 ± 4.78 μg, 0.89 ± 0.28 to 1.46 ± 0.65 μg, and 0.064 ± 0.019 to 0.118 ± 0.003 μg, respectively (Fig. 12). The verapamil cellular uptake from the VER-9 formulation was 10.90- and 134.91-fold higher than the verapamil solution and verapamil-dextran complex, respectively. The results indicated that verapamil was passively transported from HVD-NLCs, verapamil solution, and verapamil-dextran complex in the caco2-cells. A similar finding of higher cellular uptake of drugs from a lipid-based nanoformulation was reported [26].

In vitro model of Caco-2 cell line showing cellular uptake of HVD-NLCs (VER-9), verapamil solution, and verapamil-dextran complex (mean ± SD, n = 3)

Caco-2 cells act similarly as cell in animals when stimulated by fatty acid. van Greevenbroek et al. suggested that the incorporation of long-chain unsaturated fatty acids (e.g., oleic acid and linoleic acid) into the Caco-2 cells stimulate the secretion of very low-density lipoproteins (VLDL) and chylomicrons. In contrast, administration of saturated fatty acids primarily secretes intermediate- and low-density lipoproteins (IDL and LDL) [27]. Similar findings of increasing chylomicron secretion by the long-chain fatty acids were also reported by Caliph et al. in animal model [28]. In the present investigation, the long-chain fatty acids (Compritol 888 ATO® and oleic acid) used in the preparation of the HVD-NLCs may also stimulate the secretion of chylomicron, and hence increase the cellular uptake of the model drug.

Stability Study

The lyophilized VER-9 formulation was found stable for 6 months at refrigerated condition (5 ± 3 °C) (Table 6). There were no significant differences in the PS, PDI, ZP, and %EE after 6 months of stability study at storage temperature of 5 ± 3 °C. However, the VER-9 formulation was not stable after 1-month storage at the temperatures of 25 ± 2 °C/60 ± 5%RH and 40 ± 2 °C/75 ± 5% RH. The PS and PDI were increased significantly, while the total drug content decreased significantly. After 1 month of stability study, the samples were not measurable due to aggregation and sticky behavior of the nanoparticles.