Theranostic agents van de volgende generatie op basis van polyelektrolytmicrocapsules gecodeerd met halfgeleider nanokristallen:ontwikkeling en functionele karakterisering

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisering van calciumcarbonaatmicrodeeltjes

Het gebruik van bolvormige anorganische kristallen, in het bijzonder calciumcarbonaatmicrosferolieten, als substraat wordt bepaald door hun biocompatibiliteit, evenals de mogelijkheid van hun verwijdering in de loop van de vorming van polyelektrolytmicrocapsules zonder gebruik van oplosmiddelen die agressief zijn voor levende systemen. Calciumcarbonaatmicrodeeltjes op zich kunnen ook worden gebruikt als een systeem voor medicijnafgifte met gemodificeerde of verlengde afgifte, die dienen als een matrix voor het laden van medicijnen en het regelen van hun afgifte in de micro-omgeving, dwz ze hebben meerdere potentiële toepassingen in toedieningssystemen [36,37] ,38,39,40,41,42,43,44,45,46].

De belangrijkste factoren die de grootte en vorm van de microkristallen bepalen, zijn de snelheid en duur van het roeren en de incubatietijd van het reactiemengsel [33, 41]. We hebben experimenteel de voorwaarden bepaald voor het verkrijgen van calciumcarbonaatmicrosferolieten met een optimale grootteverdeling. Enkele CaCO₃ Er is gevonden dat microdeeltjes een bijna regelmatige ronde vorm hebben. Aanvullend bestand 1:Afbeelding S2 toont de grootteverdelingen van calciumcarbonaatmicrodeeltjes verkregen bij verschillende roersnelheden. Zoals uit deze gegevens blijkt, nam de grootteheterogeniteit van de deeltjes toe met toenemende roersnelheid. Als de roersnelheid 250 tpm was, varieerde de grootte van de verkregen deeltjes van 4,0 tot 6,0 m. In dit geval waren alle microdeeltjes in het monster gescheiden en was hun grootteverdeling bijna normaal (aanvullend bestand 1:figuur S2a). Als het mengsel echter met 500 tpm werd geroerd, zagen we deeltjes met een onregelmatige vorm die aggregaties van kleinere deeltjes waren, waarbij de gemiddelde grootte van afzonderlijke deeltjes varieerde van 2,7 tot 5,6 m (aanvullend bestand 1:figuur S2b). Bij een roersnelheid van 750 tpm werd de spreiding van de deeltjesgrootte vergroot. Dit monster bevatte ook onregelmatig gevormde aggregaties, met een gemiddelde grootte van individuele microdeeltjes in het bereik van 3,8 tot 5,7 μm (aanvullend bestand 1:figuur S2c).

Zo maakte het roeren van het reactiemengsel met een snelheid van 250 rpm het mogelijk om deeltjes te verkrijgen met een optimale grootteverdeling en een bijna regelmatige vorm en het voorkomen van deeltjesaggregaties. Daarom schatten we het effect van de roerduur op de microdeeltjesgrootteverdeling bij deze roersnelheid (aanvullend bestand 1:figuur S3). Roeren van het reactiemengsel gedurende 15 s leverde een verhoogd aantal grotere deeltjes op in vergelijking met 30 s roeren. Een verhoging van de roerduur tot 60 s had een soortgelijk effect. Dat wil zeggen dat de roerduur in het eerste geval onvoldoende was (Aanvullend bestand 1:Figuur S3a) en buitensporig in het laatste geval (Aanvullend bestand 1:Figuur S3c). Daarom beschouwden we de snelheid van 250 tpm en de duur van 30 s als optimale roeromstandigheden.

Volgens scanning-elektronenmicroscopie (SEM) -gegevens was het oppervlak van de calciumcarbonaatmicrodeeltjes heterogeen, gekenmerkt door porositeit (figuur 1a). Bij een vergroting van ×  40.000 kon worden gezien dat de microdeeltjes op hun beurt werden gevormd door kleinere submicrometerdeeltjes (figuur 1b). De verkregen microdeeltjes hadden dus een poreuze structuur en vertegenwoordigden matrices die niet alleen geschikt zijn als substraten, maar ook als zodanig kunnen worden gebruikt als afgiftesystemen en vanwege hun specifieke oppervlaktestructuur gemakkelijk kunnen worden gebruikt als een matrice voor laag-voor-laag polymeerafzetting.

Scanning-elektronenmicrofoto's van calciumcarbonaatmicrodeeltjes (a ) en hun oppervlak bij een hogere vergroting (b )

Voorbereiding en karakterisering van polyelektrolytmicrocapsules gecodeerd met Quantum Dots

De bereide in water oplosbare QD's werden gekenmerkt door een breed absorptiespectrum en een smal fluorescentiespectrum met een emissiemaximum van 590 nm (Fig. 2). De hydrodynamische diameter van deze QD-monsters varieerde van 23,96 tot 28,2 nm. Aanvullend bestand 1:Afbeelding S4 toont de grootteverdeling van de QD's gestabiliseerd met HS−(PEG)₁₂ COOH. De wijziging van het QD-oppervlak met HS−(PEG)₁₂ −COOH zorgde voor de QD-stabiliteit in de waterfase, evenals voor de negatieve oppervlaktelading die voldoende was voor de effectieve adsorptie van QD's tussen positief geladen polyelektrolytlagen tijdens de coderingsprocedure [22, 47].

Optische kenmerken van de CdSe/ZnS core/shell quantum dots opgelost met HS−(PEG)₁₂ −COOH-liganden

De gemeten oppervlakteladingswaarden van de calciumcarbonaatmicrodeeltjesmonsters tijdens elke afzettingsstap van de polyelektrolytlagen en QD's (tabel 1) bevestigden dat de oppervlaktelading van de oorspronkelijke matrice, de opgeloste QD's, evenals de oppervlaktelading na elke afzetting van polymeren zijn voldoende voor de effectieve absorptie van elke volgende laag.

Door de intrinsieke oppervlaktelading en de poreuze oppervlaktestructuur van de synthetische calciumcarbonaatmicrodeeltjes konden ze worden gebruikt als een matrice voor de tegengesteld geladen polyelektrolyt en QD-afzetting (figuur 3). De toepassing van PAK- en PSS-polymeren in QD-gecodeerde polyelektrolyt-polymere microcapsules wordt bepaald door hun biocompatibiliteit en niet-toxiciteit en ook niet-biologische afbreekbaarheid die bovendien helpt om QD's in de schaal te houden. De biologische afbreekbaarheid van poly-l-arginine, poly-l-lysine, chitosan, alginezuur-natriumzout en dextranesulfaat, die ook veel worden gebruikt bij de vorming van polyelektrolytmicrocapsules, zal de QD-diffusie uit het polymere membraan induceren, wat zou moeten resulteren in een afname van de fluorescerende eigenschappen van de microdeeltjes [3, 11, 39, 48.49,50,51,52]. Het in deze studie gebruikte PAK-polykation en PSS-polyanion bevatten respectievelijk amine- en sulfaatgroepen die zorgen voor elektrostatische interactie tussen de polymeerlagen, wat resulteert in de vorming van interpolymeercomplexen [16, 25, 36, 37]. De keuze van de eerste polymeerlaag werd bepaald door de oppervlaktelading van de gesynthetiseerde calciumcarbonaatmicrodeeltjes.

Bereidingsprocedure voor microcapsules gecodeerd met kwantumdots:vorming van de lagen van respectievelijk het polykation (1) en polyanion (2), de PAK- en PSS-polyelektrolyten op het matrice-oppervlak; codering van de resulterende microdeeltjes met kwantumdots en verdere laag-voor-laag afzetting van polymeren (3); verwijdering van de calciumcarbonaatkern (4)

Figuur 4 toont SEM-afbeeldingen van de stadia van vorming van polymeerschillen op het substraatoppervlak. Zoals te zien is op de microfoto's, bevatten de microdeeltjes een kern van calciumcarbonaatkorrels en een schil, die duidelijker werd naarmate het aantal geadsorbeerde polymeerlagen groter werd. Het oppervlak van de microdeeltjes bedekt met de polyelektrolytlagen volgde de vorm van het substraat met zijn karakteristieke homogeniteit, wat suggereerde dat het ook poreus was (Fig. 4a, b) [44]. Naarmate de polymeerschil dikker werd, werd het oppervlak van de microdeeltjes gelijkmatiger en gladder (Fig. 4c, d).

Scanning-elektronenmicroscopiebeelden van calciumcarbonaatmicrodeeltjes na het aanbrengen van vier (a , b ) en tien (c , d ) polyelektrolytlagen

De laatste stap van de voorbereiding van QD-gecodeerde polyelektrolytmicrocapsules omvatte de verwijdering van de calciumcarbonaatkern en de vorming van de uiteindelijke structuur van de microcapsules. Om de matrix bestaande uit calciumcarbonaatkorrels op te lossen, werden de microdeeltjes gewassen met EDTA. EDTA werd voornamelijk gebruikt omdat het in water oplosbare complexen vormt bij interactie met zouten van tweewaardige metalen, waaronder calcium, en het lage molecuulgewicht zorgt voor permeabiliteit van de polyelektrolytschil voor EDTA en de complexering ervan met Ca ²⁺ . Dit leidt tot het oplossen van de kern van de polyelektrolytdeeltjes en de vorming van een holle structuur [45, 46].

De QD-gecodeerde microdeeltjes en polyelektrolytmicrocapsules die in ons onderzoek werden verkregen, hadden een bolvormige of bijna bolvormige vorm en een grootte van 3,8 tot 6,5 m (figuur 5). Analyse van de morfologie en structuur van de microdeeltjes en microcapsules in de fluorescerende modus toonde holtes in de polyelektrolytmicrocapsules, zoals blijkt uit hun hogere transparantie in vergelijking met de microdeeltjes (figuur 5b). Dit toonde aan dat de procedure van kernoplossing met EDTA effectief was. De confocale microscopiegegevens toonden ook de holle structuur van de verkregen fluorescerende polyelektrolytmicrocapsules (figuur 6). Deze microcapsules kunnen worden onderscheiden als afzonderlijke deeltjes (Fig. 6a, b) die kunnen worden gekarakteriseerd als bolvormige deeltjes met een ruw oppervlak vanwege hun oppervlaktemodificatie door BSA-coating.

Fluorescentiemicroscopiebeelden van calciumcarbonaatmicrodeeltjes gecoat met polyelektrolyt en gecodeerd met kwantumdot (a ) en daaruit verkregen polyelektrolytmicrocapsules (b )

Confocale microscopiebeelden van de polyelektrolytmicrocapsules gecodeerd met kwantumdots en gecoat door BSA:doorsneden van de microcapsules (a ); 3D-projectie van een enkele polyelektrolyt-microcapsule (b )

Inschatting van de coderingsefficiëntie

De efficiëntie van codering werd geschat door de hoeveelheid QD's geadsorbeerd op het positief geladen polymeeroppervlak van het microdeeltje. Schatting van de hoeveelheden QD's in de oorspronkelijke oplossing die werd gebruikt voor het coderen van microdeeltjes en in het supernatant voor en na incubatie van microdeeltjes met de QD-oplossing toonde aan dat het aantal QD's dat aan het oppervlak van de microdeeltjes was gebonden, lineair toenam met toenemend QD-gehalte in het reactiemengsel van 0,36 tot 2,241 mg (Fig. 7a). Verdere toename van de hoeveelheid QD's in de oplossing leidde tot een afname van het aantal geadsorbeerde QD's. This may have resulted from an insufficient density of the positive charge determined by amine groups of PAH on the microparticle surface because of an excessive amount of QDs and the resultant saturation of the surface with them. Apparently, the QDs were adsorbed more efficiently if their amount was smaller than 2.241 mg owing to sterically favorable conditions and less interference with one another’s attachment. The pattern of the dependence of the encoding efficiency on the QD content of the solution used for the encoding agrees with our earlier data [22].

Estimation of the efficiency of encoding of microparticles with different amounts of quantum dots (a ) and their fluorescence characteristics (b ). Asterisk indicates significant difference of QD-encoded microbeads from the QD-encoded microcapsules (p  < 0.05)

Estimation of the optical characteristics of the obtained polyelectrolyte microcapsules is an essential stage of the assessment of encoding efficiency. Its results show how suitable the given technique is for fabrication of imaging agents based on QD-encoded polyelectrolyte microcapsules.

Figure 7b shows the fluorescence intensities of the microparticles and microcapsules measured as the mean normalized intensity of gray color as dependent on the amount of QDs used for encoding them. As seen from the figure, the fluorescence intensity of the encoded microparticles was higher than that of the microcapsules obtained from them. At the same time, the microcapsules encoded with different amounts of QDs did not differ significantly from one another in fluorescence intensity (p  > 0.05). Despite some decrease in the fluorescence intensity of the microcapsules, their encoding with the amount of QDs indicated above ensures a contrast sufficient for effective imaging.

Quantum Dot Fluorescence Lifetime within Encoded Polyelectrolyte Microcapsules

As noted above, the fluorescence intensity of the polyelectrolyte microcapsules was decreased compared to the microparticles used for their fabrication and encoded with the same QDs. Therefore, we have estimated the fluorescence lifetimes of both the original QDs and the same QDs embedded in the microparticles or the polymeric walls of the microcapsules.

The QD fluorescence kinetic curves (Fig. 8) are characterized by monoexponential dependence of fluorescent intensity on time according to the following equation:

Fluorescence lifetimes of the solubilized CdSe/ZnS quantum dots with a fluorescence peak at 590 nm incorporated in the fabricated microparticles and microcapsules

waar ik (t ) is the intensity of QD fluorescence in response to excitation pulses and A ₁ , х , en t ₁ are parameters describing the change in the intensity with time.

We determined the fluorescence lifetime for each sample (Table 2). The original solubilized QDs had the longest fluorescence lifetime; it was decreased after the QDs were adsorbed onto the microparticles and incorporated into the structure of the polymer shell. This may have resulted from interaction between the QDs and PAH, as we found earlier [22]. In the case of microcapsules, the QD fluorescence lifetime tended to further decrease compared to the QDs within the microparticles from which the microcapsules were fabricated. A possible cause of this decrease was a technological factor entailed in the fabrication of microcapsules, namely, the dissolution of the core and the related increase in the necessary number of washings.

It should be noted, that the fluorescence lifetime also tended to decrease with time after the microcapsule fabrication. However, since 48 h after the microcapsule fabrication, further changes in the mean fluorescence lifetime were insignificant. The fluorescence decay was apparently caused by a decrease in the fluorescence quantum yield of QD embedded in the shells of the capsules. This effect is likely to have resulted from the change in the distribution of the electron potential and the geometric rearrangement of QDs in the inner layers of the polymer shell after the core removal that increased the probability of nonradiative recombination due to the charge transfer to between neighboring QDs or between QDs and polymer molecules [22].

Interaction of Quantum Dot- Encoded Polyelectrolyte Microcapsules with Phagocytic Cells In Vitro

We used confocal microscopy to analyze the interaction of QD-encoded polyelectrolyte microcapsules with live phagocytic cells, their uptake by cells, and the possibility of cell labeling. The murine alveolar macrophage (MH-S) cells were used as a model, because of the capability of these cells to phagocytize xenogenic objects.

The MH-S cells were treated with approximately 1.2×10 ⁶ of QD-encoded microcapsules by short-term (4 h) or long-term (24 h) incubations. We observed signs of primary uptake of the microcapsules in both cases:after the short- and (Fig. 9a–d) long-term incubation (Fig. 9e–h). Polyelectrolyte microcapsules or their conglomerates could be seen in green color. The microcapsules could be clearly distinguished both in the external environment of cells and inside the MH-S cells that could be evidenced by the distance between the microcapsules and nuclei of the MH-S cells which were stained by far-red DNA stain DRAQ5 and can be seen as red spherical shaped objects at all the microphotographs. As individual microcapsules and as their conglomerates were detected to undergo the uptake process. The fact that microcapsules were located in internal cell environment or at least attached to the surface of the macrophages is confirmed by clearly distinguished short distances between the nuclei and the polyelectrolyte microcapsules (Fig. 9b, d, g, h). In Fig. 9g, residually stained boundaries of the macrophage cytoplasmic membranes are distinctly seen, which indicates effective uptake, and well-discernible microcapsules are easy to detect to be attached on their surface either within the cells.

Confocal images of the MH-S cells treated with the QD-encoded polyelectrolyte microcapsules coated with BSA. The upper row shows the images of the samples after 4 h of short-term incubation; the microcapsules are shown by white arrows (a –d ). The lower row demonstrates the images of the samples after 24 h of long-term incubation; the microcapsules are shown by white arrows (e –u ). The nuclei of the macrophages were counterstained with far-red DNA stain DRAQ5

During the short-term incubation, single microcapsules were found to be phagocytized by MH-S cells prior to conglomerates of the microparticles. While after long-term incubation (24 h), the amount of the conglomerates of the polyelectrolyte microcapsules undergoing the uptake process and located inside cells or at least attached to the cell surface was more significant than after short-term incubation. Thus, the polyelectrolyte microcapsules obtained in this study used as promising tools for imaging and tracking of live cells.