Amine-Aldehyde Chemical Conjugation op een met kaliumhydroxide behandeld polystyreen ELISA-oppervlak voor nanosensing van een HIV-p24-antigeen

Abstract

De enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) wordt veel gebruikt voor ziektesurveillance en het screenen van geneesmiddelen vanwege de relatief hogere nauwkeurigheid en gevoeligheid. Het verfijnen van de ELISA is verplicht om de specifieke detectie van biomoleculen met een lagere abundantie te verbeteren. Hiertoe is hogere moleculaire opname op het polystyreen (PS) ELISA-oppervlak cruciaal voor efficiënte detectie, en dit zou kunnen worden bereikt door de moleculen in de juiste oriëntatie te immobiliseren. Het is zeer uitdagend om eiwitmoleculen op een goed uitgelijnde manier op een ELISA-oppervlak te immobiliseren vanwege ladingsvariaties. We gebruikten een 3-(aminopropyl) triethoxysilaan (APTES)- en glutaaraldehyde (GLU)-gekoppelde PS-chemische strategie voor het oppervlak om de hoge prestaties met ELISA aan te tonen. Een behandeling met kaliumhydroxide gevolgd door een gelijke verhouding van 1% APTES en GLU-aanhechting bleek optimaal te zijn, en een langere incubatie met GLU was gunstig voor maximale gevoeligheid. p24 is een essentieel vroeg uitscheidend antigeen voor het diagnosticeren van het humaan immunodeficiëntievirus (HIV), en het is gebruikt voor efficiënte detectie met de bovenstaande chemie. Er werden drie verschillende procedures gevolgd en deze leidden tot een verbeterde detectie van het HIV-p24-antigeen bij 1 nM, wat een 30 keer hoger niveau is in vergelijking met een conventioneel ELISA-oppervlak. De hier getoonde chemische functionalisering van het oppervlak vertoont ook een hogere specificiteit met humaan serum en HIV-TAT. De bovenstaande benadering met de ontworpen oppervlaktechemie kan ook worden aanbevolen voor ziektediagnose op andere detectieoppervlakken waarbij de interactie van de sonde en de analyt in heterogene testmonsters betrokken is.

Achtergrond

De detectie van ziektebiomarkers en oppervlakteantigenen op intacte pathogenen is noodzakelijk op het gebied van medische diagnose om de levensduur van de mens te verlengen en een gezonder leven te ondersteunen. Er zijn verschillende detectiesystemen beschikbaar om pathogenen en levensbedreigende ziekten, waaronder kankers, te diagnosticeren [1,2,3,4]. Het is aangetoond dat het scala aan sondes en detectiestrategieën verschillende ziekten identificeert [5, 6]. Van deze resultaten is de enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) een gevestigde strategie voor het detecteren en diagnosticeren van belangrijke ziekten, waaronder HIV, en ELISA wordt beschouwd als een kwaliteitscontroletest [7,8,9,10]. Als immunoassay detecteert ELISA het antigeen met behulp van het juiste antilichaam. Om deze rol te vervullen, wordt het antigeen geïmmobiliseerd op een polystyreen (PS) oppervlak en gaat het vervolgens een interactie aan met het partnerantilichaam (primair antilichaam), gevolgd door het gastheerspecifieke antilichaam (secundaire antilichaam) met het geconjugeerde enzym, dat kan binden aan het primaire antilichaam. Ten slotte worden deze moleculaire interacties gevolgd door een geschikt substraat. Onderzoekers hebben verschillende op ELISA gebaseerde benaderingen gebruikt, waaronder de sandwich-methode met geschikte poly- en monoklonale antilichamen of aptamer-antilichaamcombinaties om de detectie te verbeteren [11,12,13,14].

De gevoeligheid van een ELISA hangt af van parameters zoals de interactie tussen het antigeen en het antilichaam, de temperatuur, de pH en de efficiëntie van de antigeenaanhechting op het PS-oppervlak. Van deze factoren speelt de immobilisatie van het antigeen of antilichaam op de PS-plaat een cruciale rol bij het verbeteren van de detectielimiet. Bovendien heeft de beperking die wordt veroorzaakt door de aanhechting en de niet-uniforme verdeling van eiwit op het PS-oppervlak een grote invloed op de gevoeligheid van de test [5]. Een hogere hoeveelheid met de juiste immobilisatie van eiwit helpt bij het bereiken van de juiste oriëntatie op het PS-oppervlak voor mogelijke verbeteringen in detectie. Er zijn verschillende strategieën gebruikt om eiwitten op de juiste manier op het PS-oppervlak te immobiliseren. Een eiwit of antilichaam heeft het vermogen om eenvoudig op de PS-plaat te immobiliseren door chemische of fysieke adsorptie of elektrostatische interactie. Bora et al. [15] geïmmobiliseerd eiwit op het PS-oppervlak met behulp van fotochemie, en ze vonden verbeteringen tot 1,5 tot 2-voudig hoger in vergelijking met het onbehandelde oppervlak. In een ander onderzoek werd de efficiënte immobilisatie van eiwit op de PS-plaat met een polymeer genaamd polyvinylbenzyllactonoylamide (PVLA) aangetoond [16]. Polyethyleenglycol (PEG)-gebaseerde polymeren hebben ook gezorgd voor de efficiënte immobilisatie van biomoleculen op sensoroppervlakken. Lakshmipriya et al. [17] ontwikkelde een verbeterde detectie van stollingseiwit factor IX door het immobiliseren van het gethioleerde oligomeer samen met twee polymeren (PEG-b-PAAc en N6-PEG) op een met goud bedekt oppervlak.

Op het oppervlak van de ELISA-plaat bestaat PS uit een alifatische koolstofketen met hangende benzeenringen op elke koolstof, en het zorgt voor een hydrofoob oppervlak. De carboxylgroep op het PS-oppervlak bindt het antigeen of antilichaam door een elektrostatische interactie met de blootgestelde aminegroepen. Deze bindingsstrategie heeft echter nadelen, zoals de lagere binding van eiwit en onregelmatige positionering van de moleculen. De kleinere eiwitten en peptiden met een lager aantal aminozuursamenstellingen zijn bijzonder moeilijk te binden op het PS-oppervlak vanwege de beschikbaarheid van minder epitopen. Verder is aangetoond dat als de moleculen op het detectiesubstraat vol zijn, de afstand tussen de sondes te verstoord is om een echte interactie aan te gaan. Om die reden verbetert het verhogen van de binding van een eiwit of antilichaam op de PS-plaat met de juiste oriëntatie de detectielimiet. Over het algemeen worden eiwitten direct geïmmobiliseerd op het ELISA-oppervlak en zijn onderzoekers gericht op het verbeteren van eiwitimmobilisatie op het ELISA-oppervlak om hoogwaardige detectie te ontwikkelen. Met name de immobilisatie van eiwit door chemische functionalisering op het PS-oppervlak is door verschillende onderzoekers waargenomen om deze strategie te verbeteren. Op amine gebaseerde chemische modificatie is effectief in het immobiliseren van verschillende antilichamen via de juiste crosslinker. 3-(Aminopropyl) triethoxysilaan (APTES) wordt vaak gebruikt om het detectieoppervlak aan te passen voor gebruik met aminen. Het antilichaam kan via zijn COOH-groep immobiliseren op het amine-gemodificeerde APTES-oppervlak. De immobilisatie van eiwit kan echter niet direct worden gekoppeld aan het amine-oppervlak zoals het antilichaam; in het bijzonder hebben kleinere eiwitten een geschikt verknopingsmiddel nodig. Hier hebben we een eenvoudige stapimmobilisatie voor eiwitten geïntroduceerd met behulp van een chemische modificatie met APTES en glutaaraldehyde (GLU). We hebben de eiwitten covalent geïmmobiliseerd op het amine-gemodificeerde oppervlak en gekoppeld met behulp van GLU. GLU is een organische verbinding met de formule CH₂ (CH₂ CHO)₂ , en het is een van de meest effectieve eiwitverknopingsmiddelen gebleken [4, 18,19,20]. Het heeft twee aldehydegroepen aan de uiteinden; het ene uiteinde bindt aan het amine-gemodificeerde ELISA-oppervlak en het andere uiteinde is vrij om het eiwit of antilichaam te binden. Over het algemeen is de immobilisatie van kleinere eiwitten of peptiden op het ELISA-oppervlak echt een uitdaging vanwege de aanwezigheid van minder amines op het oppervlak. Met de chemische functionaliseringsstrategie is er een mogelijkheid om kleinere eiwitten of peptiden te gebruiken om het materiaal sterk op de ELISA PS-plaat te immobiliseren. Voor onze methode gebruikten we APTES-GLU als de linker; door deze modificatie te gebruiken, kunnen we alle soorten antilichamen, eiwitten en peptiden immobiliseren. De signaal- en gevoeligheidsverbeteringen onder deze strategie zijn hoger in vergelijking met andere chemische strategieën die in het verleden zijn onderzocht [3, 4].

Om het voordeel van deze chemische eigenschappen aan te tonen, kozen we voor de detectie van een van de belangrijkste humaan immunodeficiëntievirus (hiv)-eiwitten (p24), die tot expressie wordt gebracht in het eerdere stadium van HIV-infectie. Het p24-antigeen bestaat uit de virale kern en is tijdens de eerste week van infectie op een hoger niveau aanwezig. Daarom is het ideaal om een gevoelig systeem te genereren met p24 voor eerdere hiv-detectie. Hierin werd de detectie van p24 gegenereerd met behulp van het bovengenoemde chemisch gemodificeerde ELISA-oppervlak. Deze chemische functionaliseringsstrategie heeft de p24-detectie op het PS ELISA-oppervlak over meerdere plooien verbeterd en kan worden aanbevolen voor het detecteren van andere belangrijke klinische biomarkers.

Materialen en methoden

Reagentia en biomoleculen

Recombinante HIV-p24- en Tat-eiwitten en p24-antilichaam werden gekocht bij Abcam (Maleisië). 3-(Aminopropyl)triethoxysilaan (APTES), glutaaraldehyde (GLU) en humaan serum werden gekocht bij Sigma-Aldrich (VS). Anti-muis-IgG-geconjugeerde mierikswortelperoxidase (anti-muis immunoglobuline HRP) werd verkregen van Thermo Scientific (VS). Een ELISA-plaat werd aangeschaft bij Becton Dickinson (Frankrijk). Een ELISA 5X bekledingsbuffer werd verkregen van Biolegend (UK). Runderserumalbumine (BSA) en HRP-substraat [3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB)] werden verkregen van Promega (VS). De analytische ELISA-lezer is verkregen van Fisher Scientific (Maleisië).

Optimale APTES- en GLU-niveaus voor functionalisering op het PS-oppervlak

De optimalisatie van de APTES- en GLU-niveaus voor gebruik op het PS-oppervlak werd uitgevoerd met het gerichte HIV-p24-antigeen. Om de geschikte concentraties van APTES en GLU te bepalen, werd het ELISA-oppervlak eerst 10 min geactiveerd met 1% kaliumhydroxide. Vervolgens liet men drie verschillende hoeveelheden APTES (0,5, 1 en 2%) binden op het ELISA-oppervlak, en ze werden overnacht bij kamertemperatuur (RT) geïncubeerd. Daarna werden twee verschillende hoeveelheden GLU (1 en 2%) aangebracht op het amine-gemodificeerde PS-oppervlak. Op dat moment liet men HIV-p24 in een concentratie van 250 nM binden op het met GLU gemodificeerde oppervlak, en het resterende GLU-oppervlak werd geblokkeerd met 2% BSA. Het p24-antilichaam werd geïntroduceerd in een verdunning van 1:1000 en vervolgens liet men anti-muis IgG-HRP binden aan het p24-antilichaam. Ten slotte werden deze interacties gevolgd door het substraat (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB) voor HRP toe te voegen. Nadat de optimale hoeveelheid substraat (100 mM) was toegevoegd, werd de absorptie afgelezen met een ELISA-lezer bij 405 nm. Controle-experimenten werden uitgevoerd in afwezigheid van doelwit HIV-p24.

Optimalisatie van Aldehyde Linkage to Amine Group

Om de geschikte incubatietijd voor GLU te bepalen om de met amine gemodificeerde oppervlakken te verbinden, werden twee verschillende incubatietijden waargenomen. Nadat het ELISA PS-oppervlak was gemodificeerd met APTES, werd de GLU gedurende 3 uur geïmmobiliseerd en onafhankelijk overnacht geïncubeerd, en vervolgens werd 250 nM HIV-p24-antigeen geïmmobiliseerd op de met GLU gemodificeerde oppervlakken. De overige stappen werden gevolgd zoals getoond in het vorige experiment.

Vergelijkende detecties tussen HIV-p24-antigeen op het GLU-gemodificeerde oppervlak en de GLU-voorgemengde-HIV-p24-antigeenbijlagen

Om het HIV-p24-antigeen op het ELISA-oppervlak te detecteren, vergeleken we twee verschillende benaderingen voor oppervlaktemodificatie met behulp van GLU. In de eerste (methode 1:amine-GLU-p24) werd het PS-oppervlak aanvankelijk gemodificeerd door een amine met behulp van 2% APTES, werd 2% GLU aan het oppervlak toegevoegd om het plaatoppervlak te binden met een aldehydegroep, en vervolgens 100 nM HIV-p24-antigeen werd toegevoegd. In de tweede benadering (methode 2:amine-GLU voorgemengd p24), nadat het oppervlak was gemodificeerd door een amine, werd GLU-p24 (2% GLU werd gemengd met 100 nM HIV-p24-antigeen en gedurende 30 min op RT gehouden) toegevoegd. Ten slotte werd de detectie uitgevoerd met behulp van het p24-antilichaam. De andere stappen zijn uitgevoerd zoals hierboven uitgelegd. De controle-experimenten werden uitgevoerd in afwezigheid van het doelwit HIV-p24.

Detectielimiet:conventionele versus chemisch gemodificeerde ELISA

Om de detectielimiet te controleren, werden verschillende concentraties p24 getitreerd van 0,5 tot 500 nM, en ze werden geëvalueerd met behulp van de conventionele methoden en methoden 1 en 2.

Conventionele methode

HIV-p24-antigeen werd aanvankelijk verdund met 1% ELISA-coatingbuffer, toegevoegd aan het ELISA-oppervlak en een nacht op 4°C gehouden, en vervolgens werden de resterende gebieden geblokkeerd met 2% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Daarna werd een 1:1000 verdunning van p24-antilichaam toegevoegd en gedurende 1 uur geïncubeerd, en vervolgens werd een 1:1000 verdunning van anti-muis-IgG-HRP toegevoegd aan het ELISA-oppervlak en men liet dit 1 uur staan. Ten slotte werd het HRP-substraat (TMB) toegevoegd en gemeten bij een golflengte van 405 nm met behulp van de ELISA-lezer.

Methode 1

Verschillende concentraties HIV-p24-antigeen werden toegevoegd aan de APTES- en GLU-gemodificeerde oppervlakken. Nadat het antigeen was geïmmobiliseerd, werden de overige stappen gevolgd zoals vermeld in de conventionele ELISA. Wassingen werden vijf keer uitgevoerd tussen elke immobilisatiestap. De absorptie werd geregistreerd bij een golflengte van 405 nm met behulp van de ELISA-lezer en er werden foto's gemaakt.

Methode 2

Op de APTES-gemodificeerde ELISA-plaat werden verschillende concentraties p24 vooraf gemengd met GLU geïmmobiliseerd. Alle andere stappen die voor de conventionele ELISA werden gebruikt, werden gevolgd. Wassingen werden vijf keer uitgevoerd tussen elke immobilisatiestap. De absorptie werd geregistreerd bij een golflengte van 405 nm met behulp van de ELISA-lezer en er werden foto's gemaakt. Controle-experimenten werden uitgevoerd in afwezigheid van het doelwit HIV-p24.

Specifieke detectie van het HIV-p24-antigeen op het APTES-gemodificeerde oppervlak

Om de testspecificiteit te controleren, hebben we twee verschillende controle-experimenten uitgevoerd. In plaats van het HIV-p24-antigeen hebben we humaan serum of HIV-TAT-eiwit gebruikt, vooraf gemengd met 1% GLU en toegevoegd aan het APTES-gemodificeerde oppervlak. Alle andere stappen werden gevolgd zoals hierboven uitgelegd. Controle-experimenten werden uitgevoerd in afwezigheid van doelwit HIV-p24.

Resultaten en discussie

De enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is een effectieve immunoassay die onderzoekers helpt om verschillende biomoleculen te identificeren met behulp van geschikte antilichamen. Een hoge immobilisatie van analyten (eiwitten, peptiden, antilichamen en aptameren) [21,22,23] en het vermogen om moleculen te vangen (monoklonale antilichamen, polyklonale antilichamen en Fc-regio's van antilichamen) [24, 25] kunnen de detectielimiet en helpen bij het ondersteunen van de specificiteit van de analyse. Met dit in gedachten zijn verschillende soorten onderzoek gericht op het chemisch modificeren van het ELISA-oppervlak om de correct georiënteerde sonde of analyt in een grotere hoeveelheid te vangen. In het algemeen wordt een antilichaam of eiwit op het ELISA PS-oppervlak geïmmobiliseerd door een elektrostatische interactie tussen de carboxylgroep op het PS en de aminegroepen op het eiwit of antilichaam. Deze methode is echter niet efficiënt genoeg om een hogere gevoeligheid en specificiteit te bereiken vanwege de bindingsbeperking. Om dit fundamentele probleem te verhelpen, hebben we tijdens het huidige onderzoek een chemisch gefunctionaliseerd ELISA-oppervlak voorbereid met behulp van 3- (aminopropyl) triethoxysilaan (APTES) en glutaaraldehyde (GLU) voor efficiënte eiwitimmobilisatie. Zoals getoond in Fig. 1a, werd een door kaliumhydroxide geactiveerd PS-oppervlak gemodificeerd door een amine met behulp van APTES en vervolgens verknoopt met GLU om het eiwit te hechten. Bij afwezigheid van een behandeling met kaliumhydroxide, is het optimale niveau van APTES gehecht aan het PS-oppervlak aanzienlijk lager vanwege de afwezigheid van een polaire waterstofbrugacceptor die de initiële adsorptie verbetert en de hogere binding van APTES zal veroorzaken. Figuur 1b toont de voorgestelde detectie van geïmmobiliseerd eiwit op het chemisch gemodificeerde ELISA-oppervlak met zijn partnerantilichaam.

Schematische weergave van chemisch gemodificeerde ELISA (a ). Het ELISA-oppervlak werd chemisch gemodificeerd met APTES en GLU na behandeling met kaliumhydroxide. Het antigeen werd geïmmobiliseerd op het met GLU gemodificeerde oppervlak. b Het geïmmobiliseerde antigeen werd gedetecteerd door zijn partnerantilichaam

Om bewijs te verzamelen over deze detectiestrategie, wilden we een belangrijk eiwit van het humaan immunodeficiëntievirus (hiv) gebruiken, p24 genaamd. Het HIV-p24-antigeen is een van de eiwitten die tot expressie kunnen worden gebracht tijdens het vroege stadium van HIV-infectie, en het vermenigvuldigt zich in het gastheersysteem, zoals blijkt uit andere virale systemen (Fig. 2). Intact HIV heeft glycoproteïnen op de envelop die de capside bedekt, en het HIV-p24-antigeen bevindt zich in het capside-gebied (figuur 3a). Voordat we HIV-p24-antigeen detecteerden, hebben we in eerste instantie de concentratie van de chemische linker geoptimaliseerd om het HIV-p24-antigeen op het ELISA-oppervlak te vangen. We onderzochten verschillende concentraties en combinaties van APTES en GLU op het ELISA-oppervlak en evalueerden de resultaten met een constante concentratie van 250 nM HIV-p24-antigeen. Zoals getoond in Fig. 3b en c, vertoonden APTES- en GLU-toepassing bij 1% een verzadigd niveau van HIV-p24-antigeenbinding. Als APTES minder dan 1% aanwezig was, was de bindingsabsorptie (OD) lager, op hetzelfde niveau als dat van 2% APTES, vanwege een toename in niet-specificiteit (in verwijzing naar het controle-experiment). Voor GLU toont het niveau van 2% een goede detectie van het HIV-p24-antigeen bij een absorptie van 0,25, en tegelijkertijd vertoont het controle-experiment (zonder HIV-p24) de hoogste absorptie (0,16). De optimale 1% APTES en GLU vertonen de laagste absorptie in het controle-experiment (0,08) en de hoogste absorptie (0,22) tijdens de specifieke detectie van het HIV-p24-antigeen. Dit resultaat deed zich voor omdat het, met de toename van APTES en GLU, mogelijk is om het antilichaam op de resterende vrije amine-oppervlakken (afkomstig van APTES) en aldehyde-oppervlakken (afkomstig van GLU) te vangen. Dit resultaat is hetzelfde, zelfs wanneer de vrije oppervlaktegebieden in de bovengenoemde gevallen werden geblokkeerd met BSA. Om de methode verder te verfijnen, hebben we ook een poging gedaan om de BSA-concentratie te verhogen om het achtergrondsignaal te minimaliseren. Maar zelfs bij de hogere APTES- en GLU-concentratie was er sprake van biofouling. Op basis van deze resultaten is de geoptimaliseerde conditie 1% APTES en GLU, zoals gebruikt in de experimenten.

HIV en gastheercelinteractie. De algemene strategie van HIV-vermenigvuldiging wordt weergegeven

een Intacte hiv-structuur. Het p24-antigeen is aangegeven. b De optimalisatie van APTES en GLU. APTES (0,5, 1 en 2%) en GLU (1 en 2%) werden met verschillende combinaties gebruikt om de constante concentratie (250 nM) van HIV-p24-antigeen te detecteren

Na de APTES- en GLU-optimalisatie hebben we ook de incubatietijd aangepast voor het koppelen van de GLU aan het APTES-gemodificeerde oppervlak. Zoals weergegeven in Fig. 4a, leidt het 's nachts incuberen van de GLU tot de hoogste absorptie in vergelijking met de kortere incubatietijd (3 uur). Dit resultaat treedt op vanwege de onvoldoende incubatietijd voor GLU om te koppelen aan het APTES-gemodificeerde oppervlak; uiteindelijk is het antilichaam in staat om de resterende APTES-oppervlakken te binden. Met een langere incubatietijd voor GLU heeft deze verbinding de kans om het APTES-oppervlak volledig te bedekken. Deze verzadiging verhoogt de eiwitimmobilisatie op het GLU-oppervlak en verhoogt de gevoeligheid van de test. Bij de HIV-p24-concentratie van 250 nM is er een bijna twee keer zo hoge absorptie bij de incubatie van GLU gedurende de nacht (Fig. 4a).

Optimalisatie van de incubatietijd voor GLU. een Geoptimaliseerd voor een incubatieperiode van 3 h en een incubatie van de nacht met 1% GLU op een 1% APTES-gemodificeerd oppervlak. b Detectie van 125 nM p24 door drie verschillende benaderingen, conventioneel, APTES-GLU-p24 (methode 1) en APTES-GLU-voorgemengde p24 (methode 2)

Vanwege het hogere echte signaal na de nachtelijke incubatie van GLU met de verhoogde absorptie en specifieke detectie van p24, gebruikten we een vergelijkbare voorwaarde voor verdere experimenten. In dit geval hebben we de GLU op het APTES-gemodificeerde oppervlak geïmmobiliseerd en vervolgens het eiwit bevestigd (methode 1). We hebben ook een andere aanpak geprobeerd; eerst hebben we 1% GLU gemengd met 125 nM HIV-p24-antigeen en dit mengsel vervolgens toegevoegd aan het amine-gemodificeerde PS-oppervlak (methode 2). Verrassend genoeg was er een verhoogde absorptie met dezelfde concentratie van HIV-p24-antigeen (van OD 0,161 tot 0,23) als de concentratie die werd gebruikt in methode 2. Toen we het eiwit als premix aan de GLU lieten binden, waren bijna alle eiwitten in staat om de GLU te binden, en vervolgens werd dit mengsel gemakkelijk geadsorbeerd op het met amine gemodificeerde oppervlak. Toen men het eiwit echter liet binden aan het vooraf geïmmobiliseerde GLU-oppervlak, waren de meeste aldehydegroepen van de GLU niet beschikbaar. Figuur 4b geeft aan dat de mengmethode de detectie van een vergelijkbare concentratie (125 nM) HIV-p24-antigeen met een hogere absorptie laat zien. Bovendien vertoonden methoden 1 en 2 een hogere absorptie in vergelijking met de conventionele methode onder dezelfde concentratie van HIV-p24-antigeen.

Na de volledige optimalisatie van de detectiestappen, om de detectielimiet te vinden, hebben we HIV-p24-antigeen getitreerd van picomolair tot nanomolair bereik (500 pM tot 500 nM). We vergeleken drie verschillende methoden, namelijk de conventionele, APTES-GLU-p24 (methode 1:p24 geïmmobiliseerd op APTES gevolgd door GLU-modificatie), en APTES-GLU-voorgemengde HIV-p24 (methode 2:de premix van p24 en GLU gevolgd door immobilisatie op APTES) met dezelfde concentratie p24. Zoals weergegeven in figuur 5, bleek de detectielimiet voor p24 30 nM te zijn voor de conventionele ELISA. In methode 1 werd de detectielimiet acht keer verbeterd (4 nM) vergeleken met de conventionele ELISA. Dit resultaat deed zich voor omdat wanneer we het chemisch gemodificeerde PS-oppervlak gebruikten, de eiwitimmobilisatie stabiel was onder de uniforme opstelling en de immobilisatiesnelheid ook vrij hoog was in vergelijking met de conventionele adsorptie van eiwitten op het ELISA-oppervlak. Vasist et al. [12] toonde al aan dat de hogere immobilisatie van een antilichaam op het APTES-gemodificeerde ELISA-oppervlak geassocieerd was met een dramatisch verbeterd detectieniveau in vergelijking met conventionele ELISA [12]. In hun werk kan het amine in APTES carboxylgroepen op het antilichaam binden en op die manier immobiliseerden ze het antilichaam chemisch op het ELISA-oppervlak. Met deze methode kunnen we de antilichamen op het ELISA-oppervlak alleen immobiliseren via de carboxylgroepen, maar op eiwit gebaseerde antigeenimmobilisatie is niet mogelijk op APTES. Voor dat doel hebben we de GLU-linker geïntroduceerd om het eiwit op het ELISA PS-oppervlak te immobiliseren. Met deze chemische linkers werd niet alleen eiwit, maar ook een antilichaam chemisch gekoppeld door middel van aminekoppeling aan het aldehyde op het glutaaraldehyde. De niet-specifieke aanhechting van biomoleculen op het ELISA-substraat werd gevolgd met behulp van de controle-experimenten. Een controle-experiment werd uitgevoerd zonder het doelmolecuul (HIV-p24). Zonder het doelwit kan het specifieke antilichaam voor p24 niet aan het oppervlak binden, en dus wordt het enzym-geconjugeerde secundaire antilichaam ook niet op het ELISA-oppervlak geïmmobiliseerd. In dit geval, toen we het substraat (TMB) toevoegden, konden we geen veranderingen in de absorptie vinden.

Aantoonbaarheidsgrens voor het HIV-p24-antigeen. De p24 werd getitreerd van 0,5 tot 500 nM. Er werden drie verschillende benaderingen gevolgd, conventioneel en methode 1 en 2

Om de detectielimiet te verbeteren, probeerden we GLU en het HIV-p24-antigeen voor te mengen vóór de immobilisatiestap op het APTES-gemodificeerde oppervlak. Er werd verwacht dat het voormengsel van GLU en HIV-p24-antigeen zou verbeteren met de grotere immobilisatie van eiwitten op het ELISA-oppervlak. Wanneer we GLU vooraf mengen met het HIV-p24-antigeen, is de bindingsverhouding van aldehyde tot GLU hoog. Wanneer we dit mengsel aan het ELISA-oppervlak toevoegen, verbetert het de immobilisatiesnelheid. Dixit et al. ontdekten dat wanneer ze het antilichaam en APTES vooraf mengden vóór immobilisatie op de ELISA-plaat, hun aanpak de immobilisatie van het antilichaam op het ELISA-oppervlak verbeterde en de detectielimiet werd verhoogd [12]. In onze studie, zoals verwacht, toen we het GLU en HIV-p24-antigeen voor immobilisatie voormengden, was de detectielimiet verbeterd tot 1 nM en was 30 keer hoger dan die van de conventionele ELISA, die een detectielimiet van 30 liet zien. nM. Onze strategie had niet alleen een verbeterde detectielimiet, maar verbeterde ook de absorptie voor alle concentraties van HIV-p24-antigeen. Bij 250 nM p24 zagen we dat de absorptie 0,35 was, wat bijna het dubbele is van die van de conventionele ELISA met dezelfde concentratie van HIV-p24-antigeen. Bij alle HIV-p24-antigeenconcentraties werd een groot verschil in absorptie opgemerkt in vergelijking met de conventionele ELISA (Fig. 5), zoals blijkt uit de betrouwbare detectie van het HIV-p24-antigeen.

Om de specificiteit van de test te evalueren, hebben we de test uitgevoerd met twee verschillende controle-experimenten. We kozen humaan serum en HIV-TAT en vermengden ons met GLU in plaats van HIV-p24-antigeen vóór gebruik, en we evalueerden hun specificiteit. Zoals getoond in Fig. 6, is er in het geval van humaan serum en HIV-TAT geen significante absorptie; 250 nM HIV-p24-antigeen vertoonde echter een duidelijke toename in absorptie. Dit resultaat bevestigt de specifieke detectie van het HIV-p24-antigeen op het chemisch gemodificeerde ELISA-oppervlak met een hogere gevoeligheid.

Specifieke detectie van het HIV-p24-antigeen. In plaats van HIV-p24 werden het humane serum en HIV-TAT-eiwit gebruikt om de specificiteit te controleren

Conclusies

Een hogere en juiste immobilisatie van een eiwit of antilichaam op het ELISA-oppervlak verbetert de detectielimiet aanzienlijk. Hier hebben we een interessante chemische functionaliseringsmethode geïntroduceerd om de hoeveelheid eiwit of antilichaam die bindt op het ELISA PS-oppervlak te immobiliseren, geholpen door APTES en GLU. Om detectie aan te tonen, gebruikten we het p24-antigeen van HIV. De detectielimiet was 30 keer verbeterd in vergelijking met conventionele ELISA. Verdere ontwikkelingen van het huidige onderzoek zouden kunnen leiden tot vergelijkbare op chemicaliën gebaseerde verbeteringen op andere detectieoppervlakken en zouden nuttig zijn voor het detecteren van verschillende antigenen met een lagere abundantie, wat een vooruitgang zou betekenen in medische diagnoses.

Afkortingen

APTES:: 3-(Aminopropyl)triethoxysilaan
BSA:: Bovine serum albumine
COOH:: Carboxyl
ELISA:: Enzym-linked immunosorbent assay
Fc:: Fragment kristalliseerbaar
GLU:: Glutaaraldehyde
HIV:: Humaan immunodeficiëntievirus
HRP:: Mierikswortelperoxidase
IgG:: Immunoglobuline
OD:: Eén optische dichtheid
PEG:: Polyethyleenglycol
PS:: Polystyreen
PVLA:: Polyvinylbenzyllactonoylamide
TMB:: 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine

Een zeer nanoporeuze, met stikstof gedoteerde koolstofmicrovezel afgeleid van Bioresource als een nieuw soort ORR-elektrokatalysator De invloed van materialen, heterostructuur en oriëntatie voor nanohybriden op fotokatalytische activiteit

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal