Ligand-gedopte koperoxohydroxide nanodeeltjes: effectieve antimicrobiële strategie

Samenvatting

Bacteriële resistentie tegen antimicrobiële therapieën is een toenemend klinisch probleem. Dit geldt zoveel voor topische toepassingen als voor systemische therapie. Topisch kunnen koperionen effectieve en goedkope antimicrobiële middelen zijn die via meerdere paden werken, waardoor kansen voor bacteriën om resistentie te ontwikkelen beperkt worden. De chemie van koper leent zich echter niet voor eenvoudige formuleringen die gemakkelijk koperionen vrijgeven bij biologisch compatibele pH-waarden. Hier hebben we nanopartikulair koperhydroxide-adipaat-tartraat (CHAT) ontwikkeld als een goedkoop, veilig en gemakkelijk te synthetiseren materiaal dat antimicrobiële koperionvrijgave in een geïnfecteerde wondomgeving mogelijk maakt.

Eerst synthetiseerden we CHAT en toonden aan dat dit gedispergeerde geaquate deeltjesgroottes van 2–5 nm had en een gemiddelde zetapotentiaal van –40 mV. Vervolgens, wanneer gedilueerd in bacteriële medium, toonde CHAT vergelijkbare effectiviteit als koperchloride tegen Escherichia coli en Staphylococcus aureus, met dosis-afhankelijke activiteit voornamelijk rond 12,5–50 mg/L koper. Op deze niveaus loste CHAT zeer snel op en, bevestigd door een bacteriële koper-biosensor, toonde identieke intracellulaire lading als koperionen afgeleid van koperchloride. Echter, wanneer geformuleerd bij 250 mg/L in een topisch toegepaste matrix, namelijk hydroxyethylcellulose, was het voordeel van CHAT boven koperchloride duidelijk. Het eerstgenoemde leverde snelle, continue vrijgave van koper binnen het bactericide bereik, maar koperchloride, dat onoplosbare neerslagen vormde bij dergelijke concentratie en pH, bereikte een maximale vrijgave van 10 ± 7 mg/L koper na 24 u.

We bieden een praktische formulering voor topische koper-gebaseerde antimicrobiële therapie. Verdere studies, met name in vivo, zijn gewenst.

Achtergrond

Microbiële infecties dragen bij aan miljoenen doden wereldwijd [1]. Vaak is de onwirksamheid van een antimicrobiële behandeling te wijten aan microbiële resistentie tegen conventionele antibiotica [2,3,4,5]. Als zodanig worden nieuwe antimicrobiële middelen met grote verlangd. Koper is al lang erkend voor zijn antimicrobiële effecten en kan het potentieel hebben voor grotere klinische levensduur dan standaardantibiotica, aangezien het lijkt te handelen via een veelheid van mechanismen tegen bacteriën, inclusief interactie met bacteriële eiwritten en DNA, productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), en ontwrichting van membraanintegriteit [6, 7]. Om dezelfde reden wordt voorgesteld dat de potentieel voor antimicrobiële resistentie van pathogene bacteriestammen tegen koper en andere metalen beperkt is [7,8,9]. Bovendien is koper relatief goedkoop en van lage toxiciteit voor mensen, aangezien de essentialiteit op spore niveaus de evolutie van strakke homeostatische controle heeft gegarandeerd [10,11,12]. Er is dus algemeen gebruik van dit metaal voor preventieve infectiemaatregelen, meestal om bacteriële biofilvorming op oppervlakken in hoog-risico-gebieden zoals ziekenhuizen en verpleeghuizen te voorkomen [13, 14]. In tegenstelling tot zilver, wat wijd wordt ingezet, heeft koper geen significatief therapeutisch gebruik gevonden in topische antimicrobiële formuleringen [15].

Bacteriën zijn gevoelig voor koperlading in hun intracellulaire omgeving, en de effectiviteit van een koperbron is gerelateerd aan haar vermogen om koperionen vrij te geven [16, 17]. In dit opzicht is een significante uitdaging voor koper-gebaseerde antimicrobiële middelen het bereiken van een geconcentreerde formulering die continue vrijgave van antimicrobiële koper bij effectieve concentraties in vloeistoffen zoals wond-exsudaat toestaat. Dit is omdat koper een hydrolytisch metaalion is en naarmate de concentratie toeneemt bij de pH van typische topische formuleringen (namelijk nabij neutraal), neigt het tot hydrolyse en vorming van onoplosbare oxo-hydroxiden [18]. Bij fysiologische pH-waarden zijn deze oxo-hydroxiden geen goede substraten voor de vrijgave van oplosbare of, daardoor, potentieel effectieve koperionen [16, 19, 20].

Recent, met het doel een biobeschikbaar ijzer-supplement te vinden, werd het probleem van effectieve vrijgave van ferrische ionen uit een geconcentreerde oxo-hydroxide bron onder fysiologische omstandigheden opgelost door structurele modificatie van de primaire deeltjes. In dat werk werd ijzer geprecipiteerd in aanwezigheid van kristal-dopende GRAS-liganden, namelijk adipezuur en tartraat, om de uiteindelijke ferrische oxo-hydroxide structuur opzettelijk te destabiliseren. Deze strategie had het voordeel van (a) het voorkomen van irreversibele agglomeratie van de ferrische oxo-hydroxide deeltjes en (b) het aanzienlijk verhogen van hun labiliteit (gemak van oplosbaarheid) onder geschikte fysiologische omstandigheden. Dit materiaal is genaamd "ijzer [oxo-]hydroxide adipaat tartraat" of IHAT [21, 22]. Door analogie overwogen we hier of koper [oxo-]hydroxide adipaat tartraat (CHAT) gesynthetiseerd en geformuleerd kon worden bij hoge concentraties, maar nog steeds koperionen vrijgaf bij effectieve antimicrobiële niveaus. In het bijzonder was het doel van dit werk om een goedkope en schaalbare synthetische procedure te ontwikkelen die koperoxohydroxide nanodeeltjes produceert die, in tegenstelling tot eerder gerapporteerde materialen, gemakkelijk biocide concentraties koperionen zouden vrijgeven in een gesimuleerde wondomgeving.

Dus, in deze studie synthetiseerden we CHAT en karakteriseerden zijn vermogen om biobeschikbare koper te leveren en, dus, antimicrobiële activiteit te demonstreren. We hebben ons geconcentreerd op stammen van Escherichia coli als "indicator" soort voor gram-negatieve bacteriën [19, 23], maar hebben additioneel proof-of-principle effecten gedemonstreerd tegen Staphylococcus aureus, als gram-positieve bacteriën die vaak multidrug-resistentie verkrijgen. Dus, de studie had als doel de waarde van verdere ontwikkeling van CHAT voor klinische toepassingen in topische antimicrobiële therapie te beoordelen.

Methoden

Tenzij anders vermeld, werden alle experimenten uitgevoerd met ultra-hoge zuiverheid (UHP) water (omgekeerde osmose zuivering; 18,2 ΩM/cm), bij kamertemperatuur (20 ± 2 °C), en alle reagentia werden gekocht van Sigma Aldrich.

Koperformuleringen en CHAT-nanodeeltjes

Koperchloride voorraden (40 mM koper) werden bereid door CuCl₂·2H₂O op te lossen in water. Koperoxide nanodeeltjes (CuO NPs; Sigma 544868) voorraden werden bereid van een commercieel poeder dat vrij was van verontreinigingen, een primaire deeltjesgrootte van 34 nm (bereik 10–50 nm) had, en eerder getest was als antimicrobieel middel [24,25,26]. Deze voorraden werden bereid bij 1,3 g/L koper door het poeder in water te disperseren met vigoreuze agitatie. Colloïdale suspensies van CHAT-nanodeeltjes werden gesynthetiseerd met een co-precipitatie-methode [27]. Kortweg, koperchloride, tartraat en adipezuur werden opgelost in water om een molaire verhouding van koper/tartraat/adipaat in de uiteindelijke suspensie van 2:1:1 en een koperconcentratie van 2,5 g/L te bereiken. De initiële pH van het mengsel was altijd onder 2,5, en de koper was volledig opgelost. De pH werd dan langzaam verhoogd door druppelwijze toevoeging van een geconcentreerde oplossing van NaOH (5 M) met constante agitatie tot pH 8,2 ± 0,2.

Koperinhoud en faseverdeling van CHAT-suspensies

Koperinhoud in colloïdale suspensies werd bepaald door inductief gekoppelde plasma-optische emissiespectrometrie (ICP-OES, Jobin Yvon 2000, Horiba). Alle monsters werden gedilueerd tot concentraties onder 100 mg/L in 5% HNO₃ (v/v) ten minste 24 u voor analyse om volledige oplosbaarheid van koper te garanderen. Kalibratie-standaarden (0,1 tot 100 mg/L koper) waren matrix-gematched in 5% HNO₃, en koperkwantificering werd uitgevoerd bij 324,754 nm. Fractionering van koper in percentages geagglomereerde, nanodeeltjes-achtige en oplosbare koper werd bereikt door filtraties en ultrafiltratie van CHAT-voorraden. Suspensies werden gefiltreerd (200 nm afsnij), en het retentaat werd beschouwd als de geagglomereerde fractie. Om het oplosbare koper te isoleren en te onderscheiden van nanodeeltjes-achtig koper, werd de colloïdale suspensie geultrafiltreerd door een 3-KDa filter (Sartorius Vivaspin 500 VS0192; 16.000×g, 5 min) aangezien dit correspondeert met een afsnij onder 1 nm (Zetasizer Software 7.11, Malvern Instruments Ltd). De koperinhoud van alle fracties (totaal, 200 nm filtraat, 3 KDa ultrafiltrat) werd bepaald door ICP-OES, en fracties uitgedrukt als percentage in relatie tot totale koperinhoud zijn als volgt:

$$ {\displaystyle \begin{array}{l}\%\mathrm{Oplosbare}\ \mathrm{Koper}\ \left(<1\mathrm{nm}\right)\%\kern0.5em =\frac{\kern0.5em {Cu}_{3\mathrm{KDa}}}{Cu_{\mathrm{Totaal}}}\times 100\\ {}\%\mathrm{Geagglomereerde}\ \mathrm{Koper}=\frac{\ {Cu}_{\mathrm{Totaal}}-{Cu}_{<200\mathrm{nm}}\kern0.5em }{Cu_{\mathrm{Totaal}}}\kern0.5em \times 100\\ {}\%\mathrm{Nanodeeltjes}\kern0.5em \mathrm{Koper}\kern0.5em =100-\%\mathrm{Geagglomereerde}\ \mathrm{koper}-\%\mathrm{Oplosbare}\ \mathrm{koper}\end{array}} $$

Bepaling van koperinhoud en koper-tot-ligand verhoudingen in droge CHAT-nanodeeltjes

CHAT-nanodeeltjes werden geagglomereerd en geprecipiteerd om herwinning en verwijdering van ongebonden componenten mogelijk te maken. Hiervoor werd ethanol toegevoegd aan colloïdale suspensies van CHAT (2,5 g/L koper) in een verhouding van 2:1 ethanol/suspensie (v/v), en de resulterende CHAT-agglomeraten werden herwonnen door centrifugatie (4500×g × 15 min in een Mistral 6000). De oplossingsfase, ongebonden liganden bevattend, werd verworven. Bepaling van koperinhoud in vast-fase CHAT was als volgt. Een poeder werd geproduceerd door de ethanolische geprecipiteerde pellet te drogen in de oven tot constant gewicht bij 45 °C. Dit werd gemalen en 35,2 ± 0,3 mg (n = 2) werd verteerd in 11 ± 1 g van 70% HNO₃, met nauwkeurige gewichten geregistreerd. Eenmaal volledig verteerd, werd deze oplossing 20-voudig in water gedilueerd en de koperconcentratie bepaald door ICP-OES. Ligand-tot-koper verhoudingen werden direct bepaald uit gedroogde, ethanol-geprecipiteerde CHAT-agglomeraten. De agglomeraten werden eerst hersuspendeerd in water tot hun oorspronkelijke volume om oplossing te vergemakkelijken met lagere hoeveelheden HCl – een vereiste voor hoge-prestatie vloeistof-chromatografie (HPLC) analyse. Aliquoten werden of opgelost in 5% HNO₃ voor ICP-OES analyse van koper (zoals hierboven beschreven) of in 80 mM HCl voor HPLC-analyse van liganden (tartraat en adipezuur). Ligandanalyse werd uitgevoerd in een standaard omgekeerde-fase chromatografiesysteem (C18 kolom in een Waters Alliance 2690/5 uitgerust met een 2998 PDA detector; verdere details in Aanvullend bestand 1).

Fysicochemische karakterisering van CHAT-suspensies

Hydrodynamische deeltjesgrootteverdeling werd bepaald door dynamische lichtverstrooiing (DLS; Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd). Aliquoten van CHAT-colloïdale suspensies (2,5 g/L koper) werden overgebracht naar een 1-mL wegwerp-kwet, en metingen (n = 3) werden uitgevoerd bij 25 ± 2 °C. De zetapotentiaal van CHAT-suspensies werd bepaald door laser-Doppler micro-elektroforese (Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd) met wegwerp vouwcapillaircellen (DTS1070) en aannemende een diëlektrische constante van 78,5 en een viscositeit van 0,89 cP. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) karakterisering werd uitgevoerd door een druppel CHAT-suspensie op holle koolstof-perforeerde grids aan te brengen en te drogen bij 50 °C overnacht. Grids werden vervolgens geïmageerd op de TEM (FEI-Philips CM100) bij 120 kV in heldere-veld-modus.

Antimicrobiële activiteit van koperformuleringen

Assays werden uitgevoerd in zwaar metaal MOPS (HMM) medium, een erkend metaalion-compatibel medium (Aanvullend bestand 3), aangevuld met 0,4% glucose en 0,1% caseïnezuurhydrolysaat, en pH aangepast tot 7,2 ± 0,2 [28]. Voor de toevoeging van koperverbindingen, werden Escherichia coli (NCTC11100) en Staphylococcus aureus RN4220 [29] overnacht gekweekt bij 30 °C onder constant schudden in een Infors HT Minitron incubator bij 80 rpm. Daarna werden de bacteriële suspensies gedilueerd tot een optische dichtheid van 0,05–0,1 (ca. 10⁶ cellen/mL) bij 595 nm voor E. coli (Multiskan RC 351 Labsystem) of 600 nm voor S. aureus (Multiskan plaatlezer, ThermoFisher Scientific). Vervolgens werden voorraden koperchloride en colloïdaal CHAT gedilueerd in HMM en toegevoegd aan de bacteriële suspensies om finale koperconcentraties tussen 0,4 en 100 mg/L te verkrijgen. Incubatie vond plaats voor een periode van 6 tot 9 u, en bacteriële groei werd bepaald door optische dichtheid te monitoren als maat voor bacteriële biomassa.

Koperoplosbaarheid over tijd in bacteriële groeimedium werd bepaald door koperchloride en colloïdaal CHAT voorraden in HMM te dilueren tot 12,5, 25 en 50 mg/L koper en de fractie oplosbare koper te bepalen op 0, 2, 4 en 8 u door ultrafiltratie (3 KDa) en ICP-OES-analyse, zoals hierboven beschreven.

Intracellulaire biobeschikbaarheid van koperformuleringen

Recombinante bioluminescente Cu-sensorende bacteriën, E. coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), die reageren op sub-toxische hoeveelheden biobeschikbare koper door hun bioluminescentie te verhogen, werden gebruikt om de biobeschikbaarheid van koperverbindingen te kwantificeren [30]. Bacteriële suspensies werden bereid zoals beschreven voor de antimicrobiële activiteitsassay en geïnculeerd met een reeks verdunningen van koperchloride en CHAT (0 tot 50 mg/L koper) op 96-put microplaten gedurende 4 u. Bioluminescentie werd gemeten met een Orion II Plaatluminometer (Berthold Detection Systems), en inductie van bioluminescentie werd berekend als volgt:

$$ Bioluminescentie\ inductie, Vouw\ Wijziging=\frac{ Bioluminescentie\ in\ Cu\ blootstelling}{Bioluminescentie\ zonder\ Cu\ } $$

Intracellulaire stress geïnduceerd door koperformuleringen

Het vermogen van koperverbindingen om intracellulaire superoxide-anionen en enkelstreng-DNA-breuken te induceren, werd beoordeeld met recombinante bioluminescente bacteriën, E. coli K12::soxRSsodAlux en E. coli MC1061 (pDEWrecAlux), respectievelijk [17]. Bacteriële cultures werden bereid zoals beschreven voor de antimicrobiële assay, en bacteriën werden blootgesteld aan een reeks verdunningen van koperchloride en CHAT (0 tot 50 mg/L koper) op witte 96-put microplaten over 4 u. De biosensoren' prestaties werden gecontroleerd door bacteriën te blootstellen aan het superoxide-anion-inducerende chemisch menadione (0,04–30 μg/L), of waterstofperoxide (0,1–150 mg/L), als positieve controles voor E. coli K12::soxRSsodAlux of E. coli MC1061 (pDEWrecAlux), respectievelijk. Opnieuw werden bacteriën geïnculeerd op witte 96-put microplaten en bioluminescentie gemeten met een Orion II Plaatluminometer en inductie van bioluminescentie berekend als in Eq. 5.

Incorporatie van koperformuleringen in hydroxyethylcellulose-gelen

Voorraden koperchloride, CHAT en commerciële, ongemodificeerde koperoxide nanodeeltjes (CuO NPs) werden gedilueerd in UHP-water tot 250 mg/L koper. De resulterende suspensies van CHAT en CuO NPs waren bij nabij-neutrale pH en konden direct in het gel geïncorporeerd worden, maar koperchloride-oplossing was nog zuur na dilutie en werd daarom aangepast tot pH 7,0 ± 0,2. Hydroxyethylcellulose (HEC) werd vervolgens direct (2% w/v) opgelost in de diverse gedilueerde voorraden met een rolmixer (Denley Spiramix 5) tot homogene gelen gevormd waren. Tien gram van elk gel werd overgebracht in Falcon-buizen en overnachten laten zetten. Vervolgens werd 10 mL vers bereide 50 mM natriumbicarbonaat-buffer (opgelost uit NaHCO₃-poeder en aangepast tot pH 7,0 ± 0,2) in elke buis overgebracht met zorg om storingen aan de gel-vloeistof-interface te minimaliseren (specifieke oppervlakte van 7,1 cm²). Aliquoten werden vervolgens verzameld en geanalyseerd door ICP-OES om koper-vrijgave over tijd te bepalen.

Resultaten

Zoals beschreven in de "Methoden" sectie, werd CHAT gesynthetiseerd op een vergelijkbare manier als het ijzer-analogon, IHAT [21, 22], door koperoxohydroxide (2,5 g/L koper) te doppen met tartraat- en adipezuur. Dit produceerde stabiele colloïdale suspensies waarin alle koper door een 200-nm filter ging maar heel weinig (5%) een 3-KDa filter passeerde. Dit wijst erop dat de meeste koper nanodeeltjes-achtig was (95%; Fig. 1a) met weinig "vrije" koper en geen detecteerbare grote agglomeraten – weer zoals het IHAT-analogon [21, 22]. Wanneer geprecipiteerd in ethanol, om ongebonden liganden te verwijderen, en daarna gedroogd, bevatte CHAT 31 ± 1% koper (w/w) volgens ICP-OES-analyse. Koper-tot-ligand molaire verhoudingen, het laatste bepaald door HPLC, waren 2:1 voor koper tot tartraat en 2:0,3 voor koper tot adipaat. CHAT-deeltjes leken bijna monodisperse met diameters van 2–3 nm door TEM-imaging (Fig. 1b). Deze bevindingen waren consistent met hydrodynamische dimensioneringsdata voor CHAT plus een hydratatie-schil, aangezien de mediaan-diameter per volume in UHP-water 3,4 nm was (Fig. 1c) en de grootteverdeling smal was (2,4–5,6 nm voor 80% van het volume) toen beoordeeld met dynamische lichtverstrooiing. De gemiddelde zetapotentiaal was –39 mV (Fig. 1d), consistent met nanodeeltjes die een stabiele geaquate dispersie vormen [27], en inderdaad werd de CHAT-voorraadsuspensie getoond als stabiel voor diverse jaren (Aanvullend bestand 4).

Vervolgens keken we naar de antimicrobiële activiteit van CHAT toen voorraadsuspensies gedilueerd werden in bacteriële groeimedia tot concentraties geassocieerd met de antimicrobiële activiteit van koperzouten. Voor CHAT en koperchloride was de groeiremmingscurve erg vergelijkbaar voor zowel E. coli als S. aureus met de meeste activiteit optredend bij totale koperconcentraties tussen de 12,5 en 50 mg/L bereik (Fig. 2). Complete E. coli groeiremming werd waargenomen na incubatie met 18,8 (CuCl₂) en 25 (CHAT) mg/L koper, terwijl voor S. aureus volledige groeiremming verkregen werd bij 75 (CuCl₂) en 100 (CHAT) mg/L koper (Fig. 2; Percentage groeiremming vs koperconcentratie is verstrekt in Aanvullend bestand 5).

Inderdaad, bij deze antimicrobiële concentraties, was ten minste 94% van CHAT snel opgelost (binnen 15 min), weer beoordeeld door ultrafiltratie en ICP-OES-analyse (Fig. 3a). We verwachtten daarom dat de antimicrobiële effectiviteit van CHAT gekoppeld was aan deze chemische labiliteit, met snelle oplossing van de nanodeeltjes waardoor intracellulaire bacteriële opname van koperionen mogelijk was. Om dit te testen, daagden we de Cu-senserende E. coli, MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), uit, waarin bioluminescentie toeneemt in reactie op sub-toxische concentraties intracellulaire koperionen [30], met 0 tot 50 mg/L koper als CHAT of koperchloride. Stijgende concentraties in het kweekmedium van beide koperbronnen leidden tot stijgende bioluminescentie in de E. coli koper-sensorstam (Fig. 3b), consistent met stijgende intracellulaire koper. De helling van de dosis-responscurve was identiek tot 6,25 mg/L voor beide koperbronnen, wat bevestigt dat biobeschikbare koper uit CHAT vergelijkbaar was met een volledig opgeloste bron. Daarna, bij concentraties tot 50 mg/L koper, nam de luminescentie niet toe door de toxiciteit van beide koperverbindingen (Fig. 3b).

Parallel aan het bestuderen van intracellulaire koper in E. coli blootgesteld aan oplossingen bereid met CHAT of koperchloride, testen we ook het vermogen van deze oplossingen om intracellulaire superoxide-anionen te triggeren of bacteriële DNA-schade te veroorzaken in verschillende E. coli-gebaseerde biosensoren. In geen geval was er een significant waarneembaar effect, ondanks de sensoren reageerden op relevante positieve controles, namelijk waterstofperoxide en menadione, respectievelijk (Fig. 3c, d). Samen genomen steunen de equivalente reacties van de drie bacteriële biosensoren op oplossingen bereid uit verschillende chemische vormen van koper sterk de idee dat, in beide gevallen, bacteriën blootgesteld waren aan hetzelfde oplosbare koper, ondanks dat één formulering begon als nanodeeltjes-achtig.

Ten slotte, zoals hierboven opgemerkt, zou het voordeel van CHAT boven oplosbare koperzouten alleen duidelijk zijn als een geconcentreerde formulering het eerste toestond zijn chemische labiliteit te behouden in tegenstelling tot het laatste. Met hydroxyethylcellulose (HEC), een gangbare waterige basis voor topische formuleringen [31,32,33], incorporeerden we 250 mg/L koper als koperchloride, CHAT of als de commerciële CuO NPs. Toen 10 mL van 50 mM NaHCO₃-buffer, als een vereenvoudigde wond-exsudaat, werden toegevoegd aan 10 g van elk van de koper-geïncorporeerde HEC-gelen (d.w.z. 2,5 mg koper), was er continue vrijgave van koper uit de CHAT-bevattende bereiding, tot meer dan 60 mg/L na 24 u (Fig. 4). Bovendien was vrijgave relatief snel met antimicrobiëel actieve concentraties bereikt door 2–4 u. In tegenstelling, was pH-geneutraliseerde koperchloride een slecht substraat voor koper-vrijgave, zoals verwacht door zijn neiging te hydrolyseren en agglomeraten van koperoxo-hydroxiden te vormen, dus na 24 u was slechts 10 ± 7 mg/L koper in oplossing bereikt (Fig. 4). De commerciële CuO NPs leverden geen detecteerbare koper-vrijgave (Fig. 4).

Discussie

We tonen hier aan dat een koper-gebaseerd nanomateriaal, namelijk CHAT, geformuleerd kan worden bij hoge concentraties, in tegenstelling tot eerdere beschreven koper-gebaseerde nanodeeltjes [34, 35], terwijl het zijn eigenschappen als een labiele bron van biobeschikbare koper met antimicrobiële effectiviteit behoudt. Zoals hierboven opgemerkt, was de synthese van CHAT geïnspireerd na jarenlang eerdere werk op het ijzer-analogon, IHAT [21, 22]. Dit werd op zijn beurt geïnspireerd door natuur's oplossing voor snelle mineraalomzet in vivo, voor de efficiënte hercycling van essentiële metaalionen, waarbij organische moleculen gebruikt worden om de kristalstructuur van primaire mineraaldeeltjes te destabiliseren [21, 22]. In de synthetische versies worden GRAS-liganden geïncorporeerd in metaaloxo-hydroxiden terwijl ze in oplossing vormen uit vernetterende polymeren [21, 22]. Door structurele destabilisatie zorgt dit voor labiliteit van de uiteindelijke mineraalfase en genereert ook hoog-negatieve nanodeeltjes – zoals gedemonstreerd door de zetapotentiaalmeting – die agglomeratie en aggregatie afstoten, wat leidt tot nanodeeltjessuspensies die jarenlang stabiel waren. Hier, en zoals eerder getoond voor IHAT, was tartraat de dominante ligand bij het bereiken van deze fysicochemische veranderingen in de koperoxohydroxidestructuur, aangezien de incorporatie ca. 3-voudig groter was dan die van adipaat – het laatste gedraagt zich meer als een buffer tijdens synthese [21, 22].

In afwezigheid van modificatie, zullen vers geprecipiteerde metaaloxo-hydroxiden agglomereren en aggregeren en zullen beginnen te verouderen, waarbij ze condenseren en geleidelijk hun kristallijnheid verhogen. Deze grootte- en mineraalfase-overgangen verminderen het vermogen van de structuren om deel te nemen aan de omgekeerde reactie, d.w.z. om opnieuw op te lossen. Het was daarom niet verrassend dat wanneer koperoxohydroxide vers gevormd werd, door pH-neutralisatie van een koperchloride-oplossing, ten minste wat oplosbare koper vrijgegeven werd in onze gel-vrijgave-assay (Fig. 4), terwijl voor de commerciële CuO NPs, die geagglomereerd waren en een meer gecondenseerde mineraalfase bezaten (namelijk koperoxide), ondetecteerbare koper vrijgegeven werd. Het ontbreken van oplossing van commerciële 30 nm nanodeeltjes – die, ongeacht hun aggregatietoestand, een groot oppervlak voor oplossing zouden presenteren – toont aan dat mineraalfase een sleutel-drijver is in de vrijgave van koperionen en dat, zoals hierboven opgemerkt, modificatie van de primaire deeltjes van het mineraal, hier bereikt door ligand-doping, echt vereist is om een duidelijke verschuiving in oplossingskenmerken te bewerkstelligen. Verder werd de synthese van CHAT bij kamertemperatuur uitgevoerd, aangezien hoge synthetische temperatuur minder amorfe fasen begunstigt die consequent oplossingssnelheden kunnen verminderen. Ook heeft kamertemperatuur-synthese het voordeel van energiekostenreductie bij productie op schaal.

Hoewel er andere manieren kunnen zijn om hoge, stabiele concentraties koper te formuleren die continue vrijgave en snelle oplossing van ionen mogelijk maken wanneer vereist, kunnen we ons geen andere synthese voorstellen die zo eenvoudig is en de kostprijs van goederen (voor reactanten) zo laag. Dit zijn belangrijke factoren aangezien het probleem van topische infecties en bacteriële resistentie bij lange na niet beperkt is tot ontwikkelde landen. Ontwikkelingslanden worden zunehmend geplaagd door bacteriële resistentieproblemen en dus zijn betaalbare effectieve oplossingen urgent vereist [36, 37]. Hoewel er onvoldoende studies zijn om concrete oplossingen te bereiken, is er bewijs dat resistentie tegen giftige metaalionen moeilijker is voor bacteriën te bereiken dan resistentie tegen conventionele antibiotica [7]. De theorie berust op het idee dat koper en zilver waarschijnlijk geen discrete antimicrobiële activiteitspaden hebben, maar eerder meerdere doelen kunnen beïnvloeden, inclusief diverse enzymsystemen, en dus de algehele bacteriële celstructuur kunnen destabiliseren [17, 19, 38]. Inderdaad is getoond dat bacteriën gevoelig blijven voor koper en bepaalde andere metaalionen ondanks blootstelling over eeuwen [6, 7, 39]. Interessant is er recent bewijs dat metaal-gebaseerde antimicrobiële middelen zelfs bacteriële gevoeligheid voor conventionele antibiotica kunnen herstellen ondanks eerdere resistentie [40, 41].

Conclusies

Hier hebben we gedemonstreerd dat het probleem van biobeschikbare koperionen, bij fysiologische pH-waarden en hoge concentraties, opgelost kan worden door een kopernanomineraal te doppen met organische zuren, in een vergelijkbare strategie als eerder gebruikt voor ijzer-analogen [21, 22]. Deze koper-gebaseerde nanodeeltjes (genaamd CHAT) losten gemakkelijk op in het bacteriële medium, met equivalente intracellulaire koperopname en antibacteriële activiteit als oplosbare koperzouten. Cruciaal is echter dat, in tegenstelling tot eenvoudige koperzouten, CHAT geconcentreerd kan worden in een pH-neutrale formulering en zijn labiliteit behoudt in termen van koperionvrijgave. Inderdaad, CHAT gaf koperionen vrij binnen het bactericide bereik en kan dus de basis vormen voor een nieuw, topisch antimicrobiel middel, alleen of de effectiviteit van resistente antibiotica verbeterend. Met toenemende antibiotica-resistentie zijn nieuwe topische antimicrobiële middelen nodig en CHAT is goedkoop, gemakkelijk te synthetiseren en gebruikt componenten die algemeen erkend zijn als veilig (GRAS). In vivo studies zijn gewenst.

Afkortingen

CHAT:

Koper [oxo]-hydroxide adipaat tartraat nanodeeltjes

CuO NPs:

Koperoxide nanodeeltjes

DLS:

Dynamische lichtverstrooiing

Escherichia coli :

E. coli

GRAS:

Algemeen erkend als veilig

HEC:

Hydroxyethylcellulose

HMM:

Zwaar metaal MOPS medium

HPLC:

Hoge-prestatie vloeistof-chromatografie

ICP-OES:

Inductief gekoppelde plasma-optische emissiespectrometrie

IHAT:

IJzer [oxo]-hydroxide adipaat tartraat nanodeeltjes

MOPS:

3-(N-morpholino) propaanzuur

Staphylococcus aureus :

S. aureus

UHP:

Ultra-hoge zuiverheid