Veiligheidsbeoordeling van Liposomale Nanodragers Intratympanisch Afgeleverd aan het Binnenoor van de Rat

Samenvatting

Liposomale nanodragers (LPNs) bieden hoge medicijnlading en efficiënte opname in het binnenoor na minimaal invasieve intratympanische aflevering. Hun biocompatibiliteit in dit gevoelige orgaan was echter niet systematisch geëvalueerd. In deze studie werden LPNs – met of zonder gadolinium-tetra-azacyclo-dodecaan-tetra-azijnzuur (Gd-DOTA) – transtympanisch geïnjecteerd in Sprague-Dawley ratten. Gadolinium-versterkte magnetische resonantie imaging (Gd-MRI) voldeed LPN-distributie en beoordeelde barrière-integriteit, terwijl auditieve hersenstamresponsen (ABR) de gehoorfuncie maatten. Inflammatoire markers (glycosaminoglycanen, hyaluronzuur, CD44, TLR2) en apoptose (TUNEL) werden gekwantificeerd in cochleaire weefsels. Resultaten toonden efficiënte binnenoor-invang van LPNs zonder verstoring van de midden- of binnenoor-barrières, geen gehoorverlies, en geen verhoging in inflammatoire of apoptotische markers. Dus is transtympanische LPN-aflevering veilig voor de rat cochlea en belooft behandeling van sensorineuraal gehoorverlies.

Achtergrond

LPNs zijn het oudste nanotherapeutische platform in de kliniek, met succes gebruikt voor kanker, infectieziektes, inflammatie en pijn. Hun hoge ladingcapaciteit en bewijzen van opname in het binnenoor maken ze aantrekkelijk voor otologische therapie. Intratympanische toediening is een rationele, gerichte benadering die systemische blootstelling beperkt en al klinisch toegepast wordt voor de ziekte van Menière en plotselinge sensorineurale gehoorverlies. Hoevoorgaand werk peptide-gefunctionaliseerde LPNs aantoonde die de cochlea bereikten, blijft het veiligheidsprofiel van LPNs in het binnenoor – met name met betrekking tot barrière-functie, inflammatie en cellevensvatbaarheid – onbekend. Deze studie vult die kloof door de biocompatibiliteit van LPNs in het rattenbinnenoor te evalueren met behulp van Gd-MRI, ABR en uitgebreide histologische analyses.

Hyaluronzuur (HA) is een belangrijk extracellulaire matrixcomponent dat CD44 en TLR2/4 bindt, wat inflammatoire pathways initieert. Accumulatie van HA is gekoppeld aan verhoogde permeabiliteit en inflammatie in diverse weefsels, inclusief de cochlea, waar zilvernanodeeltjes (AgNPs) eerder HA-ophoping induceerden. Daarom werden HA, CD44, en TLR2 onderzocht als kritische inflammatoire markers in deze studie.

Het doel was te bepalen of transtympanische LPNs de binnenoor-barrière-integriteit aantasten, inflammatie induceren of gehoorverlies veroorzaken. Gd-MRI beoordeelde barrière-functie, ABR meet auditieve drempels, en immunohistochemie kwantificeerde HA, CD44, TLR2, en apoptotische DNA-fragmentatie.

Resultaten

LPNs veroorzaakten geen functionele veranderingen in de rattencochlea

Gd-MRI toonde aan dat LPNs efficiënt de cochlea binnengingen, met sterk signaal in de scala vestibuli en scala tympani binnen 3 uur na injectie (Fig. 2c-f). Na 6 uur werd de signaaldistributie homogeen over de cochlea, wat volledige evenwicht aangeeft (Fig. 2e-f). Bloed-perilymfe en bloed-endolymfe barrière-integriteit bleven intact, zoals weerspiegeld door vergelijkbare signaalintensiteiten tussen behandelde en onbehandelde oren (Tabel 1). ABR-drempels voor klikken en toonbursts (2–32 kHz) toonden geen significante verschuiving op 2, 4, of 7 dagen na injectie, wat bevestigde dat de auditieve functie bewaard bleef (Fig. 3).

LPNs induceerden geen glycosaminoglycaan-accumulatie in de rattencochlea

Periodic acid-Schiff kleuring onthulde geen toename in glycosaminoglycanen over cochleaire structuren (spiraallimbus, botwand, stria vascularis) na LPN of LPN-Gd behandeling vergeleken met gedemineraliseerd water controles (Fig. 5, 6). Kwantificering bevestigde geen statistisch significante verschillen (p > 0,05).

Minder impact op hyaluronzuur-secretie door LPNs

Immunofluorescentie detecteerde HA primair in spiraalgangcellen, stria basale cellen, uiterlijke sulcus cellen, en capillaire endotheele cellen (Fig. 7). Terwijl HA-intensiteit in spiraalligament fibrocellen licht afnam na LPN of LPN-Gd toediening, vertaalde deze verandering zich niet in gewijzigde barrière-permeabiliteit of gehoorverlies (Fig. 8).

CD44 expressie onveranderd na LPN-blootstelling

CD44-positieve cellen waren overvloedig in de stria basale cellaag, spiraalligament, Deiters' cellen, en capillaire endotheele cellen over alle groepen, zonder significante verschillen in kleuringsintensiteit of celtellingen tussen behandelde en controle oren (Fig. 9, 10).

TLR2 expressie onbeïnvloed door LPNs

TLR2 immunreactiviteit was hoog in stria basale cellen, spiraalligament fibrocellen, en endotheele cellen, maar verschilde niet tussen LPN, LPN-Gd, en water-behandelde oren (Fig. 11, 12).

Geen toename in cochleaire apoptose na LPN-toediening

TUNEL-kleuring onthulde zeldzame apoptotische kernen verdeeld door de cochlea in alle groepen, zonder toename in de LPN of LPN-Gd cohorten vergeleken met controles (Fig. 13). De incidentele apoptose waargenomen in de riemvoetplaat en ovale venster nis wordt beschouwd als onderdeel van normale celomzetting.

Discussie

Onze data tonen aan dat intratympanische LPNs het binnenoor efficiënt bereiken, zowel via het ovale als ronde venster, en dit doen zonder de bloed-perilymfe of bloed-endolymfe barrières te compromitteren. Het ontbreken van gehoordrempelverschuivingen en afwezigheid van inflammatoire of apoptotische markers bevestigen dat LPNs goed verdragen worden in de rattencochlea. De geringe reductie in HA-secretie van spiraalligament fibrocellen lijkt klinisch irrelevant, waarschijnlijk reflecterend een verschuiving naar hoog-moleculair-gewicht, anti-inflammatoire HA zonder permeabiliteitsveranderingen te induceren. Deze bevindingen zijn in lijn met eerdere rapportages dat 95-nm LPNs meest efficiënt zijn voor binnenoor-aflevering en dat grotere (110–115 nm) LPNs nog steeds veiligheid behouden.

Belangrijk is dat de studie bevestigt dat LPNs de TLR2/CD44 inflammatoire as niet activeren, een cruciale pathway geïmpliceerd in cochleaire schade door reactieve zuurstofsoorten en mitochondriale toxinen. Daarom vertegenwoordigen LPNs een veilig voertuig voor gerichte medicijnaflevering aan het binnenoor, wat hun potentiële klinische toepassing in sensorineuraal gehoorverlies en andere otologische aandoeningen ondersteunt.

Conclusies

Transtympanische aflevering van liposomale nanodragers is veilig voor het rattenbinnenoor, behoudende barrière-integriteit, auditieve functie, en cellulair evenwicht. LPNs beloven als een medicijnafleveringsplatform voor toekomstige binnenoor-therapieën.

Methoden

Materialen

Lipiden (sphingosine, SOPC, DSPE-PEG-2000), fluorescente kleurstoffen (DiI, TRITC-DHPE), Gd-DOTA (DOTAREM), en zilvernanodeeltjes (AgNPs) werden verkregen van commerciële leveranciers. Lipide zuiverheid werd geverifieerd door dunne-laag chromatografie; concentraties werden gravimetrisch bepaald.

Preparatie en Karakterisering van LPNs

Unilamellaire LPNs (~110 nm) encapsulerend 500 mM Gd-DOTA (LPN-Gd) en lege LPNs (~115 nm) werden geprepareerd door een eerder beschreven dunne-film hydratatie methode (Refs 6, 3). Grootteverdeling en zeta-potentieel werden gemeten door dynamische lichtverstrooiing.

Toediening van LPNs

Onder isofluraan anesthesie werd 50 µl van LPN of LPN-Gd transtympanisch geïnjecteerd in het linker middenoor via een operatiemicroskoop. Het controlaterale oor ontving gedemineraliseerd water als negatieve controle. Dieren werden gepositioneerd met het geïnjecteerde oor omhoog voor 15 min na injectie.

Evaluatie van Biologische Barrière-functie met Gd-MRI

Gd-MRI werd uitgevoerd op een 4,7 T Bruker scanner met een RARE protocol. Contrast werd intraveneus 2 uur voor imaging toegediend. Imaging tijdspunten varieerden van 5 uur tot 8 dagen na injectie om acute en sub-acute veranderingen vast te leggen.

Auditieve Hersenstamrespons (ABR)

ABR-drempels voor klikken en toonbursts (2–32 kHz) werden vastgelegd bij baseline, 2, 4, en 7 dagen na injectie met behulp van een standaard elektrode-montage en geluiddempende kamer.

Histologische en Immunofluorescentie Analyses

Na de laatste ABR werden cochleae geoogst, gedecalcifieerd, en gesectioneerd. Hematoxyline-eosine en periodic acid-Schiff kleuringen beoordeelden inflammatie en glycosaminoglycaan gehalte. Immunofluorescentie voor HA, CD44, en TLR2 werd uitgevoerd op cryosecties, en confocale imaging kwantificeerde signaalintensiteiten. Apoptose werd gedetecteerd door TUNEL-kleuring.

Statistische Analyse

Data werden geanalyseerd met SPSS 20. Eénrichtings ANOVA en Kruskal-Wallis toetsen vergelijken ABR verschuivingen en kleuringsintensiteiten; post-hoc LSD toetsen volgden significante bevindingen. p < 0,05 werd als significant beschouwd.

Afkortingen

ABR

Auditieve hersenstamrespons

AgNPs

Zilvernanodeeltjes

dH2O

Gedemineraliseerd water

Gd-DOTA

Gadolinium-tetra-azacyclo-dodecaan-tetra-azijnzuur (DOTAREM)

Gd-MRI

Gadolinium-versterkte magnetische resonantie imaging

LPN

Liposomale nanodrager

LPN-Gd

Gd-DOTA-bevattende LPN

ROI

Regio van interesse

TLR

Toll-achtige receptor